板栗2-ODD基因家族的鑒定及其在干旱脅迫下的表達分析

Identification of Chinese Chestnut -ODD Gene Family and Their Expression Analysis under Drought Stress

Zeng Yangjuan ^1，2，3 ，Yang Yong23，GuoJianghu2，ZhangHai'e2，CaFe （1.Collegeof HorticulturalScienceandTechnology，Hebei Nrmal UniversityofScienceandTechnology，inhuangdao066004， China;2.Enginering Research Centerof Chestnut Industry Technology，Ministryof Education，Qinhuangdao O66004，China; 3.KeyLaboratoryof CharacteristicHorticultural Germplasm Miningand Innovative Utilizationof HebeiProvince，Qinhuangdao 066004，China;4. Hebei Province Chestnut Industry Collaborative Innovation Center， Qinhuangdao O66004，China）

AbstractThe 2-ODD gene family is the second largest enzyme family in the plant and has an important role in regulating plant response to stresses.Using bioinformatics methods，we identified 123 Cm2-ODD genes from the chestnut genome，their chromosomal location，protein physicochemical properties，conserved motifs， gene structure，collinear genes and cis-acting elements，and the expresson under drought stress were analyzed. The results found that all the Cm2 -ODD family proteins contained the conserved 2OG-Fe II _Oxy and DIOX_N domains，and were hydrophilic proteins. Most members of Cm2-ODD gene family had conserved motifs of Motif 1 to Motif 9，and only a part members had Motif 10，indicating that the function of Cm2-ODD proteins might be relatively conserved.Collinearity analysis found that the Cm2-ODD family genes within the chestnut genome might be under purifying selection，and a masive replication of the 2-ODD gene family might occur after the diferentiation of monocotyledonous and dicotyledonous plants.Codon preference analysis showed that Cm2-ODD family genes preferred to end with A or U.The result of cis-acting element analysis showed that Cm2-ODD family genes contained more abscisic acid and drought response elements，speculating that its function might be asociated with drought stress.Meanwhile，transcriptome analysis proved that the expresion levels of 13 members of the Cm2-ODD gene family were significantly affcted by drought stress，among which， the expresson of Cm2-ODD19 and Cm2-ODD16 genes was up-regulated.

KeywordsChinese chestnut； Cm2-ODD gene family； Bioinformatics analysis；Drought stress； Geneexpression

板栗（Castaneamollissima）屬于殼斗科（Fa-gaceae）栗屬（Castanea）多年生木本植物，是我國重要的木本糧食[1-2]，果實富含大量營養(yǎng)成分[3]，一直深受國內(nèi)消費者的喜愛[4]。近年來，隨著國際市場對板栗消費的增長，板栗產(chǎn)量已經(jīng)無法滿足市場需求，如何提高產(chǎn)量成為目前生產(chǎn)上的重點問題[4-5]。但我國板栗樹主要生長在土壤貧瘠的山坡地帶，常常面臨各種逆境脅迫，尤其以干旱脅迫最為常見[6]，嚴重影響其產(chǎn)量。

2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-oxoglutaratedependentdioxygenase，2-ODD）是植物中最為常見的酶蛋白之一[7]。2-ODD蛋白擁有兩個主要結構域，分別是碳末端的 2OG-FeⅡ_Oxy（PF03171）結構域與氮末端的DIOX_N（PF14226）結構域[8]。2-ODD 蛋白可分為3個亞家族，分別是DOXA、DOXB與DOXC，其中DOXC亞家族的成員與植物萜類、生物堿、黃酮類等物質(zhì)的形成通路密切相關，黃酮醇合成酶（fla-vonalsynthase，F(xiàn)LS）黃烷酮3-羥化酶（flavanone -3- hydroxylase，F(xiàn)3H）和花青素合成酶（anthocyanidinsynthase，ANS）均屬于 DOXC 亞家族成員[7，9]2-ODD蛋白參與植物許多重要的代謝通路，直接影響植物的生長發(fā)育，而且許多2-ODD蛋白也已經(jīng)被報道影響植物對冷害、干旱、鹽害、重金屬脅迫的響應[10]，如在擬南芥中，異源表達南極黃絲瓜蘚的2-ODD1可以提高擬南芥的抗旱性[11]，異源表達四翅濱藜的F3H可以提高擬南芥抵御鹽和干旱脅迫的能力[12]，異源表達小麥FLS1可以通過促進氣孔關閉來提高擬南芥的抗旱能力[13]

