基于重測(cè)序的開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）遺傳多樣性分析

Genetic Diversity Analysis of Kainong Series Peanut Varieties （Lines） Based on Whole-Genome Resequencing

Guo Minjie1，Deng Li1，Miao Jianli’，Luo Feng2，Yin Junhua’，Sun Yigen3，Xiao Ting3，Ren Li （1. Kaifeng Research Academy of Agriculture and Forestry， Kaifeng 475004， China; 2. Henan Provincial Seed Industry Development Center， Zhengzhou 45Oo0o， China ; 3. Kaifeng Municipal Seed Industry Development Center， Kaifeng 475004，China）

AbstractIn this study，a total of 30 Kainong series peanut varieties （lines）derived from O317 combination（Kainong 30× Kaixuan O16） with larger promotion areas were used as materials， and the genetic similarity analysis，population structure analysis and cluster analysis based on the second-generation whole genome resequencing data were conducted，in order to provide basic materials and visual technical references for efficient utilization of peanut germplasm resources in China.The results showed that after data control，423 149 high-quality single nucleotidepolymorphism（SNP）sites were obtained that were evenly distributed on the chromosomes.Among them，chromosome 3 had the most SNP sites and chromosome 10 had the least，accounting for 8.56% and 2.66% of the total，respectively. There were 435 genetic similarity coefficient values between diferent peanut varieties （lines）ranging from O.55 to 0.96，and the average value was O.73.The highest genetic similarity coefficient （0.96）was between Kainong 301 and Kainong 3O6，showing the closest genetic relationship.The lowest genetic similarity coeficient （O.55）was between Kainong 176 and Kainong 100， showing the farthest genetic relationship.Through population structure analysis，the 3O peanut varieties （lines） were divided into three subgroups，accounting for 30.00% ， 33.33% and 36.67% of the total， respectively.Among which，the genetic backgrounds of Kainong 99 and Kainong 65 were relatively complex.The cluster analysis results showed that the result from population genetic heatmap of the 3O peanut varieties （lines）was consistent with that from evolutionary tree；the 3O peanut varieties （lines）were divided into three groups；combined with the pedigree relationships，it was found that varieties bred from the same combination might not necessrily clustered in the same group. In conclusion，the genetic similarity among the 3O peanut varieties（lines）in this study was relatively high，so the genetic basis should be broadened.In the process of excellent peanut varieties breeding，it might be posible to comprehensively analyze pedigree and SNP-based clustering results for screening germplasm resources.

KeywordsPeanut; Germplasm resources ; O317 combination; Single nucleotide polymorphism; Genetic diversity

中國(guó)是世界上花生第一生產(chǎn)大國(guó)，2017—2021年間，我國(guó)花生平均每年總產(chǎn)1764.90萬(wàn)噸，占世界花生總產(chǎn)的 34.42% ，單產(chǎn)是世界平均的2倍[1]。盡管我國(guó)花生以油用為主，但是當(dāng)前國(guó)產(chǎn)食用植物油供給嚴(yán)重不足，大量依賴進(jìn)口[2]，選育高產(chǎn)花生新品種仍是我國(guó)花生育種的主導(dǎo)方向。開(kāi)農(nóng)系列花生品種在我國(guó)花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)程中做出了較大的貢獻(xiàn)，自1958年以來(lái)，以高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)為目標(biāo)開(kāi)展花生育種工作，通過(guò)創(chuàng)制出的0317組合（開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016）育成了包括開(kāi)農(nóng)1715、開(kāi)農(nóng)71、開(kāi)農(nóng)1760^[3] 在內(nèi)的一大批優(yōu)異花生品種，其中開(kāi)農(nóng) 71入選2022年全國(guó)糧油生產(chǎn)主導(dǎo)品種

