煙草青枯病發(fā)生與根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征關(guān)聯(lián)分析

引用格式：，等.煙草青枯病發(fā)生與根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征關(guān)聯(lián)分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025（5）：54-62

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.005.011

中圖分類號(hào)：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2025）05-0054-09

Abstract：Thissdyimstoinvestigateteasociationbetweentobaccobacterialwiltseverityndrzosphremicrobialcounity structure.Tobacco plants with different disease indexes wereused as materials，and high-throughput sequencing was performed torevealtherhizosphere microbialcommunitystructure.Theresultsshowedthat increase intheseverityof tobacco bacterialwilt mildlyaffectedthebacterialphylaandgenerabutsignificantlyaffectedtheabundanceofvarious groupsofbacteria.Atthe phylum level，thediseaseseverityhadthe mostsignificantefectsonActinobacteriaandFmicutes，decreasingtheirrelativeabundnce by 16.04% and 12.68% ，respectively，while increasing the abundance of Bacteroidetes by 20.41% .At the genus level， the abundance of Burkholderceeatofccilo severityof thediseaseenhanced.Theresultsofalphaandbeta diversityanalysesshowed thattheincidenceoftobacco bacterial wilt increased the number and communitystructure diversity of rhizosphere bacteria.

Keywords：tobacco bacterial wilt; rhizosphere bacterial diversity; community characteristics

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一種毀滅性土傳細(xì)菌病害，給我國煙葉生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。眾所周知，青枯菌的宿主范圍很廣，可以感染50多個(gè)科數(shù)的百種植物，包括許多重要經(jīng)濟(jì)作物，如番茄、馬鈴薯和香蕉。這種細(xì)菌能夠定殖宿主植物的木質(zhì)部導(dǎo)管，導(dǎo)致植物枯萎并死亡。這種病害通過受污染的土壤、水、幼苗和植物碎片傳播。有效的控制措施包括使用抗病品種、無毒種子、輪作和銷毀受感染的植物等。細(xì)菌通過根部進(jìn)入植物，傳播到木質(zhì)部導(dǎo)管，擾亂水和營養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)，導(dǎo)致枯萎和死亡[2-4]。青枯病會(huì)降低土壤的肥力和有機(jī)質(zhì)，減少有益微生物的數(shù)量，從而對(duì)土壤質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，隨著時(shí)間的推移，這可能會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降和土壤健康狀況下降。青枯病會(huì)對(duì)其他土壤微生物產(chǎn)生負(fù)面影響。如果病原體在土壤中迅速傳播，損傷植株，可供其他微生物分解的有機(jī)物減少，這可能會(huì)導(dǎo)致土壤微生物的多樣性和豐度下降，最終影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并影響?zhàn)B分循環(huán)和植物生長[14]。

青枯病發(fā)病指數(shù)與其他土壤微生物之間的關(guān)聯(lián)是復(fù)雜的，取決于土壤類型、氣候和農(nóng)業(yè)實(shí)踐等多種因素[5-7]。宿主根部其他細(xì)菌物種的生態(tài)位空間可能會(huì)因共存于同一環(huán)境中，爭(zhēng)奪資源或相互依賴生存的細(xì)菌之間的相互作用而變化。人們可利用微生物之間的這種競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行生物防控[8-9]。當(dāng)前，從土壤或植物根際分離的有益細(xì)菌為農(nóng)作物病害的生物防治提供了大部分菌株來源。使用專門的拮抗細(xì)菌，如芽孢桿菌，通過產(chǎn)生抗菌代謝物來誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)病原體的系統(tǒng)性抗性是一種常用的方法[10-12]。因此，目前研究的一個(gè)熱門領(lǐng)域是尋找對(duì)煙草青枯病有抑制作用的細(xì)菌群落。研究表明，青枯菌可以與土壤中的其他病原菌共存。例如，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌經(jīng)常與辣椒根際的丁香假單胞菌和野油菜黃單胞菌等其他植物病原菌共分離[12-14]。然而，目前對(duì)于煙草青枯病不同發(fā)病程度煙株根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和分子特征的變化信息的理解仍然有限。通過研究煙草青枯病發(fā)生程度對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，可以深入理解不同病害程度下微生物群落的組成、多樣性和功能變化，進(jìn)而揭示病害發(fā)生的微生物學(xué)機(jī)制，從而為煙草青枯病的防治提供新的策略和方法。通過優(yōu)化根際微生物群落結(jié)構(gòu)，可以提高煙草植株的抗逆性和適應(yīng)性，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和競(jìng)爭(zhēng)力，保障煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

