外源褪黑素對(duì)鹽堿脅迫下大豆葉綠素代謝的影響

Effects of Exogenous Melatonin on Chlorophyll Metabolism of Soybean under Saline-Alkali Stress

Ma Yue’，Ding Xu1，Hu Jiachen’，Pan Qifeng'，Yu Yang'， Zhao Qiang1'2，Zhou Wei ^3，4 ， Du Jidao ^2，4 （204（1. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163ooo， China ;2. National Engineering Research Center of Coarse Grains， Daqing 16300o， China;3. Daqing Qilong Agricultural Technology Co.， Ltd.， Daqing 16300o， China;

Research CenterofSaline-Alkali LandImprovementEnginering Technologyin HeilongjiangProvince，Dqing1630oo，China）

AbstractSaline-alkali stress （SA）is a kind of common abiotic stress in nature that can inhibit the absorption of water and nutrients by plants，induce plant cels to produce a large number of reactive oxygen species （ROS），and inhibit plant growth and biomass accumulation. As an active molecule with various regulatory abilities，melatonin （MT）plays the important role in regulating seed germination and plant growth and development under stresses.In this study，the soybean varieties HH49（with saline-alkali tolerance）and HN95 （with saline-alkali sensitivity）were used as experimental materials，and their seedlings were cultured in saline-alkali soil （ pH=8.78 ） to V1 stage by potted method. Foliar application of exogenous MT was conducted to clarify the effcts of MT treatment on chlorophyll metabolism and photosynthetic capacity of soybean leaves under SA. The results showed that compared with the control （CK），SA increased the contents of superoxide anion （ 0₂^- ）and hydrogen peroxide （ H₂O₂ ） in soybean seedling leaves， regulated the expression levels of genes related to chlorophyll（Chl） synthesis and decomposition in soybean seedling leaves，decreased chlorophyll content and photosynthesis and fluorescence parameters，affcted the accumulation and metabolism of carbohydrates，and inhibited plant growth.Exogenous MT treatment significantly increased the activity of antioxidant enzymes in leaves，decreased the ROS accumulation，up-regulated the expresion levels of GmGSA2，GmGUN4，GmPORB and GmCHLG genes related to chlorophyll synthesis， down-regulated the expresion levels of GmHCAR，GmPPH，GmPAO and GmRCCR genes related to chlorophyll decomposition，increased the content of chlorophyll in leaves，improved the photosynthetic capacity of plants，promoted the accumulation and metabolism of soluble sugar，sucrose and starch，and so promoted plant growth of soybean. The results of this study could provide a theoretical basis for breeding saline-tolerant soybean varieties and developing saline-alkali tolerant tillage measures.

KeywordsSoybean （Glycine max L.）； Melatonin; ROS accumulation and removal; Chlorophyll syn-thesis and decomposition； Photosynthesis

世界范圍內(nèi)約 7% 的土地出現(xiàn)不同程度的鹽漬化，而中國(guó)鹽漬化土地的總面積約為9913萬(wàn) hm² ，鹽漬化土壤嚴(yán)重影響農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成[1]鹽堿脅迫（SA）導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）大量累積并造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞植物細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)、蛋白功能和基因組穩(wěn)定性，從而抑制植物生長(zhǎng)和生物量積累[2-3]。因此，明確鹽堿脅迫下植物的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)于耐鹽堿作物品種選育和相應(yīng)耕作措施開(kāi)發(fā)具有重要意義。