隨著測序技術的不斷發(fā)展，已經(jīng)在許多植物中鑒定了2-ODD基因家族，其中在煙草中鑒定出131個該家族成員[10]，在擬南芥和丹參中也均鑒定出超過130個的該家族成員[14]。但目前板栗中尚無此類報道。因此，本研究基于板栗基因組進行2-ODD基因家族鑒定，并分析其在板栗基因組上的分布、蛋白理化性質(zhì)、保守基序、密碼子偏好性等，以及通過轉錄組探究其在干旱脅迫下的表達情況，為今后利用分子生物學手段選育抗旱板栗新品種、提高產(chǎn)量奠定理論基礎

材料與方法

1.1 供試材料及其處理

以在營養(yǎng)土中盆栽的板栗‘燕寶'實生苗為試驗材料。前期正常澆水管理，每7d澆一次水，4個月后停止?jié)菜M行干旱脅迫處理，對照組仍正常澆水。干旱處理60d后、處理組葉片發(fā)生明顯失綠時進行葉片采樣，樣品用液氮冷凍后送樣至武漢邁特維爾生物科技有限公司進行轉錄組測序。

1.2板栗2-ODD基因家族成員的鑒定

從國家生物信息中心（https：//ngdc.cncb.ac. ）下載板栗基因組文件與注釋文件[15]，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載2-ODD蛋白保守結構域 hmm 文件（PF03171、PF14226）。利用TBtools軟件[16在SimpleHMMSearch界面下搜索含有兩個保守結構域的所有蛋白序列，取其交集，按照搜索結果手動去除結構域不完整的蛋白序列，上傳至 NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù) 據(jù)庫[17]、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫和Pfam數(shù)據(jù)庫進一步確認是否包含保守結構域[18-19]，最終保留下來的即 Cm2–ODD 基因家族成員

1.3 板栗2-ODD基因家族染色體定位

使用TBtools軟件從板栗基因組注釋文件中提取 Cm2-ODD 基因家族成員的染色體位置信息，按照位置排序，對其進行 Cm270DDI 至 Cm2- ODD123的命名，并繪制其在染色體上的分布圖[16] 。

1.4板栗2-ODD家族系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA7對123條 Cm2-ODD 蛋白序列進行多序列比對，然后利用TBtools軟件的Tri-mAL對序列進行比對后修剪[16]，去除高度不一致的部分，最后利用IQ-TREE采用最大似然法進行基因家族系統(tǒng)進化樹構建[20]，Bootstrap 值設置為1 000，最后利用ChiPlot（https：//www.chiplot.on-line）對進化樹進行美化[21] O

1.5 板栗2-ODD家族蛋白理化性質(zhì)分析

使用 Expasy protParam 在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析板栗 Cm2-ODD 家族蛋白的氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等指標[22] O

1.6 板栗2-ODD基因家族成員保守序列和結構分析

利用MEME 在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/）對Cm2-ODD基因家族成員保守序列進行分析，獲得前10 的保守基序[23]。利用TBtools軟件對保守基序進行展示，同時根據(jù)板栗基因組注釋文件對基因結構進行展示[16]。將保守基序上傳InterProScan（https：//www. ebi.ac.uk/interpro/a-bout/interproscan/）在線網(wǎng)站進行注釋[24] 。

