優(yōu)質(zhì)小麥品種鄭麥158不同發(fā)育時期籽粒的酵母雙雜交cDNA文庫構建

Construction of Yeast Two-Hybrid cDNA Library in Grains at Different Developmental Stages of Zhengmai 158 with High Quality

Wang Shasha'，He Ning1*，Chao Yue'en'，Wang Gang2，Li Yan3， Zhang Yixin4

（1.WheatResearch Institute，HenanAcademyofAgriculturalSciences/HenanKeyLaboratoryf WheatBiology，Zhengzhou40002，

China；2.HenanAcademyofAgricultural Science，Zhengzhou450o2，China；3.Jiaozuo University，Jiaozuo 4540，China; 4. Beijing Municipal Science amp; Technology Commission， Beijing 1Ooo81，China）

AbstractHigh-quality yeast two-hybrid library is the basis for screening the genes interacting proteins and analyzing the regulation mechanisms.In this study，the grains at diffrent developmental stages （7，14， 21，28，35and 42 days after anthesis）of Zhengmai 158 with high quality were equally mixed to construct the yeast two-hybrid cDNA library by gateway recombination technology.The results showed that the library capacity of primary and secondary cDNA libraries were 8.0×10⁶CFU and 9.4×10⁶CFU ， respectively. The 24 clones were randomly selected forbacteria liquid PCR detection，and the results showed that allthe clones had insert fragments.The length of the insert fragments mainly concentrated between 7OO bp and 2 OOO bp with a recombination rate of 100% ，which were in expected size. In summary，the yeast two-hybrid cDNA library of Zhengmai158constructed in this study had high quality，and could meet the requirements for high-efficient screening of the genes interacting proteins，which could lay a foundation for screening the interacting proteins of vheatquality related genes and analyzing their regulatory mechanisms.

KeywordsZhengmai 158； High-quality wheat; Yeast two-hybrid; cDNA library

酵母雙雜交技術（YeastTwo-Hybrid，Y2H）是研究植物蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種常用技術[1]，目前已被廣泛應用于各物種的相關研究當中。例如：2016年，王宇秋等通過Y2H技術成功篩選到16個水稻的稻曲病菌效應因子互作蛋白，解析了稻曲病菌侵染水稻的相關理論機制[2]。2020年，李健等從玉米中鑒定出參與調(diào)控鹽脅迫的ZmCIPK24-2基因，并通過Y2H技術LUC互補成像實驗發(fā)現(xiàn)ZmCIPK24-2與玉米CBLs家族中的ZmCBL1、ZmCBL4、ZmCBL8和ZmCBL9互作，為解析玉米CBL-CIPK信號通路的功能提供了新證據(jù)[3]。2022年，謝瑞瑩等為探究NtMYB4a在煙草次生代謝產(chǎn)物合成和非生物脅迫響應中的作用，經(jīng)Y2H研究發(fā)現(xiàn)，NtMYB4a蛋白可能通過與液泡分選蛋白、B2蛋白、RALF-like22蛋白和應激增強蛋白等互作參與煙草防御低溫脅迫的調(diào)控機制[4]。多聚半乳糖醛酸酶1（ARABIDOPSIS DEHISCENCE ZONE POLYGA-LACTURONASE1，ADPG1）是擬南芥角果開裂所必需的果膠酶，韓雪等通過Y2H技術挖掘了與ADPG1蛋白互作的候選蛋白AtGRP5，為進一步解釋ADPG1參與ccr1突變體激發(fā)子釋放和誘導防御基因PRI表達的作用機制奠定基礎[5]。另外，Y2H技術在棉花[6]、苦瓜[7]、番茄[8]、油菜[9]等作物的相關研究中也得到了廣泛的應用。

在小麥中，2022年，Zhao 等利用正向遺傳學手段克隆出控制小麥分蘗角度的重要基因TaHSTIL（NAD依賴性脫乙酰酶HST1-like基因），并通過Y2H技術篩選互作蛋白，鑒定出一個參與生長素信號轉導的蛋白TaIAA17，并發(fā)現(xiàn)TaHST1L可能通過抑制TaIAA17的積累參與生長素信號轉導通路[10]。2023 年，Lv 等克隆了一個能夠兼抗小麥莖基腐病和紋枯病的細胞壁轉化酶基因TaCWI，通過Y2H技術研究發(fā)現(xiàn)其編碼的細胞壁轉化酶蛋白與能夠降解細胞壁成分的 α- 半乳糖昔酶（TaGAL）蛋白互作，并抑制TaGAL基因的表達，從而抵消TaGAL對細胞壁的降解作用并能增厚細胞壁，達到抵抗病原菌入侵的目的[1]。同年，宋曉等利用Y2H技術篩選到小麥硝酸鹽轉運蛋白 TaNRT1.1-1A的互作蛋白SdrI-like，為進一步解析TaNRT1.1-1A調(diào)控小麥硝酸鹽吸收的分子機制奠定基礎[12]?？梢姡琘2H技術已應用于小麥產(chǎn)量、抗病性等方面，但該技術在優(yōu)質(zhì)麥品質(zhì)尤其是面團品質(zhì)相關的應用研究尚未見報道。