葉綠素（chlorophyl，Chl）是綠色植物體內(nèi)所含有的一類色素，存在于葉綠體的類囊體膜上。葉綠素a（Chla）參與光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）核心復(fù)合物中光能的捕獲和轉(zhuǎn)換，葉綠素b（Chlb）參與PSI和PSⅡ的外圍光能捕獲[4]。前人研究表明，非生物脅迫會(huì)降低植物光系統(tǒng)反應(yīng)中心活性，抑制電子傳遞速率（ETR），導(dǎo)致ChI從葉綠體內(nèi)游離出來(lái)，經(jīng)歷一系列的形態(tài)和生理變化后，呈現(xiàn)明顯的Chl降解狀態(tài)，最終導(dǎo)致Chl含量降低[5-7]。植物的Chl代謝途徑涉及多種酶促反應(yīng)，而這些酶的編碼基因的表達(dá)水平受到環(huán)境條件和自身生長(zhǎng)狀態(tài)的顯著影響[8-10]例如，當(dāng)水稻葉片衰老時(shí)，脫鎂葉綠酸 ∝ 加氧酶基因（pheideaoxygenase，PAO）的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)Chl分解，導(dǎo)致水稻葉片中Chl含量下降[11];鹽脅迫顯著上調(diào)黃瓜體內(nèi)脫鎂葉綠素酶基因（pheo-phytinpheophorbidehydrolase，PPH）的表達(dá)水平，抑制Chl合成[12]；水分脅迫下調(diào)黑麥草葉片中原葉綠素酸酯氧化還原酶（protochlorophyllideoxidoreductase，PORs）和葉綠素合成酶基因（chloro-phyllsynthase，CHLG）的表達(dá)水平，但上調(diào)了PPH基因的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致Chl含量下降[13]。葉綠體含量下降會(huì)導(dǎo)致植物的捕光能力和光能轉(zhuǎn)化能力下降，從而抑制植物的光合作用，影響碳水化合物積累和代謝循環(huán)。植物的光合作用產(chǎn)物主要以淀粉形式儲(chǔ)存，并通過(guò)與糖的相互轉(zhuǎn)化來(lái)影響整個(gè)植物細(xì)胞的碳分配[14]。植物的碳水化合物循環(huán)由多種酶催化，其中磷酸蔗糖合酶、蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶是植物蔗糖合成和分解過(guò)程中極為重要的酶[15]。前人研究表明，非生物脅迫可以通過(guò)調(diào)控淀粉代謝而反饋調(diào)節(jié)植物的光合能力[16]

褪黑素（melatonin，MT）是一種胺類激素MT已被證實(shí)可參與動(dòng)物抗氧化防御，防止細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，以預(yù)防細(xì)胞核DNA損傷引起的癌變[17]。MT參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程，在調(diào)控種子萌發(fā)、根系發(fā)育、果實(shí)成熟和衰老等方面具有重要作用[18]。MT在增強(qiáng)植物對(duì)非生物逆境脅迫耐受能力方面也發(fā)揮著重要的作用。例如，外源MT處理可以提高番茄對(duì)鹽堿脅迫的耐受性[19];MT處理能夠提高百日草幼苗可溶性糖、Chl含量，增強(qiáng)其對(duì)鉻脅迫的抗性[20]；外源MT可以降低滲透脅迫對(duì)大豆光合作用的抑制，改善干旱脅迫對(duì)大豆的生長(zhǎng)抑制和氧化損傷[21]。但是，目前關(guān)于MT對(duì)鹽堿脅迫下大豆葉片中Chl代謝及光合碳代謝能力影響的研究少見(jiàn)報(bào)道

本研究以耐鹽堿性不同的兩個(gè)大豆品種為試驗(yàn)材料，分析噴施MT對(duì)鹽堿脅迫下大豆葉片ROS積累、Chl代謝、光合作用及碳水化合物積累的影響，以期為耐鹽堿大豆品種選育和耐鹽堿耕作措施的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)

材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以黑河49（耐鹽堿品種，HH49）和合農(nóng)95（鹽堿敏感品種，HN95）為材料。HH49和HN95兩大豆品種種子均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)種質(zhì)資源創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2023年6月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)（黑龍江省大慶市）的旱棚內(nèi)進(jìn)行。選取健康飽滿均勻的大豆種子，分別播于盛滿黑鈣土（總鹽含量 2.0‰ ， pH= 7.20）和鹽堿土（總鹽含量 4.5%o，pH=8.78 的聚丙烯花盆（口徑 21cm ，底徑 15cm ，高 19cm 中，每盆播種7粒種子，每品種6盆。待大豆幼苗生長(zhǎng)至真葉期時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的大豆植株定苗，每盆保留3株。當(dāng)大豆幼苗生長(zhǎng)至V1期（單葉充分生長(zhǎng)，第一復(fù)葉小葉片的葉緣分離）時(shí)，進(jìn)行葉面噴施褪黑素 （MT，300μmol?L^-1 ）處理，噴施時(shí)間為每天20時(shí)，連續(xù)噴施 3d 。