傳統(tǒng)的作物遺傳多樣性分析多依賴表型數(shù)據(jù)[4-9]，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等為代表的基于分子標(biāo)記開(kāi)展遺傳多樣性分析的技術(shù)愈趨成熟[10-11]，白冬梅等[12]、王潤(rùn)風(fēng)等[13]利用 SSR引物分別評(píng)價(jià)了山西省和我國(guó)南方花生品種的遺傳多樣性。近年來(lái)，栽培花生基因組完成了測(cè)序工作[14-16]，依靠單核苷酸多態(tài)性（SNP）進(jìn)行遺傳背景分析顯得更為高效、可靠。然而，有關(guān)花生遺傳多樣性的研究仍然主要停留在表型和第一代、第二代分子標(biāo)記上，基于第三代分子標(biāo)記SNP的花生遺傳多樣性研究鮮有報(bào)道。為全面了解開(kāi)農(nóng)系列花生品種中不同材料之間的遺傳關(guān)系，本研究利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)高油酸骨干親本開(kāi)選016衍生的且在目前市場(chǎng)上推廣面積較大的30份花生品種（系）進(jìn)行深度為 10× 的重測(cè)序，并基于SNP數(shù)據(jù)開(kāi)展遺傳相似性、群體結(jié)構(gòu)、聚類等方面的遺傳多樣性分析，結(jié)合系譜分析更加全面地了解開(kāi)農(nóng)系列花生主推品種間的遺傳關(guān)系，為作物群體遺傳背景分析提供科學(xué)、有效的方法，更為我國(guó)花生種質(zhì)資源的利用和育種提供技術(shù)依據(jù)

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及概況

本試驗(yàn)所用30份開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）為近年2003年配置的第17個(gè)組合（0317：開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016）的衍生材料（表1），產(chǎn)量表現(xiàn)穩(wěn)定。試驗(yàn)于2019年在河南省開(kāi)封市杏花營(yíng)鎮(zhèn)試驗(yàn)田進(jìn)行，試驗(yàn)地為沙質(zhì)壤土。每個(gè)品種（系）種植1行（ （6.67m） ，單粒播種，穴距20cm ，各品種（系）行間距 40cm 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA 提取取生長(zhǎng)3周的花生嫩葉組織約0.5g ，用CTAB法[17]提取基因組DNA。使用濃度為1% 的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品濃度與純度，用Qubit熒光計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行精確定量，將無(wú)污染且濃度介于 10～100ng/μL 之間的合格樣品于 -20^°C 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2二代重測(cè)序30 份花生的 DNA 樣品由北京諾禾致源科技股份有限公司利用IlluminaNo-vaSeq平臺(tái)進(jìn)行二代重測(cè)序，測(cè)序深度為 10× ，高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列。

1.2.3 質(zhì)控條件將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到花生參考基因組Tifrunner[18]上，對(duì)SNP進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控后分別利用BWA軟件[19]和SAMtools軟件[20]進(jìn)行比對(duì)和檢測(cè)。將SNP進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾條件：測(cè)序深度 ?3 、SNP位點(diǎn)在樣品中的缺失率 ?0.2 次等位基因頻率 ?0.05 ，對(duì)獲得高質(zhì)量的SNP進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Plink1.9軟件[21]進(jìn)行品種（系）間遺傳相似性分析，使用admixture軟件[22-23]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，使用R語(yǔ)言軟件的cluster[24]進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 30份花生品種（系）的系譜分析

系譜是識(shí)別品種（系）來(lái)源的直觀圖。從圖1看出，30份花生品種（系）中直接由0317組合（開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016）選育的品種（系）有13個(gè)，分別為G4、G7、G8、G10、G12、G13、G19、G20、G22、G25、G27、G28、G29，占總數(shù)的 43.33% 。G14和G17、G11和G3、G9和G24各自由同一組合選育而成，G9、G24、G30、G23、G6的父母本均來(lái)自于0317組合。G1為開(kāi)農(nóng)30，是0317組合的母本材料，G21由K9508-1和開(kāi)選016配置組合育成，與開(kāi)選016的親緣關(guān)系系數(shù)為0.5。