1.7板栗2-ODD基因家族的基因組內(nèi)共線性分析以及與其他物種間的共線性分析

在Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫（https：//plants.en-sembl.org/）下載擬南芥和水稻基因組文件與注釋文件，利用MCScanX軟件[25]對板栗基因家族進行基因組內(nèi)共線性分析，同時進行板栗與擬南芥、板栗與水稻的基因組間共線性分析，最后利用TBtools軟件對結果進行可視化，并顯示出2-ODD基因家族的共線性基因?qū)ξ恢?。板栗基因組內(nèi)Cm2–ODD 基因家族共線性基因?qū)Φ?Ka/Ks （非同義替換率/同義替換率）通過TBtools軟件計算得到[16] 。

1.8 板栗2-ODD基因家族啟動子上順式作用元件分析

利用TBtools軟件對 基因家族啟動子 2000bp 序列進行截取[16]，上傳至PlantCARE在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）進行順式作用元件預測[26] O

1.9 板栗2-ODD基因家族密碼子偏好性分析

利用軟件CodonW1.4.2與EMBOSS計算 Cm2- ODD基因家族同義密碼子相對使用度（relativesynonymouscodonusage，RSCU）、有效密碼子數(shù)（effectivenumberofcodon，ENC）、密碼子第1＼～3位堿基GC含量（ GC1，GC2，GC3） 、同義密碼子第3位堿基GC含量（GC3s），根據(jù)各個氨基酸的RSCU值繪制熱圖，同時根據(jù)公式 ENCexp=2+ 計算出理論ENC值，以GC3s為橫坐標、ENCexp為縱坐標繪制標準曲線，同時繪制ENC-plot圖[27]。當實際ENC值與ENCexp接近時，說明基因的密碼子使用偏好性主要受到突變影響；當實際ENC 值與ENCexp遠離時，說明基因的密碼子使用偏好性主要受到自然選擇壓力影響[28]

中性繪圖是以GC12（密碼子第1位與第2位GC含量的平均值）為縱坐標，以GC3為橫坐標，繪制散點圖并進行直線擬合。當回歸系數(shù)接近1時表示GC12與GC3相關性高，密碼子3個位置堿基變異模式相似，表明決定 Cm2-ODD 基因家族密碼子使用偏好性的主要因素是突變壓力，反之則是自然選擇壓力[29]

1.10 板栗2-ODD基因家族干旱脅迫下的表達模式分析

利用轉錄組測序分析干旱脅迫下 Cm2-ODD 基因家族成員表達量的變化情況。樣品由武漢邁特維爾生物科技有限公司經(jīng)過RNA抽提、純化、建庫之后，采用二代測序技術基于Illumina測序平臺對文庫進行雙端測序。利用HISAT2軟件（http：//ccb. jhu. edu/software/hisat2/index.shtml）將過濾后的Reads比對到板栗參考基因組上，最后采用 FPKM（fragments per kilobase of transcriptpermillionfragmentsmapped）作為基因表達量的指標。將表達倍數(shù)（FoldChange）變化超過兩倍且FDR值低于0.05的基因定義為差異表達基因，通過TBtools軟件繪制 Cm2-ODD 基因家族成員的表達量熱圖[16] O

2 結果與分析

2.1 板栗2-ODD基因家族成員的染色體分布及命名

本研究從板栗基因組中共鑒定出123個 Cm2-ODD基因，它們不均勻地分布在12條染色體以及兩個未被組裝到染色體的大片段上，按照在染色體上的位置將其分別命名為Cm2-0DD1—Cm2-ODD123。Cm2-0DD基因家族成員的染色體分布如圖1所示。

2.2 板栗2-0DD家族系統(tǒng)進化樹構建

對123個 基因的蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹構建，結果如圖2所示，可以將其分為6組，其中，group1含有9個家族成員，group2含有14個家族成員，group3含有12個家族成員，group4含有27個家族成員，group5含有28個家族成員，group6含有33個家族成員。每個小組內(nèi)的成員間親緣關系較近。