在永州市共取樣12個(gè)地點(diǎn)，其中江永縣、新田縣、江華縣和寧遠(yuǎn)縣各3個(gè)地點(diǎn)。每個(gè)地點(diǎn)在有青枯病發(fā)生的煙田選擇健康煙株（病指 =0 ）、輕度發(fā)?。ú≈?⁼¹ ）中度發(fā)病株（病指 =5 ）和重度發(fā)病株（病指 =9 ）各3株，取根際土壤樣品，即挖出整株煙株，清理掉主體根周圍土壤，采用抖根法收集須狀根 2mm 范圍內(nèi)的土壤，將土樣混合后編號(hào)，用自封袋裝好，保存于便攜式冰盒中， 72h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。取樣點(diǎn)土壤類型和耕作制度在當(dāng)?shù)鼐哂写硇浴?/p>

以采樣地點(diǎn)縣級(jí)名稱拼音的首字母作為樣品編號(hào)的前兩個(gè)字母，未發(fā)病煙株樣品加“_Control”，發(fā)病樣品加“RS”，以樣品發(fā)病級(jí)數(shù)（阿拉伯?dāng)?shù)字）為樣品編號(hào)的最后一位，測(cè)序時(shí)3個(gè)點(diǎn)的樣品名稱分別加“_J”“_N”“_X”，具體編號(hào)情況見表1。

1.2土壤總DNA提取和16rRNA基因擴(kuò)增

土壤總DNA的提取參考Han等[15]的方法進(jìn)行。用土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.A Soil DNA Kit（OmegaBio-Tec，Inc.USA，美國Omega生物技術(shù)公司）提取土壤樣品總DNA，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 生物信息分析

Miseq測(cè)序后，PE讀數(shù)最初根據(jù)其重疊關(guān)系進(jìn)行合并，并對(duì)其序列質(zhì)量進(jìn)行控制和過濾。然后對(duì)樣本進(jìn)行區(qū)分，并進(jìn)行OTU聚類和物種分類分析。該分析包括基于OTU聚類結(jié)果的多樣性指數(shù)分析?；诜诸愋畔ⅲ谌郝浣Y(jié)構(gòu)分析的不同分類水平上再進(jìn)行測(cè)序深度檢測(cè)?；谶@些分析，對(duì)多樣本組成和系統(tǒng)開發(fā)信息進(jìn)行了一系列深人的統(tǒng)計(jì)和可視化分析，如多重分析和差異分化檢驗(yàn)。

1.4分類、物種組成和方差分析

將OTU分析結(jié)果與分類學(xué)信息相結(jié)合，并利用等級(jí)－豐度曲線來評(píng)估物種OTU的豐度和均勻性。a 多樣性、 β 多樣性和稀釋曲線分析按照Costa等[16]的方法進(jìn)行。為了評(píng)估環(huán)境中微生物的多樣性，按照Lam等[17]的方法，使用物種維恩圖分析和群落組成分析等方法計(jì)算了單個(gè)樣本中微生物組的豐富度和多樣性。進(jìn)行物種方差分析，以確定不同組或樣本之間微生物組豐度的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際土壤細(xì)菌群落分析

2.1.1煙草根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平分析

從圖1、圖2分析煙草青枯病不同發(fā)病階段根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)豐度最高的是變形菌門（Proteobacteria， 33.62%～78.51% ），其次是放線菌門（Actinobacteria， 3.27%～24.59% ）、擬桿菌門（Bacter-oidetes， 1.59%-22.71% ）酸桿菌門（Acidobacteria， 0.15% 13.31% ）厚壁菌門（Firmicutes， 0.29%～42.91%） 0煙草不同發(fā)病階段根際細(xì)菌種類在門水平相似，但其豐度發(fā)生了變化，其中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度隨著病情加重而逐漸降低，變化較為顯著的新田十字社區(qū)樣本（XTRS）中放線菌門的相對(duì)豐度由 21.31% 降至5.27% ，厚壁菌門的相對(duì)豐度由 13.11% 變?yōu)?0.43% 。而擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度隨著煙草青枯病病情的加重而逐漸升高，在XTRS的樣本中其相對(duì)豐度由 4.32% 升高至 24.73% 。

2.1.2煙草根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平分析

根據(jù)圖3、圖4可知，屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同發(fā)病程度的煙草根際差異不大?？傮w來說，相對(duì)豐度較高的是不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）假單胞菌屬（Pseudomonas）新根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizob-ium-Rhizobium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、伯克氏菌屬（Burkholderiaceae_unclassified）、節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、雷爾氏菌（Ralstonia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Sphingomonadaceae_unclassified、Rhizobiaceae_unclassified、乳酸鏈球菌屬（Lactococcus）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）。但不同屬的細(xì)菌隨發(fā)病程度不同而呈現(xiàn)豐度升高或降低，其中，Burkholderiaceae、Flavobacterium隨著發(fā)病程度加重其豐度升高。Enterobacteriaceae_unclassified、Lactococcus、Bacillus、Pseudomonas、Pseudarthrobacter、Sphingomonadaceae_unclassified、Sphingomonas隨著發(fā)病程度的加深而豐度下降。

