金果欖UPLC指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定研究

中圖分類(lèi)號(hào)：TB9；O657.72；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1674-5124（2025）06-0106-08

Study on UPLC fingerprint and multi-index content determination of Tinosporae Radix

YANG Ruil，HU Yingying2， ZHANG Chi2，WU Jianguo2， ZHU Yaning1，2 （1. College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China; 2.Yaan Sanjiu Pharmaceutical Co.，Ltd.， Yaan 625ooo， China）

Abstract： The ultra-high performance liquid chromatography （UPLC） fingerprint of Tinosporae Radix was established， and the contents and extractsof columbin， palmatine， jatrorrhizine， columbamine， hydroxyecdysone and magnoflorine were determined at the same time， and analyzed by chemical pattern recognition. A Prodgy3M ODS-3 column 2.0m×150mm ， 3μm） ）wasused with acetonitrile （A）- .0.2% （204 phosphoric acid （B） as mobile phase，gradient elution， flow rate 0.4mL/min ， column temperature 30°C 0 injection volume 1μL ，detection wavelength 237nm and 344nm .The results showed that the fingerprint similarity of 18 batches of Tinosporae Radix from diferent sources was greater than or equal to 0.928 except that of J15 batch was O.739.A total of 21 common peaks were calibrated，and six peaks of columbin， palmatine，jatrorrhizine，columbamine，hydroxyecdysone and magnoflorine were identified.The determination results were between 10.746-23.113mg/g 0.067-0.794mg/g 。 0.042?0.391mg/g 0.008-0.207mg/g 1.129-

3.586mg/g and 0.172-0.801mg/g . The samples were roughly divided into three groups based on the extract contents.The method is simple，stable and reliable，and can provide reference for the comprehensive evaluation of the quality of Tinosporae Radix.

Keywords： Tinosporae Radix; fingerprint; multi-index components; content determination; chemometrics

0 引言

中藥金果欖為防己科植物青牛膽Tinosporasagittata（Oliv.）Gagnep或金果欖TinosporacapillipesGagnep的干燥塊根，性寒味苦，有清熱解毒，利咽止痛之功效；可用于咽喉腫痛、癰疽療毒、泄瀉、痢疾以及皖腹疼痛的治療[1]。金果欖中含有生物堿、萜類(lèi)和甾體類(lèi)等多種成分，有鎮(zhèn)痛2、抗炎、抑菌[3]、降血糖[4-7]、抗腫瘤[8-9]、抗氧化[10]等功效，具有開(kāi)發(fā)新型藥物的潛質(zhì)。2020版《中國(guó)藥典》金果欖項(xiàng)下以古倫賓為含量測(cè)定項(xiàng)，較為單一。隨著中藥質(zhì)量控制要求的提高以及通過(guò)臨床實(shí)踐表明，單一成分的含量測(cè)定并不能全面科學(xué)地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。建立多指標(biāo)含量測(cè)定方法，并結(jié)合指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)分析，可以更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)中藥藥材品質(zhì)，更客觀全面地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量[11]?，F(xiàn)有的金果欖含量測(cè)定方法多集中在古倫賓、藥根堿、巴馬汀等單一或兩個(gè)成分的測(cè)定上[12-13]，關(guān)于金果欖指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定方法還較少，或是使用質(zhì)譜，成本較高[14-15]，或是色譜信息不夠豐富[16]，因此建立一個(gè)操作簡(jiǎn)便、色譜信息豐富的檢測(cè)方法對(duì)金果欖藥材的質(zhì)量控制有一定的意義。

有研究表明，古倫賓、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、木蘭花堿、 β -蛻皮甾酮是金果欖內(nèi)含量較高且活性成分較好的成分[17-18]，可在一定程度上代表金果欖的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定這6種成分的UPLC方法，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行了綜合分析，以期為其質(zhì)量控制及建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1儀器

Agilent1290InfinityII高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配備四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XFB-500小型粉碎機(jī)（吉首市中湘制藥機(jī)械廠）；HH-S6電熱恒溫水浴鍋（北京科偉水興儀器有限公司）；MettlerToledoXA-205電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；MettlerToledoAL204S型十萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；純水機(jī)（四川優(yōu)譜超純科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

金果欖樣品來(lái)自四川、云南2個(gè)產(chǎn)地，其中J1-J14為栽培基地采挖的新鮮塊根，J15-J18為購(gòu)買(mǎi)的藥材或飲片，具體信息見(jiàn)表1，經(jīng)華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司胡瑩瑩工程師鑒定為防己科植物青牛膽Tinospora sagittata（Oliv.） Gagnep的新鮮或干燥塊根。