2.230份花生品種（系）的DNA濃度及測(cè)序質(zhì)量從表2可知，30份花生的DNA濃度介于15.41～57.21ng/μL 之間，平均為 31.14ng/μL ，樣本質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且總量滿足建庫(kù)需要與參考基因組相比，堿基的Q20（錯(cuò)誤率 1% 以下）介于 96.03%～97.90% 之間，平均為 97.36% ;Q30（錯(cuò)誤率 1‰ 以下）介于 89.68%～94.18% 之間，平均為 92.57% 。測(cè)序錯(cuò)誤率低，則堿基質(zhì)量高。

GC含量分布用于檢測(cè)有無(wú)AT、GC分離現(xiàn)象，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，A和T的比例應(yīng)該接近，C 和G的比例也應(yīng)該接近。統(tǒng)計(jì)測(cè)序堿基 A，T C、G、N的含量分布發(fā)現(xiàn)，GC含量在 36.34%～ 39.14% 之間，平均為 37.69% 。綜上可知，30份花生品種（系）的測(cè)序質(zhì)量較高，遺傳多樣性分析可靠性高。

2.3 30份花生品種（系）的SNP位點(diǎn)分布及多樣性分析

基于高通量二代重測(cè)序?qū)?0份花生品種（系）進(jìn)行基因組測(cè)序，與參考基因組Tifrunner比對(duì)，過(guò)濾質(zhì)控后獲得423149個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，平均 1Mb 含有169個(gè)SNP位點(diǎn)（圖2）。其中，3號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)最多，為36236個(gè)，占總數(shù)的 8.56% ，其次是4號(hào)、18號(hào)、1號(hào)、9號(hào)、14號(hào)、2號(hào)、5號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、17號(hào)、7號(hào)、6號(hào)、16號(hào)、20號(hào)、19號(hào)、15號(hào)、11號(hào)、8號(hào)、10號(hào)，10號(hào)染色體上的 SNP位點(diǎn)最少，為11269個(gè)，占總數(shù)的 2.66% 。SNP位點(diǎn)在染色體上的分布較為均勻，差異不明顯，這些SNP位點(diǎn)將用于30份開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）的遺傳多樣性分析。

2.430份花生品種（系）的遺傳相似性分析

遺傳相似性系數(shù)可以反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系，是衡量品種間相似程度的重要指標(biāo)[25]。利用SNP分子標(biāo)記計(jì)算得出，30份開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）間存在435個(gè)遺傳相似性系數(shù)值（表3），取值范圍為 0.55～0.96 ，平均值為0.73。G29（開(kāi)農(nóng)301）和G27（開(kāi)農(nóng)306）的遺傳相似性系數(shù)最高為0.96，遺傳關(guān)系最近，二者均來(lái)自于0317組合（開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016）；G20（開(kāi)農(nóng)176）和G18（開(kāi)農(nóng)100）的遺傳相似性系數(shù)最低為0.55，二者的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。其原因是開(kāi)農(nóng)176由開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016選育而成，開(kāi)農(nóng)100由秋樂(lè)花 177× 花育50號(hào)選育而成，親本間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)

另外，通過(guò)可視化作圖讓品種（系）之間的遺傳相似性系數(shù)直觀展示（圖3），遺傳相似性系數(shù)的色階變化基本為白色-淺紅色-深紅色，系數(shù)值均在0.50以上，顏色越深，親緣關(guān)系就越近，反之親緣關(guān)系就越遠(yuǎn)。G10、G11、G12和G13這4個(gè)品種（系）間的親緣關(guān)系系數(shù)最近， G10～G13 與G3＼～G6品種（系）間的親緣關(guān)系較近