2.3 板栗2-ODD家族蛋白理化性質(zhì)

如表1所示，123個 Cm2-ODD 家族蛋白中，蛋白序列最短的是 Cm2-ODD95 ，由275個氨基酸組成，分子量最小，為 30639.17Da ;蛋白序列最長的是 Cm2-ODD62 ，由548個氨基酸組成，分子量最大，為 61483.86Da 。 Cm2-ODD 家族蛋白的等電點為 4.94～8.99 ，其中有7個成員的等電點超過7，其余均小于7，說明大多數(shù) Cm2-ODD 蛋白是酸性蛋白。 Cm2-ODD 家族蛋白不穩(wěn)定系數(shù)在23.63～59.20 之間，有59個家族成員的不穩(wěn)定系數(shù)超過40，是不穩(wěn)定蛋白。 Cm2-ODD 家族蛋白的脂肪族指數(shù)為 72.15～98.01 ，平均親水系數(shù)為-0.673～-0.105 ，均是親水性蛋白。同時對各組之間的理化性質(zhì)進行比較分析，結果如圖3所示，可以看出，各組蛋白的氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)比較接近，而等電點、脂肪族指數(shù)、平均親水系數(shù)相差較大。

2.4板栗2-ODD基因家族的保守基序和結構分析

如圖3所示，絕大部分 Cm2-ODD 基因家族成員都擁有Motif1至Motif9保守基序，但僅部分成員擁有Motif10；大部分成員的基因長度小于10000bp ，只有 Cm2-ODD57 長度超過30000bp。對各Motif的保守序列進行進一步分析發(fā)現(xiàn)，Motif1（ PGALVVNIGDQJZIJSNGKYKSVEHRV-LVNS-EKE）和 Motif2（VNYYPPCPZPDLTLGLG-PHSD）皆為2OG-FeⅡ_Oxy結構域序列，而Motif3（ACEEWGFFQVINHGV）為DIOX_N結構域序列。

2.5 板栗2-ODD基因家族的基因組內(nèi)共線性分析以及與其他物種間的共線性分析

對 Cm2–ODD 基因家族成員進行板栗基因組內(nèi)共線性分析，共發(fā)現(xiàn)紅色曲線連接的11對片段復制基因和29對串聯(lián)重復基因（圖5）。進一步計算這11個片段復制基因?qū)εc29個串聯(lián)重復基因?qū)Φ腒a/Ks值（表2），發(fā)現(xiàn)片段復制基因?qū)χ谐?對未得出計算值（NaN）外，其余10對的Ka/Ks 值為 0.082～0.257 ，而29個串聯(lián)重復基因?qū)Φ?Ka/Ks 值為 0.145～0.699 ，表明 Cm2–ODD 基因家族正在經(jīng)歷純化選擇分別對擬南芥與板栗、水稻與板栗基因組間的2-ODD基因家族共線性基因?qū)M行鑒定，結果如圖6所示，其中棕色曲線表示物種間的共線性藍色標記基因為片段復制基因，黃色標記基因為串聯(lián)重復基因，綠色標記基因同時為串聯(lián)重復與片段復制基因。紅色曲線連接的是Cm2-0DD基因家族共線性基因?qū)Α?/p>

2-ODD基因?qū)??？梢钥闯?，板栗與擬南芥擁有較多的共線性2-ODD基因?qū)?，而與水稻擁有較少的共線性2-ODD基因?qū)?，這可能是因為植物2-ODD基因家族的大量復制發(fā)生在單、雙子葉植物分化之后。

2.6 板栗2-ODD基因家族啟動子順式作用元件分析

對 Cm2–ODD 基因家族成員 2000bp 啟動子區(qū)的順式作用元件進行分析，結果（圖7）顯示，共得到2859個順式作用元件，每個基因的啟動子上都有光響應元件，總計1422個，另外還有激素響應元件712個、逆境響應元件495個以及生長發(fā)育相關元件230個，其中對脫落酸和干旱脅迫響應的元件分別有237個和136個。表明Cm2-ODD基因與干旱脅迫密切相關。

