Ca2+及鈣結(jié)合蛋白與植物耐鹽性關(guān)系的研究進(jìn)展

Research Progress on Relationship between Ca²⁺ and Calcium-Binding Proteins and Salt Tolerance in Plants

Li Cheng’，Du Chunyan2，Cui Xianfen3，Li Yancan'，Li Jingjuan1，Song Jie4，Cui Bing'，Gao Jianwei（1. Vegetable Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;2. Agriculture and Rural Bureau of Daiyue District， Taian City， Taian 271OOO，China;3. Tianzhuang Reservoir Comprehensive Service Center， Yiyuan County， Yiyuan 2561Oo， China ;4. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 25oooo， China）

AbstractSoil salinization severely impacts crop productivity. As a pivotal secondary messenger in plant cells， Ca²⁺ plays a central role in mediating responses to salt stress. Calcium-binding proteins in plants perceive extracellular signals by binding Ca²⁺ . These proteins belong to an extensive gene superfamily including four subfamilies which were calcium-dependent protein kinases （CDPKs）and their related kinases（CRKs）， calmodulins （CaMs），calmodulin-like proteins（CMLs），and calcineurin B-like proteins（CBLs）paired with their interacting protein kinases （（CIPKs）. Calcium-binding proteins play important roles in plants response to salt stress adaptation. This review synthesized current advances in understanding Ca²⁺ signaling and calciumbinding proteins in plant salt tolerance，and mainly discussed the regulatory effects of Ca²⁺ on salt-stressed crops and the function of calcium-binding proteins to crop salt resistance.Finally，the research and application prospects of calcium-binding proteins were prospected.

Keywords Ca²⁺ ; Calcium-binding protein; Salt stress; Salt tolerant mechanism

鹽脅迫對植物生長有重大危害，顯著影響作物產(chǎn)量。目前已知，全球二分之一的灌溉土地和五分之一的耕地受到鹽漬化威脅[1]。由于氣候變化、海水對沿海低洼地的侵蝕以及不合理灌溉等原因，土壤鹽漬化面積日益增加，土壤鹽漬化問題越來越嚴(yán)重[2]。我國鹽堿地約有1億公頃，其中大約有三分之一鹽堿地具備開發(fā)利用潛力。合理利用鹽堿地資源有助于實現(xiàn)我國耕地資源擴(kuò)容和提質(zhì)增效

鹽漬化土壤中的鈉離子（ Na⁺ ）濃度過高會抑制植物對水和營養(yǎng)成分的吸收，并且造成滲透脅迫和離子脅迫，導(dǎo)致包括氧化脅迫在內(nèi)的一系列次級脅迫的產(chǎn)生[3-4]。鹽脅迫還會對植物糖分的積累及糖酵解等糖信號產(chǎn)生影響，除此之外植物光合作用也受到鹽脅迫的調(diào)控[5-6]?？傊}脅迫通過影響光合作用和糖分積累，抑制細(xì)胞的分裂伸長，導(dǎo)致植物生理生化水平紊亂，從而阻礙植物的正常生長發(fā)育[2]

鈣離子（ Ca²⁺ ）在植物細(xì)胞信號傳遞中扮演重要角色，尤其在應(yīng)對環(huán)境壓力時起到關(guān)鍵作用。植物受到外界脅迫時細(xì)胞質(zhì)中的游離 Ca²⁺ 濃度會短暫增加， Ca²⁺ 與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合解碼 Ca²⁺ 信號并引起細(xì)胞生化和生理過程發(fā)生改變以應(yīng)對各種逆境脅迫[7-8]。如在鹽脅迫下， Ca²⁺ 通過介導(dǎo)植物耐受 Na⁺ 脅迫的重要防御通路（SOS途徑），利用根部細(xì)胞將 Na⁺ 排出體外，維持細(xì)胞的離子穩(wěn)態(tài)，保護(hù)植株免受離子毒害[9]。本文通過綜述Ca²⁺ 及鈣結(jié)合蛋白在植物耐鹽中的研究進(jìn)展，主要探討 Ca²⁺ 對鹽脅迫作物的調(diào)節(jié)作用，以及鈣結(jié)合蛋白在作物耐鹽機(jī)制中的功能，最后對鈣結(jié)合蛋白的研究及應(yīng)用前景進(jìn)行展望，以期為耐鹽作物培育提供理論參考。