2.530份花生品種（系）的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

將群體結(jié)構(gòu)分群K值設(shè)置為2＼～6，當(dāng) K=3 時(shí)，交叉驗(yàn)證誤差率最?。▓D4A），所以30份花生品種（系）的最佳分群K值為3，此時(shí)最接近群體遺傳結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況

圖4B中，橫坐標(biāo)為花生品種（系）的ID，縱坐標(biāo)Q值為材料在不同亞群中對(duì)應(yīng)的遺傳背景比重，可作為種質(zhì)資源的分群指標(biāo)，每個(gè)直方柱表示一個(gè)品種（系），每根柱的顏色代表遺傳組分的構(gòu)成[26]。30份花生品種（系）可分為3個(gè)亞群，分別是V1（紅色）、V2（綠色）和V3（藍(lán)色），亞群V1含有9份花生品種（系），占總數(shù)的 30.00% ，分別是 G9，G14，G15，G16，G30，G28，G29，G3，G5 ，其中G5（開(kāi)農(nóng)99）的Q值小于0.6，遺傳背景相對(duì)復(fù)雜；亞群V2含有10份花生品種（系），占總數(shù)的33.33% ，分別是 G1，G11，G13，G20，G24，G22，G6 G12、G10、G25；亞群V3含有11份花生品種（系），占總數(shù)的 36.67% ，分別是G17、G18、G19、G27，G4，G2，G21，G23，G26，G7，G8 ，其中G8（開(kāi)農(nóng)65）的Q值小于0.6，同時(shí)具有相對(duì)較多的亞群V1的遺傳背景。

2.6 30份花生品種（系）遺傳相似性系數(shù)的聚類分析

基于品種（系）間遺傳相似性系數(shù)，對(duì)30份花生品種（系）進(jìn)行遺傳熱圖分析（圖5A），并通過(guò)臨接法（NJ）構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)（圖5B）。群體遺傳熱圖中沿著中斜線出現(xiàn)3個(gè)深色區(qū)域，即表示分為3個(gè)類群：第一亞群（右上正方形）由G25、G20、G30、G21、G8、G29、G27、G7、G19組成，共9個(gè)品種（系），與進(jìn)化樹(shù)中的類群Ⅲ相吻合；群體遺傳熱圖中的第二亞群（左下正方形）由G17、G14、G15、G24、G23、G28、G2、G9、G22、G16、G26、G18組成，共12個(gè)品種（系），與進(jìn)化樹(shù)中的類群Ⅱ一致；群體遺傳熱圖中的第三亞群（中間正方形）由G3、G1、G6、G4、G12、G11、G5、G10、G13共9個(gè)品種組成，與進(jìn)化樹(shù)中的類群I一致。綜上，群體遺傳熱圖與進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致，均將30份品種（系）分為3個(gè)類群。

3討論與結(jié)論

種質(zhì)資源是作物遺傳改良和相關(guān)研究的基礎(chǔ)[27]?；ㄉN質(zhì)資源的分類和利用是花生育種工作的第一步。本研究中的0317組合（開(kāi)農(nóng) 30× 開(kāi)選016）的母本開(kāi)農(nóng) 30^[28] 是大果、高產(chǎn)花生品種，父本開(kāi)選 016^[29] 是小果、高油酸花生品種。本研究的30份開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）中有13個(gè)是由0317組合直接選育而成，另外17個(gè)品種（系）中除開(kāi)農(nóng)30和開(kāi)農(nóng)H03-3外，均由0317組合衍生而成，開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）及其衍生的優(yōu)異品種（系）被多家花生育種單位直接或間接利用。

