河北楊PhMYB14基因的克隆及生物信息學分析

Cloning and Bioinformatics Analysis of PhMYB14 Gene in Populus hopeiensis

Pang Linlin，Zhang Qi，Dai Jinling，Bai Yu'e （College of Forestry， Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot O1Oo1O，China）

AbstractMYB transcription factors play important roles in plant growth and development in ways of interactions，signal transduction，and gene expresson regulation.In this study，using the seedlings of Populus hopeiensis as materials，PhMYB14 gene was cloned，its bioinformatic analysis was performed，and its tissuespecific expression in P . hopeiensis was analyzed. The results showed that the length of coding sequence （CDS） of PhMYB14 gene was 723bp ，encoding 240 amino acid residues. The PhMYB14 protein had the molecular weight of 27 512.87 Da and the theoretical isoelectric point of 5.17，and was an unstable hydrophilic protein with no signal peptide and transmembrane structure. Homologous sequence alignment and protein phylogenetic tree analysis showed that PhMYBl4 was the most closely related to Populus trichocarpa and Populus alba，both of which also belonged to the genus Populus，followed by Salix sinopurpurea and Salix suchowensis. Prediction of subcellular localization suggested that PhMYB14 was mainly locatted in chloroplasts.The promoter region of PhMYB14 contained various cis-acting elements including photoresponsive elements and methyl jasmonate response elements.Real-time fluorescence quantitative analysis （qRT-PCR） showed that PhMYB14 was expressed in the roots，stems and leaves of poplar seedlings with the highest expression level in leaves. The results of this study could provide a reference for further study of the functional mechanism of PhMYB14 in the resistance to diseases and insect pests of P . hopeiensis.

KeywordsPopulus hopeiensis ； PhMYB14; Gene Cloning； Bioinformatics; Expression analysis

轉錄因子（transcriptionfactor，TF），又稱為反式作用因子，可以與基因啟動子區(qū)域的順式作用元件相互作用，對轉錄過程起到抑制或激活作用，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育。MYB轉錄因子在植物中廣泛存在，是最大的轉錄因子家族之一[1]。MYB家族成員通常包含保守結構域，一般含有1＼～4個R結構重復序列，根據(jù)R結構重復序列的個數(shù)，可將其分為4個亞家族：1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB 和 4R-MYB^[2] 。1987年，在玉米中首次克隆得到了植物中第一個MYB轉錄因子基因ZmMYBC1，主要參與玉米花青素的合成[5]。之后在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹[3]、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea mays）等多種植物中發(fā)現(xiàn)多個MYB基因[4]

目前對MYB轉錄因子已有較為深入的研究，大多表明其在植物生長發(fā)育過程中調(diào)控多種途徑，且越來越多的證據(jù)支持MYB是植物育種與改良的潛力轉錄因子。已有研究顯示，R2R3-MYB亞家族中的許多成員參與調(diào)節(jié)鈣信號通路、代謝物合成、激素信號傳導、響應生物和非生物脅迫。MYB30可以通過調(diào)節(jié)鈣信號通路參與氧化和熱應激反應，缺乏MYB30蛋白的植物在 H₂O₂ 和熱刺激下表現(xiàn)出 cyt 的升高[6]。在轉基因植物中，MYB12的過表達可顯著增加類黃酮的積累，使植物對鹽脅迫和氧化脅迫等非生物脅迫的耐受性增強[7]。Hao等[8]研究發(fā)現(xiàn)McMYB4可以通過調(diào)節(jié)苯丙烷代謝和激素信號傳導調(diào)控蘋果的生長和抗性。在桑樹中，MbMYB306基因表達量的變化與桑椹中白藜蘆醇含量變化呈正相關，而與黃酮類化合物含量變化呈負相關，并且Mb-MYB306基因可以增強桑樹的抗病性[9]。過量表達擬南芥MYB28會增加脂肪族芥子油苷的合成量，同時加強水楊酸信號途徑、減弱茉莉酸信號途徑；過量表達擬南芥的MYB51會促進吲哚族芥子油昔的生成，但會減弱水楊酸信號途徑、增強茉莉酸信號途徑[10]。TaMYB28參與小麥蠟質(zhì)層的合成，影響蠟質(zhì)晶體的數(shù)量和形態(tài)，并且參與調(diào)控韌皮部防衛(wèi)反應，在小麥白粉病菌侵染和麥長管蚜取食中對抵御病原物入侵有正向調(diào)控作用[11]