對 Cm2-ODD 基因家族的RSCU值進行分析，結果如圖8所示。除去3個終止密碼子外，RSCU 值低于1的密碼子有30個，其中有12個密碼子以C結尾，9個密碼子以G結尾，6個密碼子以A結尾，3個密碼子以U結尾；RSCU值等于1的密碼子有4個，分別為AUG、UGG、UUC及UUU;RSCU值大于1的密碼子有27個，其中有12個密碼子以U結尾，8個密碼子以A結尾，4個密碼子以G結尾，3個密碼子以C結尾。RSCU值大于1代表密碼子使用頻率相對較高，其中精氨酸（Arg）的密碼子AGG的RSCU值最高，達到Ala：丙氨酸;Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Asp：天冬氨酸;Cys：半胱氨酸； Gln ：谷氨酰胺； Glu ：谷氨酸;Gly：甘氨酸;His：組氨酸；Ile：異亮氨酸;Leu：亮氨酸;Lys：賴氨酸;Met：甲硫氨酸；Phe：苯丙氨酸； Pro ：脯氨酸；Ser：絲氨酸；Thr：蘇氨酸；Trp：色氨酸；Tyr：酪氨酸;Val：氨酸。

了1.97，其次是Arg的密碼子AGA，為1.86，說明 基因家族中使用頻率較高的密碼子偏好以A或U結尾。

通過ENC-plot與中性繪圖分析可以判斷Cm2–ODD 基因家族的密碼子偏好性是受突變壓力還是自然選擇壓力的影響更大。由圖9可以發(fā)現(xiàn)， Cm2-ODD 基因家族的成員實際ENC值與期望ENC值有較大差異，且實際ENC值小于期望ENC 值，而同時GC12與GC3相關性較弱，所以推測 Cm2–ODD 基因家族的密碼子偏好性受自然選擇壓力的影響更大。

2.8 板栗2-ODD基因家族干旱脅迫下的表達情況

為了探究干旱脅迫對 基因家族成員表達的影響，對干旱脅迫 60d 后的板栗幼苗葉片進行了轉錄組測序，結果（圖10A）發(fā)現(xiàn)，共有1249個基因差異表達，其中上調(diào)表達的有293個，下調(diào)表達的有956個。同時發(fā)現(xiàn)共有101個 基因家族成員在板栗葉片中表達，其中差異表達的有13個。通過熱圖（圖10B）可以發(fā)現(xiàn)，這13個差異表達的 Cm2-ODD 基因中，Cm2-ODDI9 和 Cm2-ODDI6 表達量在干旱脅迫時明顯上調(diào)。

圖10板栗葉片差異表達基因火山圖（A）及 Cm2–ODD 基因家族差異表達成員在干旱脅迫下的表達情況（B）

3討論與結論

2-ODD家族作為植物中第二大酶家族主要參與植物的氧化和羥基化反應[30]。已有研究證實2-ODD基因家族成員可以提高植物的抗旱性[11-13]。本研究從板栗基因組中鑒定出123個Cm2-ODD 基因，不均勻地分布于12條染色體及兩條未被組裝到染色體的片段上；系統(tǒng)進化分析可將其分為6個組，組內(nèi) Cm2-ODD 基因家族成員的序列相似度更高；蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，Cm2-ODD 蛋白序列長度多在 300～400bp 之間，且都是親水性蛋白，該結論與多數(shù)物種中的2-ODD 蛋白相似[31-32]；大多數(shù) Cm2-ODD 基因家族成員都含有保守基序Motif1—Motif9，但僅有部分成員含有Motif10；基因結構上，僅有一個成員的長度超過 30 000bp ，其余成員的長度均在10 000bp 以內(nèi)。