試驗(yàn)處理組設(shè)置如下：對(duì)照組（CK）：正常黑鈣土生長(zhǎng)條件下大豆葉片噴施 10mL 蒸餾水；正常生長(zhǎng)條件 +MT 處理（CKM）：正常黑鈣土生長(zhǎng)條件下大豆葉片噴施 10mL MT；鹽堿脅迫處理（SA）：鹽堿土生長(zhǎng)條件下大豆葉片噴施 10mL 蒸餾水； SA+MT 處理（SAM）：鹽堿土生長(zhǎng)條件下大豆葉片噴施 。外源MT處理結(jié)束后 7d 時(shí)對(duì)大豆幼苗第一片三出復(fù)葉進(jìn)行取樣，液氮冷凍 5min 后 -80^°C 保存，用于相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。每盆中的3株視為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)處理包含6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，其中3個(gè)重復(fù)用于取樣，另外3個(gè)重復(fù)用于葉綠素含量和光合指標(biāo)測(cè)定

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1形態(tài)指標(biāo)和生物量測(cè)定取樣前用直尺測(cè)量大豆幼苗株高；采用Zhao等[22的方法使用植物激光三維表型儀PlantEyeF500（Phenospex，瑞士）測(cè)定大豆幼苗的形態(tài)指標(biāo)和光譜參數(shù)，包括植株的色調(diào)值、綠度指數(shù)、光穿透度、歸一化植被指數(shù)和葉面積取樣時(shí)，將大豆幼苗植株從子葉節(jié)處分離，分為地上部和根系兩部分，用蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干樣品表面水分，將3個(gè)重復(fù)的樣品于-80^°C 冰箱保存?zhèn)溆?；將?個(gè)重復(fù)的樣品放入牛皮紙信封中，置于 105^°C 烘箱中殺青 20min，80 C 烘干至恒重，使用萬(wàn)分之一天平（XS105DU，Mettlertoledo，Switzerland）稱量大豆幼苗地上部與根系干重。

按照以下公式計(jì)算植株根冠比：根冠比 Σ=Σ （幼苗根系干重/幼苗地上部干重）。

1.3.2 光合特性指標(biāo)測(cè)定 使用光合儀LI-6400XT（Li-COR 64OO，Li-COR Inc，Neraska，USA）測(cè)定MT處理后 7d 時(shí)的大豆第一片三出復(fù)葉的光合參數(shù)，包括凈光合速率（ Pn_Ω ）、氣孔導(dǎo)度（Gs）蒸騰速率（Tr）和胞間 CO₂ 濃度（Ci）。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定使用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x（OS5P，OPTI-Sciences，USA）測(cè)定MT處理后7d時(shí)大豆第一片三出復(fù)葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括PSI最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSII潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）、PSI實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）和表觀電子傳遞速率（ETR）。

1.3.4 光合色素含量測(cè)定 稱取 0.05g 新鮮大豆葉片，浸泡于 10mL 95% 無(wú)水乙醇中， 25^°C 暗處理 48h ，直至葉片完全褪色，采用比色法測(cè)定上清液在 665nm 和 649nm 處的吸光值，每處理重復(fù)測(cè)定3次。按照以下公式計(jì)算大豆葉片中葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和葉綠素 a+b （Chla+b ）含量：

葉綠素a含量（ ΔChla）=（13.95×OD₆₆₅-6.88× OD₆₄₉）×（0.01/0.05） ；

葉綠素 b 含量 OD₆₆₅）×（0.01/0.05） ；

葉綠素 a+b 含量 。1.3.5 、 H₂O₂ 含量及抗氧化酶活性測(cè)定根據(jù) Ma 等[23]描述的方法，采用氮藍(lán)四唑（NBT）染色法和3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法進(jìn)行大豆幼苗葉片 和 H₂O₂ 的染色定位。根據(jù)Elst-ner等[24]所描述的方法，采用羥胺氧化法測(cè)定 含量;根據(jù)Alexieva等[25]所描述的方法，使用碘化鉀分光光度計(jì)法測(cè)定 H₂O₂ 含量；根據(jù)Zhao等[26]描述的方法，分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）法和愈創(chuàng)木酚法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性；根據(jù) Du 等[27]描述的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。