對(duì)照品古倫賓（111837-201703， ?99.8% ）、鹽酸巴馬汀（110732-201913， ?85.7% ）、鹽酸藥根堿（110733-202110， ?90.3% ）、 β- 蛻皮甾酮（11638-201907， ?98.3% ）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；非洲防已堿（21101107， ≥99.35% ）和木蘭花堿（21041602， ?99.09% 購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）、甲醇（分析純，成都科隆化學(xué)試劑有限公司）以及磷酸（色譜純，諾爾施科技有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品水分及浸出物測(cè)定

2.1.1 樣品準(zhǔn)備

將新鮮藥材（J1-J14）清洗、晾干并去除須根，于 60^°C 烘干。其中J5、J11批次在烘干后表面呈現(xiàn)平整與皺縮兩種形態(tài)，編號(hào)分別為J5-1（皺縮）、J5-2（平整）、J11-1（皺縮）及J11-2（平整）。各批次用四分法取適量樣品，粉碎成能過(guò)3號(hào)篩粉末備用。

2.1.2水分及浸出物測(cè)定

稱(chēng)取各批次金果欖粉末 2～3g. ，照水分測(cè)定法（2020版《中國(guó)藥典》通則0832）項(xiàng)下烘干法測(cè)定；精密稱(chēng)取各批次樣品粉末約 2g. ，照醇溶性浸出物測(cè)定法（2020版《中國(guó)藥典》通則2201）項(xiàng)下熱浸法測(cè)定，測(cè)定值見(jiàn)表2。所有批次水分均符合藥典不得超過(guò) 13.0% 的規(guī)定；浸出物符合不得少于 7.0% 的規(guī)定，其中J6及J17浸出物超過(guò) 30% ，J5批次表面平整的明顯低于皺縮的。

2.2 色譜條件

采用Prodgy3M ODS-3色譜柱（ 2.0m×150mm ，3μm ），流動(dòng)相為乙晴（A） .0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（ 0～8min 10% （20 8～11min ， 18% （2號(hào)

A; 11～15min ， 20% （2 A21.5% A; 15～23min 21.5% A; ， 32%90% A）；流量0.4mL/min ；柱溫 30^c ;進(jìn)樣量 1μL ；含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為 237nm 及 344nm ，特征圖譜為 237nm ， UPLC圖見(jiàn)圖1。

A-藥材， 344nm ;B-混合對(duì)照品， 344nm ;C-藥材， 237nm ;D-混合對(duì)照品； 237nm 。

3.木蘭花堿；8.β-蛻皮甾酮；13.非洲防己堿；14.鹽酸藥根堿；16.鹽酸巴馬?。?1.古倫賓。

2.3 對(duì)照品溶液配制

分別精密稱(chēng)取6種對(duì)照品適量，加甲醇配制成每 1mL 含古倫賓 0.5493mg ，鹽酸巴馬汀 0.0432mg 、鹽酸藥根堿 0.0515mg 、非洲防己堿 0.0301mg?β. 蛻皮甾酮 0.0534mg 、木蘭花堿 0.0526mg 的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液配制

取金果欖藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）約 0.5g ，精密稱(chēng)定，精密加入 70% 甲醇 10mL ，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲 30min 冷卻，補(bǔ)重，取續(xù)濾液即得。

2.5 指紋圖譜

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取同一批藥材粉末（J2），照\(chéng)"2.4\"項(xiàng)下制備供試品溶液，按 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。以21號(hào)峰（古倫賓）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批藥材粉末（J2），照\(chéng)"2.4\"項(xiàng)下制備供試品溶液，按 ^lt;lt;2.2^′ 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別在0、2、4、8、12、18、24、36h進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。以21號(hào)峰（古倫賓）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次藥材（J2）粉末6份，按照 ^lt;2.4^gt; 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄指紋圖譜，以21號(hào)峰（古倫賓）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，RSD值均小于 3% 。

2.5.4指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

將金果欖樣品分別按照‘2.4\"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件分析。以J1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，通過(guò)多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，共標(biāo)定21個(gè)共有峰，結(jié)合對(duì)照品的吸收曲線及保留時(shí)間對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，見(jiàn)圖1、圖2。將供試品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜匹配，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。除J15批次相似度為0.739外，其余批次相似度均 ?0.928 ，說(shuō)明建立的指紋圖譜能在一定程度上反映四川及云南兩地金果欖的化學(xué)成分特征，也表明來(lái)自不同來(lái)源的藥材化學(xué)成分類(lèi)別具有一致性。J15的峰2、18面積較小，峰9、13（非洲防己堿）14（藥根堿）、16（巴馬?。┓迕娣e較大，可能是導(dǎo)致其相似度差異較大的原因。