2.2 煙草根際細(xì)菌多樣性差異分析

2.2.1 煙草根際細(xì)菌Alpha多樣性分析

樣本的Alpha多樣性指數(shù)可以反映煙草根際細(xì)菌群落的豐度、多樣性。其中Chao1指數(shù)可以作為衡量根際細(xì)菌物種豐富度的指標(biāo)，它的值越高，根際細(xì)菌的物種就越豐富。Shannon指數(shù)是用來估算樣本中根際細(xì)菌多樣性的指標(biāo)，其值越大，細(xì)菌群落多樣性越高。本次測(cè)序共得到高質(zhì)量細(xì)菌序列12600468條，聚為5681個(gè)不同的細(xì)菌操作分類單元（OperationalTaxonomicUnits，OTUs）。經(jīng)拼接并按 97% 的序列相似性進(jìn)行劃分，隸屬于7個(gè)門，12個(gè)綱，41個(gè)目，62個(gè)科，203個(gè)屬和74個(gè)種。多樣性指數(shù)圖如圖5所示，青枯病發(fā)病土壤的Shannon-Wiener、Chao1指數(shù)均高于未發(fā)病土壤，且隨著發(fā)病程度的增加，Shannon指數(shù)逐漸增大，Chao指數(shù)先增大后減小，其總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但樣本的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)并未達(dá)到顯著差異。以上結(jié)果說明了煙草青枯病發(fā)生嚴(yán)重的土壤中根際細(xì)菌的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性更為豐富。

稀釋曲線（RarefactionCurve）常被用來評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類群，可以直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，間接反映樣品中物種的豐度。從圖6Shannon稀釋曲線可知，當(dāng)隨機(jī)選取煙草根際細(xì)菌樣品測(cè)序數(shù)量為10000個(gè)后，該曲線已趨于平緩。稀釋曲線趨于平緩，表明本次試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)量已逐步趨于合理，較多測(cè)序數(shù)據(jù)僅產(chǎn)生少數(shù)新種（OTUs）。說明煙草根際細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠滿足煙草根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)后續(xù)變化分析的要求。

2.2.2 煙草根際細(xì)菌Beta多樣性及差異分析

Beta多樣性（BetaDiversity）是對(duì)不同樣本的煙草根際細(xì)菌群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，即分析樣本間的微生物群落多樣性，可以從中發(fā)現(xiàn)采得不同發(fā)病程度樣本中根際細(xì)菌群落的散落狀況，間接表達(dá)不同發(fā)病期煙草根際細(xì)菌的真實(shí)情況。Venn圖（圖7）和upset圖（圖8）分析結(jié)果顯示，不同組之間共有183個(gè)共同的OTU。對(duì)樣品組間的多樣性指數(shù)差異分析和β多樣性分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同的樣品組之間，以及不同的發(fā)病程度煙株之間的差異呈現(xiàn)出顯著或極顯著的關(guān)系，說明青枯病會(huì)極大的影響煙草根際土壤細(xì)菌的多樣性。

3 結(jié)論與討論

煙草青枯病發(fā)病程度的增加，在門水平和屬水平上對(duì)細(xì)菌群落種類的影響較小，但對(duì)各種類細(xì)菌的豐度影響較大。門水平上影響最為顯著的是放線菌門，相對(duì)豐度由 21.31% 降至 5.27% ；厚壁菌門，相對(duì)豐度由 13.11% 變?yōu)?0.43% ；擬桿菌門，豐度由4.32% 升高至 24.73% 。屬水平上，Burkholderiaceae_unclassified、Flavobacterium隨著發(fā)病程度加重其豐度升高。Enterobacteriaceae_unclassified、Lactococcus、Bacillus、Pseudomonas、Pseudarthrobacter、Sphingo-monadaceae_unclassified、Sphingomonas隨著發(fā)病程度的加深而豐度下降。與青枯病發(fā)生直接相關(guān)的Ralstonia屬則隨著發(fā)病程度的增加快速上升，發(fā)病煙草植株中Ralstonia的相對(duì)豐度占總細(xì)菌群落組成的 2.18%～58.97% ，遠(yuǎn)高于健康煙草植株的 0.36%～ 6.07% 。Alpha及Beta多樣性分析結(jié)果顯示，煙草青枯病的發(fā)病提高了根際細(xì)菌的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性。這些變化揭示了煙草青枯病發(fā)病程度與根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化關(guān)聯(lián)特征，煙草發(fā)生青枯病會(huì)導(dǎo)致根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的失衡，即放線菌門和厚壁菌門豐度的降低，擬桿菌門豐度的升高。在屬層級(jí)上，黃桿菌屬細(xì)菌豐度會(huì)隨著青枯病發(fā)生程度增加而升高，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等對(duì)青枯病有抑制作用的細(xì)菌則豐度下降，這一現(xiàn)象與前人研究結(jié)果是一致的[18]。黃桿菌屬細(xì)菌作為易感煙草青枯病煙田土壤的標(biāo)志性細(xì)菌之一[19]，發(fā)病煙株通過招募更多的此類拮抗菌來抵抗青枯病菌[20]。據(jù)此推測(cè)，青枯病菌可以通過動(dòng)態(tài)調(diào)整相關(guān)功能菌群的豐度而使自身發(fā)展處于有利地位，發(fā)病煙株則通過特定的招募機(jī)制來抵抗青枯病的發(fā)生和發(fā)展，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