（204 Ca²⁺ 在植物耐鹽中的作用

植物在應(yīng)對各類逆境時出現(xiàn)了多種多樣的生存機(jī)制。鹽脅迫抑制種子發(fā)芽，阻礙植物的生長[10]。面對鹽脅迫，植物胞質(zhì)內(nèi)的 Ca²⁺ 濃度會迅速提高，形成鈣信號進(jìn)行傳遞。植物細(xì)胞質(zhì)中Ca²⁺ 含量是鈣信號形成的基礎(chǔ)，細(xì)胞質(zhì)中 Ca²⁺ 濃度一般在 100～200nmol?L^-1 。除此之外，液泡、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的 Ca²⁺ 濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞質(zhì)中的，被稱為鈣庫[11]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，鈣庫內(nèi)儲存的 Ca²⁺ 會通過鈣離子通道迅速進(jìn)人細(xì)胞質(zhì)中形成鈣信號，細(xì)胞質(zhì)內(nèi) Ca²⁺ 的濃度將會達(dá)到1～10μmol?L^-1 水平[12-13]。鈣信號完成調(diào)控使命后，鈣離子泵將細(xì)胞質(zhì)中的 Ca²⁺ 排到細(xì)胞外部，Ca²⁺ 反向轉(zhuǎn)運蛋白（ Ca²⁺ /cation antiporter， CAXs）調(diào)控 Ca²⁺ 進(jìn)入液泡[14]。

在鹽脅迫下，植物因受到土壤高滲透勢的影響，會出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水分流失現(xiàn)象。在滲透脅迫中，Ca²⁺ 通過結(jié)合質(zhì)膜鈣滲透通道OSCA1（reducedhyperosmolality-induced increase channel）發(fā)揮重要作用。滲透脅迫下，擬南芥Atosca1突變體細(xì)胞內(nèi)鈣信號無法正常傳遞[15]。水稻中已發(fā)現(xiàn)11個OSCA1的同源基因，其中OsOSCA1.4定位于質(zhì)膜上，在滲透脅迫下可以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì) Ca²⁺ （20濃度增加[16]。雙孔通道（TPC1）可以加速 Ca²⁺ 的傳遞，擬南芥Attpc1突變體遠(yuǎn)距離傳遞鈣信號的速度顯著降低[17]。在植物體內(nèi)，鹽脅迫下鈣信號波的振幅和波峰振蕩模式顯著受鹽響應(yīng)影響，由此表明 Ca²⁺ 在植物對鹽脅迫的響應(yīng)中扮演重要角色。

Ca²⁺ 對植物耐鹽反應(yīng)的調(diào)控很大程度上依賴于脫落酸（ABA）響應(yīng)順式元件，包括ABREs及其耦合元件[18]。G-box啟動子元件是 ABA 響應(yīng)元件（ABREs）的核心基序，可被ABA應(yīng)答的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子（如AREB/ABFs）特異性識別并結(jié)合，進(jìn)而激活下游脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[9]。ABFs主要由ABA調(diào)控，在鹽脅迫和氧化脅迫過程中發(fā)揮功能；ABF2/ABRE1和ABF4/ABRE2則在ABA的調(diào)控下介導(dǎo)干旱、鹽和氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。ABA信號通路在調(diào)控過程中一般被分為三個環(huán)節(jié)，包括受體復(fù)合物的形成、蛋白激酶的介質(zhì)信息傳遞以及轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的靶蛋白合成與翻譯后修飾。ABA受體復(fù)合物由ABA結(jié)合調(diào)控組分RCAR/PYR1/PYLs、ABA受體和共受體PP2C組成，后者依賴ABA的催化活性被RCARs抑制，從而激活 ABA 信號[21]。 Ca²⁺ 信號與ABA信號的結(jié)合可能發(fā)生在三步調(diào)控過程中的任何一個節(jié)點[21]。研究發(fā)現(xiàn)，ABA受體在膜上的累積由Ca²⁺ 通過鈣受體（calcium receptor，CAR）蛋白的功能控制[22-23]。此外，鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）和CBL-CIPKs（CBL，類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白）通過解碼 Ca²⁺ 信號，在ABA依賴和非依賴的脅迫響應(yīng)中形成多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[24]。這兩類蛋白激酶的成員都與ABA共受體ABI2發(fā)生物理作用，并磷酸化ABA信號通路的靶蛋白[25］。CDPKs和CBLs-CIPKs表達(dá)的改變影響ABA敏感性，進(jìn)而影響ABA應(yīng)答[25] O