小麥（TriticumaestivumL.）是我國最重要的糧食作物之一，也是食物中碳水化合物的重要來源，可為人類提供 20% 的蛋白質(zhì)和能量[13]。在保持小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的同時改善品質(zhì)以滿足市場需求是我國科研工作者長期追求的重要目標之一。開展小麥面團品質(zhì)相關的基因功能研究，探討與其相關的調(diào)控機制，可為優(yōu)質(zhì)麥的遺傳改良提供重要依據(jù)。鄭麥158是河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所豐優(yōu)育種研究室選育、2019年通過河南省審定的中強筋小麥品種，具有蛋白質(zhì)含量較低、面團強度較高等特點[14]。因此，本研究以優(yōu)質(zhì)小麥品種鄭麥158不同發(fā)育時期的籽粒為材料，構建其酵母雙雜交cDNA文庫，以期為后期開展與小麥品質(zhì)相關基因的互作蛋白篩選，解析其調(diào)控機制奠定基礎。

材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為鄭麥158，種子由河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所小麥營養(yǎng)與品質(zhì)研究室繁殖保存。2022年秋季播種于河南省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地，取揚花后7、14、21、28、35、42d的籽粒，液氮速凍， -80^°C 保存。

主要生化試劑：CTAB 試劑，T4 DNA Polymer-ase，T4DNALigase，DEPC水，BPClonase Imix 及LR Clonase I mix。載體：pDONR222，pGADT7。菌株：大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)。試劑盒：EZ-500SpinColumnPlasmidMax-PrepsKit質(zhì)粒提取試劑盒，SV Total RNAIsolation SystemmRNA分離純化試劑盒，Script II First-synthesis system for RT-PCR反轉錄試劑盒。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基和SOC培養(yǎng)基?？股兀嚎敲顾兀↘an）。

本研究所用引物的合成以及測序工作均由生工生物（上海）股份有限公司承擔完成。

1.2 鄭麥158總RNA提取及mRNA分離

取凍存的鄭麥158不同發(fā)育時期的籽粒等量混合，采用CTAB法提取其總RNA，用含溴化乙錠的 3% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用普洛麥格（北京）生物技術有限公司生產(chǎn)的mRNA分離純化試劑盒SVTotalRNAIsolationSystem對mRNA進行分離純化。

1.3 鄭麥158不同發(fā)育時期籽粒的cDNA初級文庫構建

（1）初級文庫構建：將分離純化好的mRNA反轉錄進行cDNA第一鏈和第二鏈的合成;參照GATEWAYTM Cloning Technology方法設計重組接頭attB1adapter，將cDNA與其連接、分級分離和收集;通過BP重組反應將帶有attB1接頭的cDNA連接到載體pDONR222上，然后通過電轉化將反應產(chǎn)物轉至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞內(nèi)，加人SOC 培養(yǎng)基 振蕩培養(yǎng) ^1h 。取 0.001μL 細菌培養(yǎng)液涂布于LB平板（Kan抗性）， 37^°C 倒置過夜培養(yǎng)，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，然后參照李立群等[13]的方法計算文庫的容量，其中，滴度 （CFU/mL）= （平板上的克隆數(shù) 50μL ） × 稀釋倍數(shù) Φ×1 000μL ，庫容量0 CFU）= 滴度 ×2mL 。將剩余菌液加入 1/2 體積的60% 甘油至終濃度為 20% 后，置于 -80^°C 冰箱中保存，即為初級文庫。

（2）初級文庫克隆的PCR檢測：用槍頭從上述初級文庫的LB平板上隨機挑取24個單克隆，分別溶于 5μL 去離子水中，進行菌落PCR鑒定。所用引物對為pDONR222-F（ 5^′ - TCCCAGT-CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTT- 3^′ ）和pDONR222-R（ 5^′ -AGAGCTGCCAGGAAACAGC-TATGACCATGTAATACGACTC -3^′ ）。PCR反應體系： 10pmol/μL 上、下游引物各 0.5μL ，菌液DNA2μL ， 10× Taq buffer（ Mg²⁺ plus） 2.5μL ， dNTP（2.5 mmol/L） 0.3μL ，Taq DNA 聚合酶 1.25U ，用滅菌的 ddH₂0 補足至 20μL 。PCR擴增程序：