本研究還對 Cm2–ODD 基因家族進行了基因組內(nèi)的共線性分析，發(fā)現(xiàn)該家族包含11對片段復制基因和29對串聯(lián)重復基因，且這些共線性基因?qū)Φ?Ka/Ks 值均小于1，表明 Cm2-ODD 基因家族正在經(jīng)歷純化選擇。與擬南芥和水稻的基因組間共線性分析發(fā)現(xiàn)，2-ODD基因家族在雙子葉植物中的共線性基因?qū)^多，而在單子葉植物中的共線性基因?qū)^少，這可能是因為2-ODD基因家族的大量復制發(fā)生在單子葉和雙子葉植物分化之后。

密碼子偏好性分析結果顯示， Cm2-ODD 基因家族的密碼子偏好以A或U結尾。通過ENC-plot和中性繪圖分析推測， 基因家族的密碼子偏好性受自然選擇壓力的影響更大。

通過對 Cm2–ODD 基因家族啟動子的順式作用元件進行分析，發(fā)現(xiàn)了大量的脫落酸和干旱脅迫響應元件，表明 Cm2-ODD 基因可能與別的物種中的2-ODD基因具有類似的抗旱功能。因此，本研究進一步利用轉錄組來分析 Cm2-ODD 基因家族成員在干旱脅迫下的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)有13個 Cm2-ODD 基因差異表達，其中 Cm2- ODD19和 Cm2-ODDI6 在干旱脅迫后明顯上調(diào)表達。

本研究采用生物信息學方法全面分析了123個 Cm2–ODD 基因家族成員，同時通過轉錄組研究發(fā)現(xiàn)了兩個在干旱脅迫下明顯上調(diào)表達的 基因家族成員，這可為今后深入分析板栗抗旱機制以及選育抗旱品種、提高產(chǎn)量奠定理論基礎。

參考文獻：

[1] 樊曉蕓，郭素娟，李艷華，等.板栗果實褐變度與總酚和總 黃酮的相關性研究[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版）， 2023，47（6） ：159-166.

[2] 張麗，郭素娟，孫慧娟，等.硼砂和蔗糖對板栗果實非結構 性碳水化合物含量的影響[J].果樹學報，2018，35（3）： 319-325.

[3] 魏源，王鳳春，丁田雨，等.板栗貯藏保鮮技術研究進展[J]. 中國果菜，2022，42（9）：21-24，84.

[4] 何忠偉，郭君平，桂琳，等.北京板栗市場預測及對策[J]. 農(nóng)業(yè)展望，2011，7（11）：22-24，29.

[5] 安玉發(fā)，劉紅禹，曹新星.世界板栗的貿(mào)易格局分析［J]．國 際貿(mào)易問題，2005（3）：21-25.

[6] 趙爽，葛朝紅，閔卓，等.干旱脅迫對不同板栗品種葉片保 水力的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2021（2）：28-32.

[8]Deng Y X，Li C L，Li H Q，et al. Identification and characterization of flavonoid biosynthetic enzyme genes in Salvia miltiorrhiza（Lamiaceae）［J]. Molecules （Basel，Switzerland）， 2018，23（6） ：1467.

[9]秦曉靜，胡佳棟，房振西，等.基于轉錄組測序的白鼠尾草 2-0DD基因家族鑒定與表達分析[J].藥學學報，2022，57 （ 12） ：3675-3685.

[10] Wei S，Zhang W，F(xiàn)u R，et al. Genome-wide characterization of 2-oxoglutarate and Fe（II ）-dependent dioxygenase family genes in tomato during growth cycle and their roles in metabolism[J]. BMC Genomics，2021，22：126.

[11］姚行浩.南極黃絲瓜蘚（Pohlia nutans）2-酮戊二酸依賴性 雙加氧酶基因 PnODDI 在植物抗逆中的作用[D].濟南：山 東大學，2019.

