石斛屬燈籠組物種葉綠體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）05-1372-15

Abstract：To analyze the chloroplast（CP）genome structure and phylogenetic relationships of section Densiflora i the genus of Dendrobium，this studyused high-throughput sequencing technology for the first time to sequence the CP genomes of four species in the section，including D . farmer，D. palpebrae，D. sulcatum，and D.thyrsiflorum. The genomes of section Densiflora were assembled，annotated，mapped and analyzed by bioinformatics software.Phylogenetic trees of 42 species of Dendrobium，including ten species of section Densiflora，were constructed based on cp genomes. The complete cp genomes of section Densiflora were 151 717- 160 123 bp in size with 37.1%-37.6% GC content. Additionally，46-63 simple sequence repeats（SSRs） and 48-49 interspersed nuclear elements （INEs）were identified in section Densiflora. Codon usage in proteincoding genes is biased toward A and U（or T）.There were significant differences inthe coding regions of six genes， including trnK^UUU ， at?F ，rpoC， trnL^UAA ，clpP and among section Densiflora. Phylogenetic analyses revealed that ten species of section Densiflora were clustered into four diferent clades，indicating that this section defined by traditional morphology is non-monophyletic. Key words：Dendrobium section Densiflora;Chloroplast genome;Genomic comparison;Phylogenetic analysis

石斛屬（Dendrobium）隸屬蘭科（Orchidaceae）石斛亞族（Dendrobiinae），與石豆蘭屬（Bulbophyl-lum）構(gòu)成姐妹類群[1]。該屬約有1500種[2]，是蘭科第二大屬，多樣性極高，是蘭科系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的主要疑難類群之一。前人基于形態(tài)學(xué)證據(jù)將該屬進(jìn)一步劃分為多個組（Section），如模式石斛組（Sect.Dendrobium）、茉香組（Sect.Bolbidium）和燈籠組（Sect.Densiflora）等。燈籠組物種以其花朵密生、顏色艷麗、形似燈籠而聞名，如球花石斛 （D thyrsiflorum）、四角石斛（D.farmeri）、角莖燈籠石斛 （D ：palpebrae）、具槽石斛（D.sulcatum）和密花石斛（ D .densiflorum）等都是觀賞類蘭科植物中的明星花卉，深受大眾的喜愛和關(guān)注。該組共含約14種，主要分布于印度至中南半島、馬來半島3；中國產(chǎn)8種，主要分布于西南地區(qū)[4-5]。

形態(tài)學(xué)分類時期，燈籠組的物種最早被Loureiro[界定為Callista屬；Schlechter[將該屬處理為石斛屬的異名，并將該組物種界定為Sect.Callista，但在更早的Finet[8研究將該組物種命名為Sect.Densiflora。在分子系統(tǒng)學(xué)時代，Yukawa基于核基因ITS和葉綠體matK構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系首次揭示該組為非單系[9]。Wongsawad等[10]和Xiang等[4]的分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果均顯示該組物種聚類為三個不同演化分支，而Clements[11]和Liu等[12]的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果則顯示該組物種聚類為兩個不同演化分支。這些基于傳統(tǒng)一代分子標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均支持以形態(tài)學(xué)劃分的燈籠組為非單系，但普遍存在節(jié)點坍塌和支持率低的現(xiàn)象，有關(guān)該組物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚未清晰。

葉綠體基因組（Chloroplastgenome）在構(gòu)建植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上存在諸多優(yōu)勢，如基因組較小，結(jié)構(gòu)簡單保守，進(jìn)化速率適中[13]，能提供大量的位點信息[14]；此外，葉綠體基因組在蘭科植物中為母系遺傳，可避免基因重組等事件造成的分析誤差[15-16]。前人研究表明葉綠體基因組是開展疑難類群系統(tǒng)發(fā)育分析的理想分子標(biāo)記[17]；同時，葉綠體基因組的特征和結(jié)構(gòu)變異一直是研究的熱點，其結(jié)構(gòu)、大小、基因含量和基因順序等在不同類群中均存在差異[18]。但目前有關(guān)燈籠組石斛的葉綠體基因組研究仍存在空缺，NCBI（https：//www.ncbi.

nlm.nih.gov/數(shù)據(jù)庫僅公布該組6個物種的葉綠體基因組，傳統(tǒng)形態(tài)界定的燈籠組物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和葉綠體基因組特征依然不詳。