楊樹為楊柳科楊屬喬木的統(tǒng)稱，大致可分為胡物派、大葉物派、日楊派、黑物派和青楊派。河北楊（Populushopeiensis）屬于楊屬白楊派，是毛白楊（P.tomentosa）和山楊（P.davidiana）的雜交種，是我國中原地區(qū)特別是黃河中游水土流失區(qū)、華北和西北地區(qū)重要的造林和園林綠化樹種，在我國北方地區(qū)廣泛種植，但受病蟲害影響較為嚴重。對楊樹MYB已有較多研究，發(fā)現(xiàn)MYB家族中的多個基因參與楊樹的木質(zhì)素合成、非生物脅迫、生物脅迫及抗病過程。如：MYB074[12]MYB93[13]及MYB6[14]等都參與楊樹木質(zhì)素的合成;PtrMYB17、PtrMYB96、PtrMYB139和PtrMYB162、PtrMYB164、PtrMYB168、PtrMYB185、PtrMYB212八個基因參與楊樹對干旱脅迫和鹽脅迫的響應[15」;在接種了病原菌的山新楊中過表達PdbMYB85基因，正向調(diào)控PdbLOX的表達，進而提高茉莉酸（jasmonicacid，JA）相關基因的表達，參與楊樹的抗病過程[1]；過表達PdMYB108的山新楊，在被奧氏蜜環(huán)菌侵染后，有發(fā)病癥狀明顯減輕的株系出現(xiàn)，并且其生長被促進，表明PdMYB108基因可以提高山新楊抗奧氏蜜環(huán)菌的能力[17]； R2R3-MYB 基因在雜交楊接種銹菌前后表達量差異顯著，說明該基因與楊樹抗病性有關[18]。研究還發(fā)現(xiàn)MYB14和MYB15對芪合成酶啟動子的正調(diào)控作用。植物在受到生物和非生物脅迫的時候會產(chǎn)生芪類化合物，白藜蘆醇是芪類化合物中的主要抗菌成分，能提高植物的抗病性[19]，是一種重要的植物抗毒素。芪類化合物通過苯丙氨酸次生代謝途徑合成[20]。我們根據(jù)先前獲得的河北楊轉錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MYB14可能參與河北楊的抗病過程，本研究從河北楊中克隆MYB14基因，利用生物信息學方法對其進行分析，同時對該基因在河北楊不同組織中的表達進行熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測分析，以期為深入研究PhMYB14在河北楊抗病蟲害中的作用機制提供參考。

材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為河北楊無菌組培苗，由農(nóng)業(yè)大學林木遺傳育種實驗室培養(yǎng)。使用MS培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，1/2MS培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光周期 16h 光照 ^′8h 黑暗、溫度（ 25± 1） ^°C 。于2023年8月采集長勢相近的葉片作為基因克隆材料，同時隨機取3株楊樹苗的根、莖、葉，采集后立即投入液氮速凍，于 -80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 河北楊PhMYB14基因克隆

采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPureUniversalPlantTotalRNAIsolationKit試劑盒提取河北楊葉片的總 RNA;通過 NanoDrop2000對RNA質(zhì)量檢測合格后，采用寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司的PrimeScriptTMRTMasterMix試劑盒（TaKaRa）將總RNA反轉錄成cDNA。以河北楊cDNA為模板，通過PCR擴增其編碼序列。PCR 擴增體系（ 50μL ） 2× Easy Taq PCR Su-perMix 25μL ，cDNA 模板 4μL，10μmol/L 上、下游引物各 2μL，ddH，O17μL 。PCR反應程序：95C3min;95C30s，55C30s，72C1min 35個循環(huán)； 72°7min，4°C 保存。引物序列見表1。回收瓊脂糖凝膠電泳的目的產(chǎn)物，并將其連接至pMD19-T中間克隆載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α ，在含有氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行抗性篩選，隨機挑取陽性單克隆菌落在含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中搖菌，進行菌液PCR檢驗后測序。

1.3 PhMYB14基因生物信息學分析

運用PlantCARE、ProtParam、WoLF PSORT等在線軟件（表2）對PhMYB14基因編碼氨基酸序列及編碼蛋白理化性質(zhì)進行分析；利用NCBI中的BLAST對PhMYB14編碼氨基酸進行同源序列比對；在MEGA11.0中進行多重序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設置Bootstrap值為1O00，并進行偏差校正。

1.4PhMYB14基因組織特異性表達分析

使用TaKaRa的 5× PrimeScript RT Master Mix試劑盒將河北楊的根、莖和葉片的總RNA反轉錄為cDNA，定量試劑選用 TBGreenPremixEx TaqⅡ（TaKaRa），使用LightCycler480系統(tǒng)進行熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。反應體系（ 20μL ）：10μmol/L 上、下游引物各 1μL ，模板 2μL ，TBGreen Premix Ex Taq II 10μL ， 。反應程序為： 95%2min;95%10s，56°20s. 個循環(huán)。以河北楊Actin基因作為內(nèi)參基因，所用引物序列見表1。每個樣品設置3次技術重復，采用 2^-ΔΔCt 法計算基因相對表達量，用Orgin軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 PhMYB14基因克隆及編碼蛋白氨基酸序列分析