2.6 多指標(biāo)含量測(cè)定

2.6.1 線性關(guān)系考察

取 ^lt;2.3^： 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)看尉芤迫?3mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇稀釋至刻度直至得到6個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，按照 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量 3μL 。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo) （Y） ，對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X） ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表4所示。

2.6.2 精密度試驗(yàn)

取 ^lt;lt;2.3^： 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，照2.2\"項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值。計(jì)算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β 蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.87% ）0.61%0.75%0.63%0.94% 以及 1.48% 。這表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次金果欖藥材粉末，照 ^cc2.4^′ 項(xiàng)下制備供試品溶液，照 項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24、36h 測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.85%，0.86% 0.88%，1.52%，0.97% 以及 0.79% 。這表明供試品溶液在室溫放置 36h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金果欖藥材粉末6份，按\"2.4\"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照 ^lt;2.2^gt; 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿峰面積RSD分別為 0.75% 0.58% 、 0.94% ： 0.86% ！ 0.80% 以及0.89% 。這表明本法穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的金果欖藥材粉末6份，分別加入古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β 蛻皮甾酮及木蘭花堿對(duì)照品適量，照 ^cc2.4⁷ 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算古倫賓、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、非洲防己堿、 β -蛻皮甾酮及木蘭花堿平均加樣回收率分別為 101.05% 、 97.22% 、 95.03% 、 96.57% 101.72% 、 95.65% ，RSD分別為 0.60% 、 1.64% 、0.93% 、 1.99% 、 1.79% 和 1.26% 。這表明本法的準(zhǔn)確度良好。

2.6.6 含量測(cè)定

18批金果欖藥材（20個(gè)編號(hào)）按 ∴2.4^? 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 ^lt;2.2^′ 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，平行3次，按干燥品計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。各批次藥材古倫賓含量最高， β -蛻皮甾酮次之，非洲防己堿含量最低。J5-1的含量明顯高于J5-2，J11-1略高于J11-2。

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 主成分分析

采用SPSS26.0對(duì)樣品的浸出物及含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析，KMO檢驗(yàn)值為0.612，Bartlett's球形檢驗(yàn)值為0.00，表明適合進(jìn)行主成分分析。以λgt;1 為標(biāo)準(zhǔn)，提取出3個(gè)主成分，方差貢獻(xiàn)率分別為 41.315% 、 32.089% 和 15.835% ，積累方差貢獻(xiàn)率為 89.239% 。這說(shuō)明這3個(gè)主成分可以代表浸出物及6個(gè)成分含量的絕大部分信息。因子載荷矩陣顯示（表6）藥根堿、巴馬汀在主成分1上載荷較高，古倫賓、浸出物在主成分2上載荷較高， β -蛻皮甾酮在主成分3上載荷較高，分別是主成分1、主成分2以及主成分3得分的重要影響因素。以提取的主成分的因子得分乘以相應(yīng)主成分特征值的算術(shù)平方根，計(jì)算得到各樣品的主成分得分，見(jiàn)表5。

2.7.2 聚類(lèi)分析

為了更準(zhǔn)確地反映不同產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、種植方式的金果欖的差異，以各樣品的主成分1、主成分2、主成分3的得分為指標(biāo)（表5），在SPSS26.0軟件中以平方歐氏距離為測(cè)量區(qū)間，用瓦爾德法進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)距離為21時(shí)，樣品可聚為3類(lèi)，J1-J3、J5-2、J10、J11-2、J12、J14聚為一類(lèi)，多為2＼～3年生藥材，有 β? -蛻皮甾酮含量稍高，其余成分及浸出物含量較低的特點(diǎn)；J4、J5-1、J6-J9、J11-1、J13、J16-J18聚為一類(lèi)，多為4＼～5年生藥材，其古倫賓、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿及浸出物含量較高;J15單獨(dú)為一類(lèi)，生長(zhǎng)年限未知，其巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿以及木蘭花堿含量較高，這與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相同。其產(chǎn)地、種植方式則未出現(xiàn)明顯聚類(lèi)趨勢(shì)，在生長(zhǎng)年限上聚類(lèi)也存在交叉，可能是受到氣候以及土壤等因素的影響。