本研究對四角石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛和球花石斛4個燈籠組物種的葉綠體基因組進(jìn)行全基因組低蓋度測序，結(jié)合NCBI上已公布數(shù)據(jù)，對該組共計10個物種的葉綠體基因組學(xué)進(jìn)行比較和系統(tǒng)發(fā)育研究，分析其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征、密碼子偏好性、重復(fù)序列和高變異熱點區(qū)域，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探討其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究旨在明確石斛屬燈籠組物種葉綠體基因組特征，豐富該組物種的基因組數(shù)據(jù)，以期為其后續(xù)分類和資源開發(fā)利用等工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料四角石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛和球花石斛均為遷地保護(hù)原生物種，其憑證標(biāo)本存于標(biāo)本館（FJFC）。本研究對以上4種石斛進(jìn)行測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中上傳數(shù)據(jù)，GenBank登錄號見表1，并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫上32個石斛屬物種的數(shù)據(jù)，以落葉石豆蘭（Bulbophyllumhirtum）、廣東石豆蘭（B.kwangtungense）短石豆蘭（B.leopardinum）、麥穗石豆蘭（B.orientale）、流蘇貝母蘭（Coelogynefimbriata）、長磷貝母蘭（C.ovalis）半柱毛蘭（Eriacorneri）和白綿毛蘭（E.lasiopetala）共8個物種作為外類群，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，詳細(xì)信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取和測定 使用試劑盒（Plant-MiniKit，Qiagen.CA.USA提取供試四種石斛的植物葉片樣品總DNA，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇符合建庫要求的DNA樣品送往華大基因武漢樣品中心測序。將樣品中的總DNA隨機(jī)打斷，構(gòu)建15ObpDenovo小片段文庫，于Illumina（HiSeq4000）測序儀中進(jìn)行測序，每個樣品獲得20Gb原始數(shù)據(jù)（Rawdata），經(jīng)過濾獲得最終的高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Cleandata）用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.2.2葉綠體基因組序列的組裝注釋和圖譜繪制在Linux系統(tǒng)中通過軟件GetOrganellev1.7.[19]的get_organelle_from_reads.py腳本組裝葉綠體基因組。隨后，通過Bandage[20]手動查看和編輯“fastg\"文件以獲取最終葉綠體序列。利用Geneious11.1.5（https：//www.geneious.com）軟件進(jìn)行注釋工作。選擇基因比較完整、注釋質(zhì)量較好的球花石斛葉綠體基因組（MN306203）作為參考序列，通過GB2sequin[21]和 Dual Organellar GenoMe Annotator（DOGMA）22對其進(jìn)行檢查、注釋，將兩個注釋結(jié)果比對后進(jìn)行人工校正。再將該葉綠體基因組和其他已發(fā)表的石斛屬物種葉綠體基因組進(jìn)行逐一比對檢查，最終獲得質(zhì)量較高的葉綠體基因組。使用OGDRAW1.3.123繪制葉綠體全基因組圖譜。

1.2.3密碼子偏好性分析及重復(fù)序列分析使用Phylosuite[24]軟件提取燈籠組物種的葉綠體基因組所有蛋白質(zhì)編碼基因，用CodonW1.4.2程序25]進(jìn)行相對同義密碼子使用度（Relativesynonymouscodonusage，RSCU）分析，以確定密碼子的偏好性，再利用TBTools聯(lián)合可視化。

1.2.4葉綠體基因組重復(fù)序列分析使用MISA[26]鑒定并定位燈籠組物種葉綠體基因組的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR），參數(shù)選擇10，5，4，3，3，3。使用REPuter軟件27識別分散重復(fù)序列（Interspersednuclearelements，INE），包括正向（Forward）、反向（Reverse）、回文（Palindromic）和互補(bǔ)序列（Complement），參數(shù)選擇最大重復(fù)序列數(shù)為50，最小重復(fù)序列數(shù)為8。

1.2.5葉綠體基因組序列比對分析使用在線IRscope軟件28比較并繪制四角石斛、角莖燈籠石斛和具槽石斛等10種燈籠組物種葉綠體基因組IR邊界收縮和擴(kuò)張情況。

1.2.6 高變異基因篩選利用mVISTA軟件中的Shuffle-LAGAN 程序[29]（https：//genome. lbl. gov/vista/mvista/submit.shtml）將四角石斛、角莖燈籠石斛和具槽石斛等10種燈籠組物種葉綠體基因組序列進(jìn)行比對，檢驗序列差異性。同時，將蛋白質(zhì)編碼基因序列導(dǎo)人MEGA軟件計算并統(tǒng)計變異位點的長度及百分比，以確定變異率較高的基因序列。