本研究全基因組重測(cè)序深度為 10× ，覆蓋基因組超 90% ，與其他研究相比測(cè)序質(zhì)量高，SNP位點(diǎn)在染色體上的分布較為均勻，平均 1Mb 含有169個(gè)SNP位點(diǎn)，所以利用重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行群體遺傳多樣性分析可靠性高。品種（系）間遺傳相似性系數(shù)平均值為0.73，說(shuō)明該群體材料的親緣關(guān)系較近，這與它們均是0317組合的衍生材料有關(guān)，開(kāi)農(nóng)301和開(kāi)農(nóng)306的遺傳相似性系數(shù)最高，二者均是小果、高油酸花生品種，親本相同，表型差異主要集中在莢果腰深度上。開(kāi)農(nóng)176和開(kāi)農(nóng)100的遺傳相似性系數(shù)最低，二者雖然都是大果花生品種，但在表型、品質(zhì)方面差異較大。

群體結(jié)構(gòu)分析能夠明確該群體的分群合理性及個(gè)體遺傳組分的多少[24]。本研究中，30 份花生品種（系）被劃分為3個(gè)亞群，各亞群數(shù)量比接近1：1：1，Q值 lt;0.6 的品種有2個(gè)，占總數(shù)的 6.67% ，表明該群體的遺傳混雜程度較低，這說(shuō)明育種單位對(duì)優(yōu)良骨干親本品種的利用率過(guò)高，導(dǎo)致群體遺傳背景較為單一。聚類分析中基于品種（系）間遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行群體遺傳熱圖和進(jìn)化樹(shù)分析，二者結(jié)果完全吻合，30份品種（系）均分為3個(gè)類群。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析亞群和聚類分析類群相比，亞群V1[9個(gè)品種（系）]與類群Ⅱ有5個(gè)品種（系）相同，亞群V2（10個(gè)品種）與類群I有6個(gè)品種相同，亞群V3[11個(gè)品種（系）]與類群Ⅱ有5個(gè)品種（系）相同。綜上可知，群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析的分群結(jié)果基本吻合。

系譜分析與基于全基因組SNP的聚類分析發(fā)現(xiàn)，同一組合育成的品種（系）不一定會(huì)聚在一起，如0317組合的13份品種（系）在3個(gè)類群中均有分布，這與前人研究結(jié)果相一致[30-31]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，一方面是由于育種過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)定向選擇，在世代的選擇中往往會(huì)將重點(diǎn)集中在目標(biāo)性狀上，從而導(dǎo)致其他位點(diǎn)的丟失；另一方面是包含基因重組在內(nèi)的遺傳變異也會(huì)產(chǎn)生上述現(xiàn)象；最后還可能是品種（系）之間的遺傳基礎(chǔ)狹窄而沒(méi)有過(guò)多的外來(lái)基因交流導(dǎo)致的。所以今后在花生育種過(guò)程中，可綜合考慮系譜關(guān)系和聚類分析結(jié)果進(jìn)而做出選擇。

開(kāi)農(nóng)系列花生育種中高頻率使用相同骨干材料或其衍生材料做親本，導(dǎo)致育成的花生品種（系）遺傳基礎(chǔ)狹窄、多樣性水平低，但是不可忽視的是，開(kāi)農(nóng)系列花生品種（系）仍然存在一定的遺傳多樣性，它們?cè)诒硇汀⑵焚|(zhì)、產(chǎn)量方面有不同程度的差異表現(xiàn)。如：以開(kāi)農(nóng)1760為代表的小果、高油酸花生品種，以開(kāi)農(nóng)98為代表的大果、非高油酸花生品種等，這些品種的平均產(chǎn)量均在4 500kg/hm² 以上，為河南省乃至全國(guó)花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到重要推動(dòng)作用。在今后的育種工作中，一方面需擴(kuò)大親本利用范圍，拓寬親本遺傳基礎(chǔ)；另一方面要加強(qiáng)種質(zhì)資源的創(chuàng)新研究，采用多種育種方式相結(jié)合的方法，創(chuàng)制優(yōu)異中間材料，選育具有突破性的花生新品種。另外，雖然本研究的群體較小，但基于重測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)花生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析的方法同樣適用于較大群體的不同作物，該研究結(jié)果可為較大群體的相關(guān)研究提供參考。

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