3討論

3.1 色譜條件選擇

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC在 28min 內(nèi)完成了金果欖主要色譜峰的良好分離以及6個(gè)成分的含量測(cè)定。在流動(dòng)相的篩選過(guò)程中，考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水、甲醇乙腈混合溶液-磷酸二氫鉀等不同流動(dòng)相體系對(duì)金果欖藥材中成分的洗脫和分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈 -0.2% 磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)各色譜峰出峰時(shí)間合適，且分離度較好。

采用DAD檢測(cè)器對(duì)6個(gè)成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描波長(zhǎng)為 237nm 時(shí)，古倫賓、 β -蛻皮甾酮以及木蘭花堿有較大吸收，且色譜信息豐富，分離度較好；波長(zhǎng)為 344nm 時(shí)，鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿及非洲防己堿有最大吸收，分離度良好且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

3.2供試品制備方法選擇

供試品溶液制備考察了提取方法（超聲、回流）提取溶劑（甲醇、 50% 甲醇、 70% 甲醇、乙醇、 50% 乙醇、甲醇-鹽酸 100：1， 甲醇-氨水 20：1 ）、料液比0 1：20，1：40，1：60，1：80，1：100） 、提取時(shí)間（30、60、90、 120min ）四個(gè)因素，根據(jù)含量結(jié)果及分離度等選擇提取時(shí)間 （20，30，40min ）、料液比（1：20、1：40、1：60） 、提取溶劑（ 50% 甲醇、 70% 甲醇、 50% 乙醇）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，最終確定供試品溶液的制備方法為料液比為 1：20，70% 甲醇為提取溶劑，超聲提取時(shí)間 30min 。

3.3指紋圖譜、含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析

化學(xué)模式識(shí)別能夠有效地從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中提取數(shù)據(jù)信息，分析數(shù)據(jù)的差異性，從而解決復(fù)雜的化學(xué)問(wèn)題。近年來(lái)，指紋圖譜、含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析已廣泛應(yīng)用在中藥及制劑質(zhì)量控制上[19-21]。

本研究主要采集四川、云南種植規(guī)模較大或有野生資源分布區(qū)域的金果欖樣品，其指紋圖譜及含量結(jié)果顯示，除四川宜賓的樣品（J15）外相似度均大于0.92，說(shuō)明這18批樣品的整體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定;而J15的巴馬汀、藥根堿及非洲防己堿的含量遠(yuǎn)高于其他批次，這可能是生長(zhǎng)方式或生長(zhǎng)年限引起的。不同形態(tài)的樣品部分表現(xiàn)出明顯的含量差異，含量較高的顏色相對(duì)較深，這可能與品種、氣候等因素有關(guān)，還需進(jìn)一步的研究。模式識(shí)別分析顯示，18批樣品在產(chǎn)地、種植方式上無(wú)明顯的聚類(lèi)趨勢(shì)，在生長(zhǎng)年限上聚類(lèi)較為明顯，其中4＼～5年的樣品含量普遍更高。這表明四川、云南兩產(chǎn)地?zé)o優(yōu)劣之分，種植方式可根據(jù)成本等需求選擇，生長(zhǎng)年限對(duì)質(zhì)量的影響較大，栽培及采收過(guò)程中需注意控制。

4結(jié)束語(yǔ)

本研究建立了金果欖藥材指紋圖譜及多指標(biāo)含量測(cè)定的UPLC方法，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法進(jìn)行分析。結(jié)果表明四川及云南不同來(lái)源的金果欖樣品在化學(xué)成分類(lèi)別上具有一致性，但生長(zhǎng)年限、氣候及土壤等因素會(huì)引起藥材間的質(zhì)量差異，藥材質(zhì)量還需嚴(yán)格把控。建立的方法分析時(shí)間短、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，重復(fù)性、穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度良好；與藥典方法相比，古倫賓測(cè)定值一致；與單一或兩個(gè)含量測(cè)定方法相比[12-13，22-23]，測(cè)定指標(biāo)更多，代表更全面;與現(xiàn)有多指標(biāo)含量方法相比，本法不使用緩沖鹽[15，18]，對(duì)色譜柱損耗更小，采用UPLC進(jìn)行測(cè)定，相比質(zhì)譜更簡(jiǎn)捷[14-15]，成本更低。與現(xiàn)有指紋圖譜方法相比，本法采集的色譜信息更為豐富[16，24]，可為金果欖藥材的質(zhì)量差異性評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制提供方法基礎(chǔ)，也可為后續(xù)金果欖單味制劑或含金果欖制劑的開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供參考。

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（編輯：莫婕）