2鈣結(jié)合蛋白對植物耐鹽調(diào)控的研究進(jìn)展

在鹽漬化土壤中，植物細(xì)胞內(nèi)部或外部的大量 Na⁺ 會觸發(fā)胞質(zhì)內(nèi) Ca²⁺ 濃度的迅速升高[26]細(xì)胞內(nèi) Ca²⁺ 濃度的瞬態(tài)變化引發(fā)鈣信號，被下游鈣結(jié)合蛋白識別和解碼，從而使得下游信號途徑被激活，包括蛋白磷酸化和基因表達(dá)等[27-28]。植物鈣結(jié)合蛋白分為4類，包括鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）和相關(guān)蛋白激酶（CDPK-relatedkinase，CRKs）、鈣調(diào)蛋白（calmodulinproteins，CaMs）、類鈣調(diào)蛋白（calmodulin-likeproteins，CMLs）類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白（calcineurinB-like protein，CBLs）和CBL相互作用蛋白激酶（CBL interacting protein ki-nase，CIPK）[29-30]。與CaMs、CMLs 和 CBL 相比，CDPKs可將 Ca²⁺ 信號直接轉(zhuǎn)導(dǎo)成磷酸化級聯(lián)，這賦予CDPKs具有 Ca²⁺ 感受器和響應(yīng)器的雙重功能。CaMs、CMLs和CBL與 Ca²⁺ 結(jié)合后，需要與下游的靶蛋白相互作用解碼鈣信號傳遞的信息[31]。目前，擬南芥中已鑒定出34個CDPKs、7個CaMs、50個CMLs和10個 CBL^[32-33] 0

2.1 CaMs和CMLs對植物耐鹽的調(diào)控作用

CaMs是一個典型的鈣結(jié)合蛋白，含有4個Ca²⁺ 結(jié)合蛋白的短EF-hand結(jié)構(gòu)，存在于所有真核生物分支中并參與多種基本反應(yīng)，如轉(zhuǎn)錄和酶活性的調(diào)節(jié)等[34]。擬南芥AtCaM1和AtCaM4通過與S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（GSNOR）結(jié)合，降低GSNOR活性，促進(jìn)一氧化氮（NO）積累，從而提高植物耐鹽性[35]。擬南芥中特異性CaM亞型GmCaM4過表達(dá)上調(diào)AtMYB2調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)脯氨酸積累，增強(qiáng)擬南芥耐鹽性[36]。大麥鈣調(diào)蛋白1（HvCaM1）則通過大麥高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白1;1（HvHKT1;1）和大麥鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子4（HvCAMTA4）負(fù)調(diào)控大麥耐鹽性[37] 。

CMLs是一種高度保守的類鈣調(diào)蛋白，是當(dāng)前廣泛研究的一種典型的鈣結(jié)合蛋白，在植物的各生長階段均具有重要作用，對作物應(yīng)對各類脅迫反應(yīng)至關(guān)重要。目前，已經(jīng)對擬南芥、水稻等的CMLs基因家族進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)行相關(guān)功能研究（表1）;CMLs在植物中普遍存在，對CMLs的基因分析指出，絕大多數(shù)CMLs不含內(nèi)含子，暗示其起源于原核生物，并在進(jìn)入真核生物時代后具有高度保守性[38]。盡管大多數(shù)CMLs不含內(nèi)含子，但少數(shù)CMLs基因有內(nèi)含子存在，證明這些內(nèi)含子是近期進(jìn)化的產(chǎn)物。這意味著CMLs基因家族的成員都保持高度保守性，有可能自同一“祖先”進(jìn)化而來。

CMLs與同一物種內(nèi)的CaMs至少具有 16% 的序列相似性;除此之外，與CaMs相比，CMLs結(jié)構(gòu)的N末端和C末端兩個相似的球形末端結(jié)構(gòu)域之間具有更長的連接區(qū)域，使其更具靈活性，并可能影響其與下游靶標(biāo)的相互作用，增加其結(jié)構(gòu)與功能的多樣性[39]。CMLs 在其 EF-hand 結(jié)構(gòu)域中含有保守的 Ca²⁺ 結(jié)合序列。序列比對顯示，第4個EF-hand 中存在保守的 D-x-D-x-D 基序，其第14位、16位和18位氨基酸是保守的；除了第4個EF-hand 外，CMLs 中的其他 EF-hand都不包含保守的 D-x-D 基序[40]