以河北楊的cDNA作為模板進行PCR克隆，獲得編碼區(qū)（CDS）序列長度為 723bp 的核苷酸序列（圖1、圖2）。PhMYB14具有完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼240 個氨基酸殘基，蛋白分子式為 C₁₂₀₃H₁₈₆₆N₃₃₈O₃₇₇S₁₃ ，總原子數(shù)為3797，分子量為 27512.87Da ，理論等電點（pI）為5.17（表3）；天冬氨酸和谷氨酸（ Asp+ GluΩ ）攜帶負電荷，殘基總數(shù)為35個；精氨酸和賴氨酸（ Arg+Lys） 攜帶正電荷，殘基總數(shù)為23個；絲氨酸（Ser）含量最多，占 10.8% ，其次為亮氨酸（Leu），占 8.3% ，酪氨酸（Tyr）含量最少，占 1.2% （圖3）。PhMYB14基因編碼蛋白的脂肪系數(shù)為76.43，無信號肽區(qū)域，無跨膜結構（圖4A）。不穩(wěn)定系數(shù)為53.67，屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水系數(shù)為-0.454，推測屬于親水蛋白（圖4B）。

M 為 DL200O DNA Marker;1為PhMYB14基因大腸桿菌質(zhì)粒PCR。

2.2 PhMYB14蛋白二級、三級結構預測分析

PhMYB14蛋白的二級結構預測分析結果（圖5）表明， ∝ -螺旋占 32.78% . β -折疊占 3.32% ， β -轉角占2.90% ，無規(guī)則卷曲占 61.00% 。三級結構預測結果（圖6）顯示，PhMYB14具有螺旋-轉角-螺旋的結構特征;基于PDB號為B9GS15.1.A的模板建立三維結構模型，模型間序列相似性為0.62，一致性為99.56% ，GMQE值為0.55，屬于MYB家族蛋白。

2.3 多重序列比對及系統(tǒng)進化分析

選取毛果楊等多個其他物種的MYB14氨基酸序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫與PhMYB14編碼氨基酸序列進行同源性比對并構建系統(tǒng)進化樹。結果（圖7）顯示，河北楊與毛果楊的同源性最高，為98.28% ；與銀白楊的同源性次之，為 90.56% ；與其他物種的同源性較低，為 53.14%～85.84% 。

2.4 PhMYB14亞細胞定位預測

系統(tǒng)進化樹（圖8）顯示，河北楊PhMYB14與毛果楊PtMYB14親緣關系最近，在同一分支上，與同為楊屬的銀白楊親緣關系次之；此外，PhMYB14與同為楊柳科的另一屬柳屬的紅皮柳、簸箕柳親緣關系也較近

利用WoLFPSORT軟件對PhMYB14蛋白進行亞細胞定位預測，結果（表4）表明，該蛋白主要位于葉綠體，初步推斷其可能主要在葉綠體內(nèi)發(fā)揮重要作用。

2.5 PhMYB14基因順式作用元件分析

利用在線軟件PlantCARE對PhMYBI4基因啟動子區(qū)域順式作用元件進行預測，結果（表5）表明，該基因具有多種順式作用元件，如光響應元件ACE、GT1-motif、TCT-motif、AT1-motif 等，茉莉酸甲酯響應元件TGACG-motif和CGTCA-mo-tif，厭氧反應作用元件ERE，生長素響應元件TGA-element等，表明PhMYB14基因可能與光響應、激素響應等多種生物功能相關

2.6 PhMYB14基因在河北楊幼苗中的組織特異性表達分析

利用qRT-PCR分析了PhMYB14基因在河北楊不同組織中的表達情況，結果（圖9）顯示，河北楊根、莖、葉中均檢測到PhMYB14基因的表達，但不同部位的相對表達量有差異，在葉中相對表達量最高，其次是在莖中，在根中相對表達量最低，表明PhMYB14可能在河北楊的生長發(fā)育過程中，特別是在葉的發(fā)育過程中起到重要的生物學作用。