1.3.6碳水化合物含量及其代謝酶活性測(cè)定采用Zhao等[26]的方法，測(cè)定大豆葉片中可溶性糖、蔗糖和淀粉含量。根據(jù) Du 等[27]的方法，分別測(cè)定蔗糖代謝酶活性，包括磷酸蔗糖合酶、蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性，以及淀粉代謝酶（ ∝ -淀粉酶和 β -淀粉酶）活性。

1.3.7 RNA的提取、cDNA 的合成和qRT-PCR分析取 -80^°C 保存的大豆葉片組織 0.1g ，使用TransZolPlant（TRAN，Beijing，China）試劑盒提取葉片組織的總RNA。使用NanoDrop 2000（Thermo Scientific）測(cè)定RNA濃度。使用Prime-ScriptTMRT試劑盒合成單鏈cDNA。將cDNA稀釋8 倍后，使用 TransScript@ Top Green qPCR Su-perMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR（CFX-96，Bio-rad）分析。以GmActin-11作為內(nèi)參基因，使用 2^-ΔΔGt 方法計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平[28]包括葉綠素合成途徑相關(guān)基因GmGSA2、Gm-GUN4、GmPORB和GmCHLG以及葉綠素分解途徑相關(guān)基因 GmHCAR?GmPPH?GmPAO 和 GmRC-CR 。每3個(gè)生物重復(fù)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。引物信息如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用MicrosoftExcel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSSStatistics26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將CK條件下大豆幼苗葉片中相關(guān)基因的表達(dá)量設(shè)為1，使用 2^-ΔΔCt 方法進(jìn)行qRT-PCR 數(shù)據(jù)歸一化分析。使用單因素方差分析方法分析處理間的顯著性差異（ Plt;0.05） ，使用GraphPadPrism8軟件繪圖。數(shù)據(jù)以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗形態(tài)和生物量的影響

由圖1可知，與對(duì)照（CK）相比，SA處理顯著降低HH49、HN95的株高、色調(diào)值、綠度指數(shù)、歸一化植被指數(shù)、葉面積、地上部干重和根干重，且對(duì)HN95植株生長(zhǎng)的抑制程度更高，顯著增加光穿透度和根冠比

與CK相比，CKM處理顯著增加HH49、HN95的株高、綠度指數(shù)、歸一化植被指數(shù)、葉面積、地上部干重和根干重，而對(duì)色調(diào)值、光穿透度和根冠比影響不顯著。與SA處理相比，SAM處理顯著增加 HH49、HN95 的株高（增幅分別為 13%.17% ）、色調(diào)值（增幅分別為 12%.14% ）、綠度指數(shù)（增幅分別為 25%.29% ）、歸一化植被指數(shù)（增幅分別為 38%，39% ）、葉面積（增幅分別為 20%.58% ）、地上部干重（增幅分別為 30%，33% 和根干重（增幅分別為 24%48% ），顯著降低光穿透度（降幅分別為 24%23% ）

2.2 外源MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片光合特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如圖2所示，與CK相比，SA處理顯著降低

HH49、HN95幼苗葉片 ETR、 Fv/Fm 值和Fv/Fo值，且對(duì)HN95幼苗葉片的影響程度更大。與SA處理相比，SAM處理顯著提高HH49、HN95幼苗葉片 Pn （升幅分別為41%56% ）、 Gs （升幅分別為 40%，100% ）、Ci（升幅分別為 23% 、 34% ）、 Tr （升幅分別為 52% ！49% ）、 ΦPSI （升幅分別為 17%25% ）、ETR（升幅分別為 4%4% ） Fv/Fm 值（升幅分別為 2% ）4% ）和Fv/Fo值（升幅分別為 34%25% ）。

2.3 外源MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片光合色素含量的影響

如圖3所示，與CK相比，SA處理顯著降低HH49、HN95幼苗葉片Chla ??Chl?b 和 Chla+b 的含量。與SA處理相比，SAM處理顯著增加HH49、HN95幼苗葉片Chla（增幅分別為 7% ！13% ） ，Chlb （增幅分別為 22%.32% ）和Chl a+b （增幅分別為 13%.19% 的含量。