94^°C 預變性 變性 30s，58^°C 退火30S 72^°C 延伸 2min ，共35個循環(huán)； 72^°C 延伸5min 。利用 3% 的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測分析，以鑒定初級文庫的重組率及插入片段長度。

1.4鄭麥158不同發(fā)育時期籽粒的酵母雙雜交文庫構建

取部分初級文庫菌液，加入SOC培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。所得質(zhì)粒與pGADT7-DEST進行LR重組反應，反應體系 20μL ，包括300ng/μL 初級文庫質(zhì)粒 PGADE-T7 1μL 、LR Clonase I Mix 4μL ，滅菌 。反應產(chǎn)物通過電轉化轉至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞中，然后加入SOC培養(yǎng)基2 搖床培養(yǎng) ^1h 。取部分培養(yǎng)液涂布于LB平板， 37^°C 過夜培養(yǎng)，用于鑒定酵母雙雜交文庫的容量，鑒定方法同初級文庫的鑒定方法。通過PCR檢測鑒定和分析酵母雙雜交文庫克隆的重組率及插入片段長度。所用引物對為F（ 5^′ -TAATACGACTCACTATAGGGC- -3^′ ）和R（ 5^′ -AGATGGTGCACGATGCACAG-3'）。PCR擴增體系 20μL ，包括 10× PCR Buffer 2.0μL，50 mmol/L mmol/L dNTP 0.5μL，20 DNA Polymerase 0.3 。PCR擴增程序同初級文庫的菌落PCR鑒定程序。剩余培養(yǎng)物加入1/2體積 60% 甘油至終濃度為 20% ，于 -80^°C 凍存，即為鄭麥158不同發(fā)育期籽粒的酵母雙雜交文庫。

2 結果與分析

2.1 總RNA及mRNA的檢測

電泳結果顯示，泳道中28S和18S條帶清晰可見，說明總RNA穩(wěn)定、質(zhì)量高（圖1A）。mRNA經(jīng)分離純化后，電泳條帶為均勻彌散狀（圖1B），說明mRNA未降解，符合構建文庫的要求。

2.2 初級文庫的鑒定

將初級文庫菌液稀釋1000倍，取 50μL 涂布于含有Kan的LB平板上，記錄平板克隆數(shù)為202（圖2），經(jīng)計算得到初級文庫滴度為 4.0×10⁶ CFU/mL 。轉化后的菌液體積為 2mL ，因此初級文庫的容量為 8.0×10⁶ CFU。

隨機挑選24個單克隆進行PCR檢測，結果顯示24個克隆均帶有插入片段（圖3），其中4個插入片段長度小于 1000bp，1 個插入片段長度大于 2 000bp ，其余插入片段長度在 1 000～2 000 bp，重組率為 100% ，符合初級文庫的質(zhì)量標準。

1＼～24為24個克隆，下同。

2.3 酵母雙雜交文庫的構建及質(zhì)量鑒定

初級文庫質(zhì)粒通過LR重組反應和電轉化DH5α 獲得酵母雙雜交文庫菌液，將其稀釋1000倍后涂布于含Kan的LB平板，記錄平板克隆數(shù)為237個（圖4），計算得到酵母雙雜交文庫滴度為 4.7×10⁶ CFU/mL，酵母雙雜交文庫容量為 9.4× 10⁶CFU 。

隨機挑選24個單克隆進行PCR檢測，結果（圖5）顯示24個克隆中均含有插入片段，其中8個插入片段長度小于 1000bp，5 個插入片段長度大于 2 000bp ，其余插入片段長度均在 1000～ 2000bp 之間，重組率為 100% ，達到酵母雙雜交文庫的構建標準。