柱上不同小寫字母表示不同器官間差異顯著（ Plt;0.05） U

3討論與結論

MYB基因家族中的許多成員參與植物調(diào)節(jié)鈣信號通路、代謝物合成、激素信號傳導、響應生物和非生物脅迫等過程。在擬南芥、葡萄、蘋果、桑樹、小麥及楊樹等植物中，MYB基因家族的多個成員都有研究，并發(fā)揮著重要功能。通過對前期的轉錄組數(shù)據(jù)篩選發(fā)現(xiàn)，MYB14在河北楊蟲脅迫之后表達量明顯增加，說明MYB14可能在河北楊抗蟲過程中發(fā)揮了作用，但目前作用機制尚不明確。

本研究成功克隆了河北楊MYB14基因，該基因CDS序列長 723bp ，具有MYB基因家族結構域，屬于MYB基因家族成員。對克隆獲得的PhMYB14基因進行生物信息學分析，其編碼蛋白為穩(wěn)定性較弱的親水蛋白，無信號肽和跨膜結構；PhMYB14蛋白二級結構由 α- 螺旋、 β- 轉角、 β- 折疊和無規(guī)則卷曲組成，但是各組成成分的含量有差異。PhMYB14基因啟動子含有較多光響應順式作用元件，也含有茉莉酸甲酯響應元件和生長素響應元件等，這說明MYB14可能參與河北楊的抗逆過程。系統(tǒng)進化樹分析結果表明PhMYB14與同為楊屬的毛果楊PtMYB14在一個分支上，親緣關系最近；亞細胞定位預測顯示該蛋白可能主要定位于葉綠體中，后續(xù)需要在河北楊中進行亞細胞定位試驗驗證。

PhMYB14蛋白富含 ∝ -螺旋和 β -轉角，這與MYB家族結構是相符的，MYB家族蛋白結構中每個R結構重復序列都有3個螺旋，第3個螺旋蛋白重復序列組成了一個螺旋-轉角-螺旋（HTH）結構[21]。有研究表明，短時間UV-C 輻射處理不同品種葡萄葉片后，MYB14的表達水平不同，會引起不同品種葡萄中芪類化合物的含量不同[22]。PhMYB14啟動子順式作用元件包含多個光響應元件，且主要定位在葉綠體上，說明該基因可能通過光響應影響體內(nèi)芪類化合物合成。同時，茉莉酸途徑是植物在防御過程中的主要信號途徑之一，植物在受到損傷后，會加速合成茉莉酸，同時激發(fā)作為茉莉酸甲基化揮發(fā)物的茉莉酸甲酯[23]。用茉莉酸甲酯處理煙草，可以提高煙草抗炭疽病的能力，同時顯著提高過氧化物酶活性[24]。PhMYBl4啟動子中也含有響應茉莉酸甲酯的順式作用元件，表明其可能也在河北楊抗蟲方面發(fā)揮作用[25] C

MYB轉錄因子作為植物特有的一類轉錄因子，在植株的生長發(fā)育過程、逆境脅迫、次生代謝中起著重要作用，是改良植物遺傳特性的良好基因資源，其調(diào)控過程受多種激素及環(huán)境因素誘導。目前對葡萄MYB的研究較多，2013年，Holl等[20]從葡萄中分離并鑒定了兩個R2R3-MYB型轉錄因子——MYB14、MYB15，認為其對芪類化合物的合成過程具有調(diào)控作用；Fang等[26]也認為MYB14轉錄因子是調(diào)控芪類化合物合成酶基因的重要一環(huán)，可通過與相應的motif結合直接調(diào)節(jié)芪合成酶基因生成芪類化合物，并且其表達模式與白藜蘆醇的含量變化有關[26]。當植物受到生物或非生物脅迫時，如霜霉病（Plasmopara vitico-la）感染[27]，白粉病感染[28]，機械損傷和接觸UV-C輻射，以及植物激素的處理2等，MYB14和MYB15能夠與芪合成酶強烈共表達以應對脅迫，進而調(diào)控芪類物質(zhì)的合成途徑[30]。此外，研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉片和果實中的白藜蘆醇、紫檀芪和葡萄素含量與霜霉病、灰霉病和白粉病等真菌病害的抗性之間存在正相關關系[31-35]。以上說明以白藜蘆醇為代表的芪類物質(zhì)對提升植物的抗病性有重要作用。目前對楊樹MYB14轉錄因子的功能研究較少，其在楊樹中發(fā)揮的抗性功能仍不明晰，其所介導的一系列調(diào)控網(wǎng)絡仍有待進一步研究。

綜上，基因調(diào)控植物的生長發(fā)育是一個復雜的過程。本研究結果為進一步探究PhMYB14基因在河北楊抵抗病蟲害過程中的作用機理以及通過過表達PhMYB14基因提升河北楊抗病蟲害的能力提供理論依據(jù)，為河北楊的品種改良奠定基礎。

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