1.2.7系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用mafft v7^[30] 對石斛屬及其外類群的葉綠體基因組進(jìn)行比對，比對后的矩陣再使用PhyloSuite[24]平臺的Trimal（Atool forautomated alignment trimming in large-scale phylogeneticanalyses）模塊進(jìn)行校正，獲得葉綠體基因組比對矩陣。

使用PhyloSuite[24]軟件的Convert SequenceFormat模塊將葉綠體全基因組矩陣轉(zhuǎn)換為phy、nex建樹格式文件。將得到的文件在CIPRESScienceGateway V3.3 網(wǎng)站[31]分別利用RAxML-HPC2onACESSS8.2.12、PAUPonACCESS4.a165和MrBayesonACCESS3.2.7a構(gòu)建最大似然法（Maximumlikelihood，ML）最大簡約法（Maximumparsimony，MP）和貝葉斯法（Bayesianinference，BI）的系統(tǒng)發(fā)育樹。ML樹構(gòu)建使用GTRGAT核苷酸替換模型，采用Bootstrap算法，重復(fù)計算1000次，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)[32]。MP樹構(gòu)建采用啟發(fā)式搜索和分支交換算法（Tree-Bisection-Reconnection，TBR），對所有核苷酸性狀進(jìn)行同等加權(quán)處理，用任意重復(fù)1000次的方法進(jìn)行搜索，系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性用10OO次重復(fù)的自展法（Bootstrap）進(jìn)行分析[33]BI樹使用 GTR+I+F 模型構(gòu)建，采用馬爾科夫鏈蒙特卡洛（Markovchainmontecarlo，MCMC）方法，四條馬爾科夫鏈各運(yùn)行10000000代，每100代取樣一次，將前 25% 的樹作為老化樣本（Burn-insamples）舍棄以保證每條鏈達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，最終獲得各個分支的后驗概率值（Posteriorprobability，PP）[34]。運(yùn)用FigTree 1.4.3軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對構(gòu)建完成的ML，MP和BI樹進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1葉綠體基因組基本特征

四角石斛、四翅石斛、聚石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛、球花石斛、長蘇石斛、鼓槌石斛、密花石斛和小黃花石斛的葉綠體基因組均呈雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包含1個小單拷貝區(qū)（SSC）1個大單拷貝區(qū)（LSC）和1對反向重復(fù)序列（IRa和IRb）（圖1）。葉綠體基因組全長范圍為 151717～160123bp 其中最小的為小黃花石斛，最大的為球花石斛?？侴C含量占比為 37.1%～37.6% ；IR區(qū)的GC含量（42.5%～43.4%） 均比LSC區(qū) （34.8%～35.2% ）和SSC區(qū) （29.9%～30.9% 高（表2）。

在基因數(shù)量方面，10個燈籠組物種中共注釋到129～133 個基因，其中包括 72～87 個蛋白編碼基因，8個rRNA基因以及38個tRNA基因。由于IR區(qū)的擴(kuò)增，19個基因發(fā)生復(fù)制事件并呈現(xiàn)互為反向重復(fù)的現(xiàn)象，其中包含7個蛋白編碼基因，8個tRNA基因和4個rRNA基因。

注釋信息結(jié)果顯示，燈籠組物種的葉綠體基因主要涉及自我復(fù)制、光合作用及一些未明確功能的基因。其中，與自我復(fù)制相關(guān)的基因有59個，與光合作用相關(guān)的

基因有36～44個；此外，有6個基因編碼其他類型的蛋白質(zhì)，而功能尚不明確的基因有4個。不同物種之間基因數(shù)量的差異主要來源于ndh基因數(shù)量的變化（表3）。

2.2內(nèi)含子與密碼子偏好性分析

10個燈籠組物種的葉綠體基因組中有17或18個基因包含內(nèi)含子（表4）。其中，15或16個基因包含1個內(nèi)含子（差別在是否有ndhA基因），另外的2個蛋白編碼基因（clpP和ycf3）包含2個內(nèi)含子。在這些包含1個內(nèi)含子的基因中，有9或10個是蛋白編碼基因，6個是tRNA基因。內(nèi)含子的長度變化較大，在 547（rpsI2）～2919bp（trnK^UUU） 之間。