研究表明，AtCML6、AtCML17、AtCML28、AtC-ML37.AtCML40…AtCML44…AtCML50 在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，AtCML8、AtCML13、AtCML18、AtC-ML25在鹽脅迫下表達(dá)模式則被抑制[27]CML20、CML37通過調(diào)控ABA信號通路提高植物的耐鹽能力[41-42]，CML36通過調(diào)節(jié) Ca²⁺ -ATPaseACA8活性，參與植物應(yīng)對干旱和鹽脅迫的過程[43]。水稻通過過表達(dá)OsCML16 顯著增強(qiáng)其植株的耐鹽性[44]。Magnan等[45]研究發(fā)現(xiàn)，AtCML9在ABA和鹽脅迫處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，并在擬南芥的鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在大豆中，過量表達(dá)GmCaM4可以增強(qiáng)其對病原體和鹽脅迫的抗性[46]。AtCML24參與調(diào)控ABA、鹽脅迫和長日照誘導(dǎo)的開花過程，并發(fā)揮重要作用[47]。在寒冷、干旱和鹽脅迫下番茄SICML26表達(dá)顯著上調(diào)[48]。鹽脅迫下，4 種甘野菊的CsCML14、CsC-ML50、CsCML65、CsCML79表達(dá)均有顯著上調(diào)[49]鹽處理下，大白菜CML41和CML43的表達(dá)量均顯著上調(diào)[50]。鹽誘導(dǎo)條件下，茶樹中CsCML16、CsCML18、CsCML42的表達(dá)量均顯著上調(diào)[51] 。

2.2 CBL-CIPK對植物耐鹽的調(diào)控作用

CBLs代表另一個含有EF-hand結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白，CBLs與CaMs保守基序的相似度很低，這兩個鈣離子結(jié)合蛋白家族似乎在進(jìn)化早期就發(fā)生了分化[34]。盡管CBLs蛋白也包含4個EF-hand 基序，但它的第一個EF-hand上的 Ca²⁺ 結(jié)合區(qū)域并不是由12個氨基酸而是由14個氨基酸組成，且可以正常與 Ca²⁺ 結(jié)合[52]。CBL互作蛋白激酶（CIPKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其N端具有催化功能的激酶結(jié)構(gòu)域，C端則包含通過NAF/FISL基序結(jié)合CBL蛋白的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，兩者通過形成CBL-CIPK復(fù)合體協(xié)同傳遞鈣離子信號，從而調(diào)控植物對鹽脅迫等環(huán)境逆境的適應(yīng)性響應(yīng)[53] O

CBL和CIPK可以形成復(fù)合物，對植物的耐鹽過程至關(guān)重要。擬南芥中CBL-CIPK復(fù)合體通過兩條不同的途徑調(diào)控植物的耐鹽反應(yīng)。一條是CBL4-CIPK24-SOSI 通路，是CBL-CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一條經(jīng)典途徑，又稱作SOS途徑，主要是通過SOS途徑將根部細(xì)胞內(nèi)的 Na⁺ 排出體外，從而增強(qiáng)植物的耐鹽性[54-55]；另一條是CBL10-CIPK24-NHX1通路，將細(xì)胞質(zhì)中的 Na⁺ 區(qū)域化到液泡中，維持胞質(zhì)中的低 Na⁺ 濃度，減少鹽脅迫造成的損傷[56] 。

2.3 CDPKs和CRKs對植物耐鹽的調(diào)控作用

鈣調(diào)蛋白CDPKs包含4個保守結(jié)構(gòu)域，即N端可變域、激酶催化域、自抑制連接域和C端調(diào)控域[57]，包含了EF-hand鈣結(jié)合基序的傳感活性和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的響應(yīng)活性的蛋白[58]。相比之下，CRKs具有與CDPKs相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是C端調(diào)控域的EF-hand發(fā)生了退化，不能直接受 Ca²⁺ 的調(diào)控[59]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Ca²⁺ 和CaM相結(jié)合時可調(diào)控CRKs的激酶活性[60]。除此之外，CRKs 可以通過自磷酸化調(diào)節(jié)激酶活性[61]。目前已知，AtCRK1可以通過 Ca²⁺ 依賴的方式結(jié)合鈣調(diào)蛋白（CaM）發(fā)揮激酶活性，同樣，在自磷酸化和底物磷酸化情況下發(fā)現(xiàn)其不依賴于 Ca²⁺ 同樣可以發(fā)揮激酶活性[62]。CRKs僅存在于植物中，而CDPKs在植物和某些原核生物中均有存在，這表明了CRKs的植物特異性[63] 。