3討論與結論

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展以及基因功能研究的逐步深入，建立高質(zhì)量的酵母雙雜交文庫以篩選基因互作蛋白、研究基因調(diào)控機制，成為深入研究基因功能的熱點方向，同時也為獲取新的基因資源提供了重要途徑。近年來，研究人員已在水稻[2]、擬南芥[5]、棉花[6]、苦瓜[7]、番茄[8]甘藍型油菜[9]、冬瓜[15]、梨[16]、桑樹[17]、柑橘[18]小麥[10-12，19]中建立了酵母雙雜交文庫。其中水稻中建立的稻曲病菌侵染水稻穎花的酵母雙雜交cDNA文庫、甘藍型油菜-核盤菌酵母雙雜交cD-NA文庫、桑樹中建立的青枯菌侵染其根部的酵母雙雜交cDNA文庫以及柑橘中建立的尤力克檸檬大腸桿菌cDNA文庫，均可應用于解析抗病機制研究；冬瓜、苦瓜、梨、擬南芥等作物利用其不同組織、器官構建cDNA文庫可明確與生長發(fā)育有關的機制研究；利用非生物脅迫誘導構建的棉花酵母雙雜交文庫也可應用于探明其低溫等非生物脅迫相關的網(wǎng)絡調(diào)控機制。另外，在小麥中，也已建立了與產(chǎn)量、抗病等相關的酵母雙雜交cDNA文庫，并利用其文庫成功篩選出與基因互作的蛋白，但與優(yōu)質(zhì)麥籽粒品質(zhì)有關的酵母雙雜交cD-NA文庫構建研究尚未見報道。因此，本研究利用優(yōu)質(zhì)中強筋小麥品種鄭麥158揚花后7、14、21、28、35、42d的籽粒，將其等量混合后進行總RNA的提取以及酵母雙雜交cDNA文庫的構建，結果顯示，初級文庫的庫容量為 8.0×10⁶ CFU，酵母雙雜交文庫的庫容量為 9.4×10⁶ CFU；另外，24個克隆的菌液PCR檢測結果表明所有克隆均帶有插入片段，插入片段的長度大多在 700～ 2000bp 之間，重組率均達到 100% ，符合預期。因此，本研究經(jīng)BP重組反應及LR重組反應構建的鄭麥158cDNA文庫連接效率高，庫容量也大。與之前的中國春cDNA文庫[9]相比，該優(yōu)質(zhì)麥cDNA文庫可準確、高效地篩選到與優(yōu)質(zhì)麥品質(zhì)基因發(fā)生互作的蛋白質(zhì)分子。

近年來，小麥品質(zhì)相關基因被廣泛研究2022年，Zhou等從弱筋小麥品種鄭麥004中克隆了 TaGli-γ-2.I 基因，其啟動子區(qū)域甲基化抑制其表達，發(fā)現(xiàn)高甲基化小麥品種中醇溶蛋白的總量和 γ 一醇溶蛋白的積累顯著減少，谷蛋白指數(shù)和面團穩(wěn)定時間有所增加[20]。同年，Chen等通過甲磺酸乙酯（EMS）誘導，獲得小麥低谷蛋白突變體 lgpl （low gluten protein I ），使單個 γ -醇溶蛋白基因突變，導致其信號肽序列發(fā)生錯義突變，該突變可引起 γ -醇溶蛋白信號肽不能正常切割而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構發(fā)生改變，形成自噬體樣結構，最終導致種子儲存蛋白傳遞到細胞外空間，降低了谷蛋白和淀粉生物合成水平，并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應和細胞死亡[21]。另外還有影響小麥籽粒硬度的puroindoline基因[22]、合成直連淀粉的關鍵酶Waxy基因[23]、面粉色澤基因psy1（phytoenesynthase1）[24]、面團褐變的小麥多酚氧化酶基因 PPO^[25] 、可提高小麥賴氨酸含量的 wblrp（winged bean lysine-rich protein）基因[26]等。綜上，雖然科研人員已對小麥品質(zhì)相關基因進行了較為深入的研究，但是對于這些基因在小麥品質(zhì)改善中的具體作用機制以及其互作蛋白等還不清楚。本研究建立的酵母雙雜交cDNA文庫可為后期篩選小麥品質(zhì)相關基因的互作蛋白，以及解析與其相關的調(diào)控機制奠定基礎

參考文獻：

[1]Lin JS，Lai E M.Protein-protein interactions：yeast two-hybridsystem[J]. Methods in Molecular Biology，2017，1615： 177-187.

［2］王宇秋，李國邦，楊娟，等.稻曲病菌侵染水稻穎花的酵母雙雜交cDNA文庫構建與應用[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2016，49（5） ：865-873.

[3]李健，王逸茹，張凌霄，等.玉米 ZmCIPK24-2基因在鹽脅迫應答中的功能研究[J].作物學報，2020，46（9）：1351-1358.

［4］謝瑞瑩，曾露桂，姜超英，等.煙草NtMYB4a基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及互作蛋白的篩選［J]．核農(nóng)學報，2022，36（7） ：1318-1328.