2.4外源MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片葉綠素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與CK相比，SA處理顯著降低HH49、HN95幼苗葉片葉綠素合成途徑相關(guān)基因GmGSA2、GmGUN4、GmPORB和GmCHLG的相對(duì)表達(dá)水平，顯著升高HH49、HN95葉片葉綠素分解途徑相關(guān)基因GmHCAR、GmPPH、GmPAO和GmRCCR的相對(duì)表達(dá)水平。與SA處理相比，

SAM處理顯著上調(diào)HH49、HN95幼苗葉片葉綠素合成途徑基因GmGSA2（上調(diào)倍數(shù)分別為3.85、7.23倍） （上調(diào)倍數(shù)分別為5.44、18.03倍）、GmP0RB（上調(diào)倍數(shù)分別為1.08、4.26倍）和GmCHLG（上調(diào)倍數(shù)分別為6.07、8.67倍）的相對(duì)表達(dá)水平，顯著降低HH49、HN95葉片葉綠素分解途徑相關(guān)基因GmHCAR（降幅分別為 90% ！85% ）、GmPPH（降幅分別為 77%.84% ）、GmPAO（降幅分別為 80%，61%） 和GmRCCR（降幅分別為 47%80% ）的相對(duì)表達(dá)水平

2.5 外源MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片ROS積累和抗氧化能力的影響

由圖5A可知，與CK相比，SA處理顯著增加HH49、HN95葉片的NBT、DAB 染色深度。與SA處理相比，SAM處理顯著降低HH49、HN95葉片的NBT、DAB染色深度。

由圖5B、C可知，與CK相比，SA處理顯著增加HH49、HN95葉片中的 0₂^- 和 H₂O₂ 含量，且SA處理下HN95葉片中的 H₂O₂ 含量明顯高于HH49；與SA相比，SAM處理顯著降低兩個(gè)大豆品種葉片中的 0₂^- 和 H₂O₂ 含量。

由圖5D、E、F可知，與CK相比，SA處理顯著提高HH49、HN95 葉片 SOD、CAT 活性，對(duì)POD活性無(wú)顯著影響；與SA處理相比，SAM處理顯著升高HN95葉片SOD活性及兩品種葉片POD和CAT活性，對(duì)HH49葉片SOD活性無(wú)顯著影響。

2.6 外源MT處理對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片 碳水化合物積累和代謝的影響

如圖6所示，與CK相比，SA處理顯著降低大豆葉片蔗糖和淀粉含量，對(duì)可溶性糖含量無(wú)顯著影響；與 SA 處理相比，SAM 處理顯著增加HH49、HN95幼苗葉片可溶性糖（增幅分別為9%6%） 、蔗糖（增幅分別為 19%.29% 和淀粉（增幅分別為 8%9% 含量。

與CK相比，SA處理顯著降低HH49幼苗葉片磷酸蔗糖合酶、蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶活性，顯著提高 ∝ -淀粉酶、 β- 淀粉酶活性，對(duì)中性轉(zhuǎn)化酶活性無(wú)顯著影響；顯著降低HN95幼苗葉片磷酸蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性，顯著提高 α -淀粉酶、β-淀粉酶活性，對(duì)蔗糖合酶活性無(wú)顯著影響。與SA處理相比，SAM處理顯著提高HH49幼苗葉片磷酸蔗糖合酶、蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性，增幅分別為 15%.18% ！ 13% 和 17% ，顯著降低其 ∝ -淀粉酶、 β- 淀粉酶活 性，降幅分別為 7%.9% ;SAM處理顯著提高 HN95幼苗葉片磷酸蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中 性轉(zhuǎn)化酶活性，增幅分別為 17%.36% 和 29% ，顯 著降低其 ∝ -淀粉酶、 β- 淀粉酶活性，降幅分別為 10%.14% ，對(duì)其蔗糖合酶活性無(wú)顯著影響。