煙草青枯病的發(fā)生不僅影響煙草的健康生長，還會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，加劇病害的發(fā)展。對(duì)煙草青枯病發(fā)病過程中土壤微生物群落變化的研究，不僅有助于更好地理解病害的發(fā)病機(jī)制，也為開發(fā)新的病害防治策略提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。易感青枯病和健康土壤的細(xì)菌物種豐富度無顯著差異，黃桿菌屬（Flavobacterium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizoum）、羅丹桿菌屬（Rhodanobacter）是易感煙草青枯病煙田土壤的標(biāo)志性細(xì)菌，unidentifiedBurkholderiaceae是健康煙田土壤的標(biāo)志性細(xì)菌[19]。在本研究中，unidentifiedBurkholderiaceae豐度隨著發(fā)病程度的增加而上升，黃桿菌屬（Flavobacterium）在各樣本中為高豐度菌屬，這些結(jié)果與前人研究結(jié)論吻合。張玉芹等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，青枯病發(fā)病初期根際土壤微生物多樣性顯著降低，但是隨著病害的發(fā)展，后續(xù)根際土壤微生物多樣性又有恢復(fù)趨勢(shì)。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，煙草青枯病的發(fā)病提高了根際細(xì)菌的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的多樣性，說明青枯病的發(fā)生程度與根際細(xì)菌的多樣性存在關(guān)聯(lián)。對(duì)煙草青枯病病株根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性特征分析結(jié)果表明，與健康煙株相比，在門分類水平上，患病煙株根際Proteobacteria和Bacteroidetes的相對(duì)豐度提高，F(xiàn)irmicutes和Actinobacteria的相對(duì)豐度降低[22]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，煙草不同發(fā)病階段根際細(xì)菌種類在門水平相似，但其豐度發(fā)生了變化，其中放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度隨著病情加重而逐漸降低，而擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度隨著煙草青枯病病情的加重而逐漸升高。這些結(jié)果表明，煙草青枯病的發(fā)生發(fā)展可能與煙株根際細(xì)菌種群豐度變化有關(guān)，有差異的細(xì)菌種群可用于煙草青枯病的生物防控。

高通量測(cè)序是當(dāng)前研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主流方法，發(fā)生了青枯病的番茄[23-25]、煙草[9，26-27]等作物根系及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均采用了高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行研究。但青枯病菌侵染煙株是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，但大多數(shù)研究只比較了最終健康和發(fā)病土壤樣品的差異特性，并沒有關(guān)注發(fā)病過程中的微生物群落變化[18]。闡釋青枯病發(fā)病程度與根際微生物組成的關(guān)聯(lián)特征，可為有益生防微生物的篩選和微生物制劑、肥料的合理利用提供參考[27-29]。本研究通過高通量測(cè)序分析了煙草根際細(xì)菌隨發(fā)病程度而變化的情況，獲得的種類數(shù)均高于培養(yǎng)法所得到的結(jié)果[22]，說明采用擴(kuò)增子高通量測(cè)序能夠更全面準(zhǔn)確地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化情況，為后續(xù)研究提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)參考。本研究只對(duì)青枯病煙株根際細(xì)菌種群多樣性及組成動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行了初步比較分析，后續(xù)可利用高通量測(cè)序?qū)φ婢郝渥兓闆r進(jìn)行研究，以更全面地揭示煙草青枯病害發(fā)生發(fā)展與微生物群落特征之間的關(guān)系。

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（責(zé)任編輯：高國賦）