［5]韓雪，王樹芳，林金星.擬南芥酵母雙雜交文庫構建及AD-PG1互作蛋白篩選［J].中國細胞生物學學報，2022，44（6） ：1048-1055.

［6］蔡肖，李興河，王海濤，等.非生物脅迫誘導的棉花酵母雙雜交文庫構建及GhJAZ1互作蛋白篩選［J]．核農(nóng)學報，2023，37（11） ：2158-2165.

［7］郭金菊，史亮亮，王茹芳，等.苦瓜果實酵母雙雜交文庫構建及McRPF互作蛋白篩選[J]．核農(nóng)學報，2022，36（7）：1293-1299.

［8］高苗苗，郭鑫，朱壽松，等.番茄 SUJAZ11的表達分析及互作蛋白的篩選與驗證[J].核農(nóng)學報，2023，37（3）：483-494.

[9]彭琦，周曉嬰，高建芹，等.甘藍型油菜-核盤菌酵母雙雜交cDNA文庫構建及BnJar1互作蛋白篩選［J].中國油料作物學報，2023，45（6）：1119-1127.

[10] Zhao L，Zheng Y T，Wang Y，et al. AHST1-like gene controllstiller angle through regulating endogenous auxin incommonwheat[J]. Plant Biotechnology Journal，2022，21（1）： 122-135.

[11]Lv G G，Zhang Y X，Ma L，et al. A cell wall invertase modu-lates resistance to fusarium crown rot and sharp eyespot in com-mon wheat[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2O23，65（7） ：1814-1825.

[12］宋曉，黃紹敏，張珂珂，等.小麥硝酸鹽轉運蛋白TaNRT1.1-1A轉錄活性檢測及互作蛋白篩選［J].麥類作物學報，2023，43（10） ：1227-1233.

[13]Asseng S，Guarin JR，Raman M，et al.Wheat yield potential incontrolled-environmentvertical farms[J].ProceedingsoftheNational Academy of Sciencesof theUnited States of America，2020，117（32） ：19131-19135.

[14］晁岳恩，李文旭，王沙沙，等.不同面團強度小麥品種差異表達貯藏蛋白基因分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2022，51（10）：17-24.

[15］陳鳳，閆晉強，李梅蘭，等.冬瓜均一化酵母雙雜交cDNA文庫的構建及鑒定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2021，48（8）：58-64.

[16］龔宏，易善萍，聶顯雙，等.梨酵母雙雜交cDNA文庫的構建與鑒定[J].中國南方果樹，2023，52（3）：126-129.

[17］戴凡煒，王振江，羅國慶，等.青枯菌誘導的桑樹根部酵母雙雜交文庫構建和MaTGA1互作蛋白的篩選及鑒定［J].植物生理學報，2023，59（10）：1-9.

［18］賓羽，張琦，王春慶，等.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與柑橘黃化脈明病毒CP互作的寄主因子[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2023，56（10） ：1881-1892.

[19］李立群，王冰心，呂千，等.小麥酵母雙雜交文庫構建及文庫質(zhì)量的鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2022，31（8）：948-957.

[20]Zhou Z F，Liu C C，Qin MM，et al.Promoter DNA hypermethy-lationof TaGli-y-2.1 positively regulates gluten strength inbreadwheat[J]. Journal ofAdvanced Research，2O22，36：163-173.

[21] Chen Q，Yang C F，Zhang Z H，et al. Unprocessed wheat γ -gli-adin reduces gluten accumulation associated with the endoplas-micreticulumstress and elevated cell death[J].New Phytolo-gist，2022，236：146-164.

[22]Liu PX，LiuZH，MaXF，etal.Characterizationanddifferen-tiation of grain proteomes from wild-type puroindoline and vari-antsinwheat[J].Plants（Basel），2023，12（10）：1979-2000.

[23] Guzmán C，Alvarez JB. Wheat waxy proteins： polymorphism，molecular characterization and effects on starch properties[J].Theoretical and Applied Genetics，2016，129（1） ：1-16.

[24]Zhai SN，LiGY，SunYW，et al.Genetic analysis of phytoenesynthase 1（Psyl） gene function and regulation in commonwheat[J]. BMC Plant Biology，2016，16（1） ：228-242.

[25]Zhai SN，LiuH，Xia XC，et al.Functional analysis of polyphe-nol oxidase1 gene in common wheat[J].Front in Plant Sci-ence，2023，14：1-11.

[26］孫曉波，房瑞，余桂紅，等.轉高賴氨酸含量基因（Cflr）小麥植株的獲得及種子中蛋白質(zhì)和賴氨酸的含量分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（6）：1162-1169.