基于RSCU對這些密碼子進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：密碼子 RSCUgt;1 的有30個，除UUG外， RSCUgt;1 的密碼子偏好以A或U結(jié)尾（圖2）。亮氨酸（Leu，由CUA，CUC，CUG，CUU，UUA和UUG編碼）是其編碼率最高的氨基酸，數(shù)量范圍為 1784～2063 個（占比 9.97%～10.25%） 參與編碼；編碼率最低的為半胱氨酸（Cys，由UGU和UGC編碼），數(shù)量范圍為195～229個密碼子（占比 1.09%～1.14%） 。

2.3 重復(fù)序列分析

使用MISA軟件檢測10個燈籠組物種的葉綠體基因組的SSR序列，結(jié)果表明：SSR主要集中在

基因間隔區(qū)（圖3），外顯子和內(nèi)含子區(qū)域中均有分布。SSR含量最高的為四角石斛，最低的為長蘇石斛。

SSR總數(shù)范圍為 46～63 個，共6種類型。其中，單核昔酸占比最大，二核苷酸次之，六核苷酸最??；單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸和五核苷酸

是10種燈籠組石斛共有的4種核苷酸類型；六核苷酸未出現(xiàn)在密花石斛、聚石斛和球花石斛中（圖4）。

燈籠組物種的分散重復(fù)序列數(shù)量差異較小，范圍在48～49個之間，均含有正向重復(fù)序列、反向重

復(fù)序列、回文序列和互補(bǔ)序列；4種類型的重復(fù)序列中回文序列占比最高，互補(bǔ)序列占比最?。▓D5）。

2.4 IR邊界收縮與擴(kuò)張

研究結(jié)果顯示，10個燈籠組物種的基因結(jié)構(gòu)和基因順序大致相似，主要差異體現(xiàn)在IR，SSC和LSC區(qū)的長度不同（圖6）。IRa/LSC邊界種間的分化情況均位于rps19或rpl22和psdA之間，其邊界收縮程度差異不大，在95～117bp之間。密花石斛、四角石斛、聚石斛和四翅石斛的IRb/SSC邊界與ndhF基因相距 277～1174bp ，其余6種IRb/SSC邊界位于ndhF中，ndhF基因有 19～58 bp位于IRb;全部物種IRa/SSC邊界均位于ycf1中，ycf1向IRa區(qū)擴(kuò)張 310～2674bp ，擴(kuò)張程度差異較大。

2.5 變異熱點分析

使用mVISTA軟件對四角石斛、聚石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛和球花石斛等10個燈籠組物種的葉綠體基因組序列比較結(jié)果進(jìn)行可視化分析（圖7），以長蘇石斛的葉綠體基因組序列為對照，結(jié)果顯示：燈籠組物種的葉綠體基因組中，不同區(qū)域的非編碼區(qū)與編碼區(qū)位置大致相同。其中， trnK^UUU atpF，rpoC， trnL^UAA ， cl?P rρll6 這6個基因的編碼區(qū)具有顯著差異，可視化峰圖差異較大。rps16-trm-（204號 Q^UUG ， trnS^GCU-trnG^UCC ，rpoB-trn C^GCA ， petN-psbM，psbM-trnDGUC， trnEUUC-trnTGGU， trnTUGU-trnLUAA，trnF^GAA -ndhJ，atpB-rbcL，psaJ-rpl133，rpl20-rps12，clpP-psbB等12個基因間隔區(qū)的非編碼區(qū)峰圖參差不齊，具有較高的分化度。

燈籠組物種去除假基因化的ndh基因和其余重復(fù)基因后，獲得68個蛋白質(zhì)編碼基因，總長度為58526bp ，變異位點數(shù)為922（平均占比 1.58% ，信息位點數(shù)為 340（0.58%） ；其中，變異位點占比前10的編碼基因為 psaI，psbK，rbcL，rpl14，rpl20，rpl36 rpoA，rpoC2，rps8，ycf1 ；信息位點占比前10的編碼基因為 accD ，cemA，matK，petG，psbJ，psbM，psbT，rbcL，rpl36，rpoA （圖8）。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

用最大似然法（ML）、貝葉斯法（BI和最大簡約法（MP）三種計算分析法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，所得的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，且具有較高的支持率和清晰的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖9）。分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)界定的燈籠組為非單系，在系統(tǒng)樹上共聚類為4個不同演化分支：模式種密花石斛分支（CladeI，含5種），聚石斛分支（CladeII，含3種），長蘇石斛分支（CladeIII，含1種）和鼓石斛分支（CladeIV，含1種）。