3討論與結(jié)論

鹽堿脅迫影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物量積累，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降[29]。前人研究表明，鹽堿脅迫能夠顯著降低水稻、大豆、棉花、玉米等作物的地上部和根系生物量積累、葉片數(shù)量和葉面積，抑制植株生長(zhǎng)[30-32]。本研究中，鹽堿脅迫顯著降低HH49、HN95的株高、葉面積以及地上部干重和根干重，同時(shí)鹽堿脅迫對(duì)HN95植株生長(zhǎng)的抑制程度高于HH49植株，表明HH49的鹽堿脅迫耐受性更高。根冠比的變化可以反映植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和環(huán)境適應(yīng)性。Gao等[33]研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽堿性燕麥品種均會(huì)通過(guò)提高根冠比來(lái)應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫。本研究中，鹽堿脅迫下HH49、HN95的根冠比均顯著增加，這可能是由于鹽堿脅迫對(duì)地上部的生長(zhǎng)抑制比對(duì)根系的?。慌c鹽堿脅迫（SA）處理相比，褪黑素（MT）處理顯著緩解鹽堿脅迫對(duì)HH49、HN95植株的生長(zhǎng)抑制，且對(duì)HN95生長(zhǎng)抑制的緩解效果更好。

當(dāng)植物遭受外界逆境時(shí)，植物細(xì)胞中的葉綠體、線粒體和質(zhì)膜等部位均會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[34-35]。植物可以通過(guò)抗氧化防御酶系統(tǒng)平衡ROS代謝，以應(yīng)對(duì)各種脅迫所導(dǎo)致的氧化損傷。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是植物抗氧化防御的第一道防線，能夠?qū)⒎e累的超氧陰離子（ ）轉(zhuǎn)化為氧氣 和過(guò)氧化氫（ ，隨后過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）將 H₂O₂ 轉(zhuǎn)化為水和 。本研究中，鹽堿脅迫下HH49、HN95幼苗葉片SOD、CAT活性顯著升高，有效減輕葉片內(nèi)的ROS積累。褪黑素（MT）具有提高植物抗氧化防御能力和降低植物 ROS累積的作用[20]。Cen等[36]研究表明，MT能夠增強(qiáng)苜蓿葉片抗氧化酶活性，降低ROS積累量并提高其耐鹽性；Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MT可以緩解鹽堿脅迫對(duì)番茄ROS代謝和離子穩(wěn)態(tài)的影響。本研究中，SAM處理下HH49、HN95葉片SOD（HH49除外）、POD、CAT活性均顯著提高，葉片中 ！ H₂O₂ 含量均顯著降低，且HN95的降低幅度明顯高于HH49。這可能是導(dǎo)致MT處理對(duì)鹽堿脅迫下HN95植株生長(zhǎng)抑制緩解效果更好的原因之一。

有研究表明，鹽堿、低溫、干旱和澇害等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片黃化，影響葉綠素（Chl）的吸光特性，調(diào)控葉綠素的生物合成和降解代謝，降低植物的光合能力[37-39]。本研究中，與 CK 相比，鹽堿脅迫顯著上調(diào)HH49、HN95幼苗葉片葉綠素降解相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，顯著下調(diào)葉綠素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，導(dǎo)致Chl a、Chlb和 Chla+b 含量均顯著下降。Chla和Chlb作為Chl代謝的關(guān)鍵產(chǎn)物，在植物光能吸收和傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9，40]。MT可通過(guò)修復(fù)植物Chl分子的完整性來(lái)維持光合作用[41]。Liu等[42]的研究表明，噴施 MT下調(diào)黃瓜葉片中Chl降解基因的表達(dá)水平，緩解了黑暗脅迫導(dǎo)致的Chl含量下降和葉片衰老，促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成。本研究中，MT處理顯著上調(diào)鹽堿脅迫下兩個(gè)大豆品種葉片Chl合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，顯著下調(diào)降解相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平，表明外源MT可以通過(guò)調(diào)節(jié)Chl代謝降低鹽堿脅迫對(duì)葉綠素含量的影響。同時(shí)，鹽堿脅迫下，MT處理HN95葉片Chla含量明顯高于HH49。前人研究表明，Chla含量的提高更有利于植物光合能力的提高[43]，這可能也是MT處理對(duì)鹽堿脅迫敏感的HN95幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用更好的原因。