CDPKs和CRKs在作物應(yīng)對鹽脅迫時扮演關(guān)鍵角色。擬南芥CDPKs通過調(diào)控ABF（ABA-re-sponsive element binding factors）轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的ABA應(yīng)答基因表達(dá)和調(diào)控ABA介導(dǎo)的陰離子通道（SLAC1，SLAH3），調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉來參與鹽脅迫響應(yīng)[24，64]。比如，AtCPK4 和 AtCPK11是植物激素 ABA信號傳導(dǎo)途徑中的正向調(diào)控因子，參與種子萌發(fā)、幼苗生長、氣孔調(diào)節(jié)以及抗鹽逆境反應(yīng)等[65]，AtCPK12被認(rèn)為是ABA信號通路的負(fù)調(diào)控因子[66]，而 AtCPK6在應(yīng)對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)中至關(guān)重要[6]。鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）增加會破壞植物細(xì)胞膜，除此之外，還導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂[68-69]，CDPKs通過調(diào)控ROS 清除途徑來調(diào)節(jié)作物對鹽脅迫的適應(yīng)能力，例如，擬南芥中過氧化氫酶AtCAT3被AtCPK8磷酸化激活[70]，水稻中抗壞血酸過氧化物酶Os-APX2/OsAPX8和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶OsRbohI活性受Os-CPK12調(diào)控[71]。AtCPK5可以通過磷酸化 NAD-PH氧化酶RbohD導(dǎo)致細(xì)胞外 H₂O₂ 產(chǎn)生，對加速信號傳播和防御氧化脅迫至關(guān)重要[72]。AtCPK27和AtCPK12在清除ROS過程中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)進(jìn)而提高植株耐鹽性[73-74]。過量表達(dá)AtCPK1和AtCPK6增強(qiáng)作物耐鹽性，可能是通過調(diào)節(jié) ROS 和脯氨酸的產(chǎn)生實現(xiàn)的[75-76]。相反，CPK21和CPK23對滲透脅迫的耐受力更強(qiáng)[77-79]。AtCRK1與AtCBK3相互作用并磷酸化是鹽敏感性的調(diào)節(jié)因子，在鹽脅迫下維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和滲透平衡[80]。此外，液泡鉀離子（2 （K⁺ ）通道TPK1被AtCPK3磷酸化，在鹽脅迫下調(diào)節(jié)胞質(zhì) Na⁺/K⁺ 平衡[81]。過表達(dá)玉米Zm-CPK11可以提高植株體內(nèi) Na⁺ 和 K⁺ 的穩(wěn)定性，使植株的耐鹽性增強(qiáng)[82]。cpk12 和cpk27突變體可以通過根系外排 Na⁺ ，減少鹽脅迫對作物的傷害[73-74]

3 展望

近年來，由于人類活動和全球氣候變化，世界范圍內(nèi)的土壤鹽漬化嚴(yán)重程度仍在擴(kuò)大。鹽脅迫抑制種子發(fā)芽、阻礙植物的正常生長發(fā)育，對植物造成負(fù)面影響。在植物對抗鹽脅迫過程中， Ca²⁺ 作為植物的第二信使，通過與鈣結(jié)合蛋白相結(jié)合，調(diào)控下游蛋白的表達(dá)，從而在抗鹽過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同鈣結(jié)合蛋白在作物響應(yīng)鹽脅迫中表現(xiàn)為正調(diào)控或負(fù)調(diào)控特性，呈現(xiàn)復(fù)雜調(diào)控模式。然而，前人研究主要側(cè)重于驗證鈣結(jié)合蛋白的耐鹽功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，缺乏對其耐鹽脅迫調(diào)控機(jī)理的研究，以及 Ca²⁺ 信號路徑的上下游調(diào)節(jié)機(jī)理仍未徹底揭示。后續(xù)仍需進(jìn)一步深入挖掘鈣結(jié)合蛋白響應(yīng)鹽脅迫的家族成員，探明其在響應(yīng)鹽脅迫過程中的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，以及與上下游調(diào)控元件的互作關(guān)系。相信隨著細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)和現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，植物中鈣結(jié)合蛋白調(diào)控鹽脅迫的分子機(jī)理將會陸續(xù)被探明，從而為作物抗鹽性評價和抗鹽作物培育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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