［12］王貝貝.四翅濱藜類黃酮合成關鍵酶編碼基因的克隆及功 能分析[D].蘭州：蘭州大學，2021.

［13］李偉.小麥類黃酮合成途徑基因TaFLS1與TaANS1的逆境 應答機制研究[D].濟南：山東大學，2011.

[14] Xu Z C，Song J Y. The 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase superfamily participates in tanshinone production in Salvia miltiorrhiza[J]. Journal of Experimental Botany，2017，68（9）： 2299-2308.

[15]Wang JP，Tian S L，Sun X L，et al. Construction of pseudomolecules for the Chinese chestnut （Castanea molissima） genome [J].G3：Genes，Genomes，Genetics（Bethesda），2020，10 （ 10） ：3565-3574.

[16]Chen C J，Wu Y，Li JW，et al. TBtools-II ：a“one for all，all for one”bioinformatics platform for biological big-data mining [J].Molecular Plant，2023，16（11） ：1733-1742.

[17]Wang JY，Chitsaz F，Derbyshire M K，et al. The conserved domain database in 2023[J]. Nucleic Acids Research，2023，51 （D1） ：D384-D388.

[18]Letunic I， Khedkar S，Bork P. SMART： recent updates， new developments and status in 202O[J]. Nucleic Acids Research， 2021，49（D1）： D458-D460.

[19]Mistry J，Chuguransky S，Williams L，et al. Pfam： the protein families database in 2O21[J].Nucleic Acids Research，2021， 49（D1） ：D412-D419.

[20]Nguyen L T，Schmidt H A，Von Haeseler A，et al. IQ-TREE：a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximumlikelihood phylogenies[J].Molecular Biologyand Evolution， 2015，32（1） ：268-274.

[21] Xie JM，Chen YR，Cai G J，et al. Tree Visualization By One Table（tvBOT）：a web application for visualizing，modifying and annotating phylogenetic trees[J]. Nucleic Acids Research， 2023，51（W1） ：W587-W592.

[22]Bidkar AP，Thakur KK，Bolshette N D，et al. In-silico structural and functional analysis of hypothetical proteins of Leptospira interrogans[J].Biochemistryamp;Pharmacology，2O14，3：136.

[23]Bailey TL，Johnson J，Grant CE，et al.The MEME suite[J]. NucleicAcidsResearch，2015，43（W1）：W39-W49.

[24]Quevillon E，Silventoinen V，Pillai S，et al. InterProScan：protein domains identifier[J]. Nucleic Acids Research，2Oo5，33： W116-W120.

[25]WangYP，TangHB，DeBarry JD，et al.MCScanX：a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity[J].NucleicAcidsResearch，2012，4O（7）：e49.

[26]Lescot M，Dehais P，Thijs G，et al.PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elementsand a portal to tools forin silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（1） ：325-327.

[27]Wright F.The‘effective number of codons’used in agene[J]. Gene，1990，87（1） ：23-29.

[28］沈蓮文，田金紅，王玉昌，等.2種玉蘭屬植物葉綠體基因組 密碼子偏好性分析[J].西南林業(yè)大學學報（自然科學）， 2023，43（2）：44-53.

［29］胡莎莎，羅洪，吳琦，等.苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛性 分析[J].分子植物育種，2016，14（2）：309-317.

[30]Wang Z，WangSS，Wu MZ，et al.Evolutionary and functional analyses of the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase genes involved in the flavonoid biosynthesis pathway in tobacco[J]. Planta，2019，249：543-561.

[31]WangJY，ZhangCH，LiYS.Genome-wide identificationand expression profiles of13 key structural gene families involved in thebiosynthesis of rice flavonoid scaffolds[J]. Genes（Basel）， 2022，13（3）：410.

[32]Kou M，Li C，Song WH，etal.Identification and functional characterization of a flavonol synthase gene from sweet potato [Ipomoea batatas（L.）Lam.][J].Frontiers in Plant Science， 2023，14：1181173.