Chla參與光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡI）核心復(fù)合物中光能的捕獲和轉(zhuǎn)換，Chlb參與PSI和PSⅡ的外圍光能捕獲[4]。前人研究表明，非生物脅迫可以破壞植物Chl的類囊體膜，降低PSI潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo），影響電子傳遞，進(jìn)而降低葉片的光合能力[44]。此外，有研究表明，鹽堿脅迫通過(guò)降低植物葉片的氣孔大小降低光截獲面積，影響植物的光吸收與調(diào)節(jié)，進(jìn)而降低光合速率[2245-46]。鹽堿脅迫降低大豆凈光合速率（ Pn） ，加速大豆葉片衰老[6；鹽脅迫降低高粱葉片 Pn?cornerGs 和Ci，且不同品種的鹽脅迫耐受性存在差異[47]。本研究中，SA 處理顯著降低HH49、HN95幼苗葉片 Pn?Gs?Ci 和 Tr ，且HN95的降低程度更高，這可能是導(dǎo)致HN95耐鹽堿能力較低的主要原因；MT處理顯著提高鹽堿脅迫下兩個(gè)大豆品種葉片 及Fv/Fm和Fv/Fo值，表明MT處理可以顯著增強(qiáng)鹽堿脅迫下大豆植株的葉片光合能力，從而為滲透脅迫調(diào)節(jié)和植物生長(zhǎng)提供更多的能量和物質(zhì)基礎(chǔ);MT處理顯著提高鹽堿脅迫下兩個(gè)大豆品種幼苗葉片色調(diào)值、綠度指數(shù)和歸一化植被指數(shù)，表明MT處理通過(guò)提高幼苗葉片葉綠素含量，降低葉片對(duì)紅色、綠色及藍(lán)色光的反射率，增加對(duì)近紅外光的反射率，從而提高大豆植株的光合有效輻射率，增強(qiáng)光合能力。

植物通過(guò)光合作用固定碳元素并合成淀粉，以維持植物在夜間或黑暗條件下的呼吸作用和糖分輸出[48]。然而，植物的淀粉代謝會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響[32，49]。水分脅迫下，大豆葉片中的淀粉酶活性增加，而籽粒中的淀粉含量降低[50]本研究中，SA處理顯著提高兩個(gè)大豆品種葉片中∝ -淀粉酶、 ?^β? -淀粉酶活性，加速淀粉水解，誘導(dǎo)淀粉向可溶性糖轉(zhuǎn)換，促進(jìn)葉片中可溶性糖積累，降低葉片中的淀粉含量。脅迫條件下，葉片中較高濃度的糖能夠在葉綠體中積累并靠近類囊體，從而避免類囊體解體，以保護(hù)類囊體結(jié)構(gòu)，維持正常的光合磷酸化反應(yīng)；但是，鹽堿脅迫降低大豆幼苗葉片光合能力，導(dǎo)致蔗糖合成受阻，同時(shí)也抑制磷酸蔗糖合酶、蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性，影響碳水化合物的代謝循環(huán)，從而抑制能量和生長(zhǎng)物質(zhì)的供給。鹽堿脅迫（SA）處理HH49幼苗葉片蔗糖和淀粉含量以及蔗糖代謝酶活性均高于HN95，表明HH49具有更高的碳代謝及物質(zhì)儲(chǔ)備和供給能力。而外源MT處理可以顯著提高鹽堿脅迫下兩個(gè)大豆品種葉片磷酸蔗糖合酶、酸性轉(zhuǎn)化酶、中性轉(zhuǎn)化酶活性，促進(jìn)碳水化合物循環(huán)，增加可溶性糖含量，從而反饋調(diào)節(jié)，緩解積累物質(zhì)淀粉的分解。

綜上所述，葉面噴施MT通過(guò)提高鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片的抗氧化防御能力，降低葉片中的活性氧積累，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)植物生理代謝調(diào)控的影響。同時(shí)，外源MT通過(guò)調(diào)控鹽堿脅迫下大豆幼苗葉片葉綠素合成和分解相關(guān)基因的表達(dá)，增加葉綠素含量，提高葉片的光能捕獲和電子傳遞能力，增強(qiáng)植物光合能力，促進(jìn)碳代謝和光合產(chǎn)物的運(yùn)輸與分配。

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