3討論

3.1燈籠組石斛葉綠體基因組特征及比較分析

迄今為止在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已公布至少456種的蘭科植物葉綠體基因組，其中光合自養(yǎng)類群約300種，包含的基因數(shù)量多在130個左右；葉綠體基因組的大小范圍介于

131393 bp（大理鎧蘭Corybas taliensis） bp（暖地構(gòu)蘭Cypripediumsubtropicum）[36]。本研究結(jié)果顯示燈籠組物種的葉綠體基因組全長大小范圍為 151717～160123bp，GC 含量范圍為 37.1%～ 37.6% ，其大小位于已公布的蘭科葉綠體基因組范圍內(nèi)；相比其他蘭科植物，該組物種葉綠體基因組大小中等。

在基因含量方面，燈籠組物種基因數(shù)量范圍為129～133個，rRNA和tRNA兩種類型基因的數(shù)量完全一致，但蛋白編碼基因的數(shù)量存在較大差異，范圍為72～87個。造成該現(xiàn)象的最主要原因是在該組部分物種的葉綠體基因組中，與光合作用相關(guān)的ndh基因發(fā)生了丟失或假基因化事件。該現(xiàn)象在蘭科中十分常見，廣泛存在于除擬蘭亞科（Apostasioideae）外的其余四個亞科中，但其形成機(jī)制目前尚不清楚[37]。前人研究認(rèn)為ndh基因的丟失可能與植物的附生生活型相關(guān)，如附生或巖生的指甲蘭亞族、石豆蘭屬和石斛屬均存在ndh基因丟失或假基因化現(xiàn)象[37-40]；而地生型的臺灣杓蘭（C.formosa-num）、大花杓蘭（C.macranthos）和煙色斑葉蘭（Goodyerafumata）均未發(fā)生ndh基因丟失或假基因化[41]。燈籠組物種皆為巖生或附生生活型，本研究發(fā)現(xiàn)其葉綠體基因組皆存在nd基因丟失或假基因化現(xiàn)象，支持ndh基因的丟失或假基因化可能與其生活型密切相關(guān)。

在密碼子偏好性方面，大多數(shù)高等植物的密碼子偏好以A/U（T）結(jié)尾[42]，蘭科植物中也廣泛存在該現(xiàn)象[43-44]。本研究結(jié)果顯示燈籠組物種蛋白編碼基因的密碼子偏好以A/U（T）結(jié)尾，與前人的密碼子偏好性研究結(jié)果相似。在同義密碼子相對使用頻次（RSCU）中，燈籠組石斛有 46.87% 的密碼子RSCU gt;1 ，且其中甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）唯一的密碼子均為RSCU =1 ，其余的密碼子RSCUlt;1 。說明燈籠組石斛對葉綠體基因密碼子的偏好程度基本相同，組內(nèi)差異不大。而四角石斛和小黃花石斛中終止密碼子UAG的 RSCU=1 ，與其他燈籠組石斛物種存在差異，推測可能是進(jìn)化壓力導(dǎo)致[45]

研究中的燈籠組物種的平均占比介于 0%～7% ，有關(guān)石斛屬的三核苷酸含量差異較大的原因仍有待進(jìn)一步探究。

前人研究表明，IR/SC邊界的收縮和擴(kuò)張是葉綠體基因結(jié)構(gòu)變異的主要驅(qū)動力[41]。本研究的10個燈籠組物種的IRa/SSC邊界均位于ycf1基因中，ycfl基因向IRa區(qū)擴(kuò)張 310～2674bp ，擴(kuò)張范圍差異大，該情況大概率是由于IR區(qū)的擴(kuò)張和收縮導(dǎo)致，IR區(qū)擴(kuò)張和收縮的原因可能是基因組重排[50]、基因轉(zhuǎn)移[51等。IR區(qū)邊界的擴(kuò)張和收縮在蘭科植物中經(jīng)常發(fā)生，其變動往往影響SSC區(qū)的范圍[39]。本研究中，鼓槌石斛和長蘇石斛的SSC區(qū)長度均小于14400bp ；小黃花石斛、聚石斛和四翅石斛的SSC區(qū)長度為 14413bp～17935bp ；密花石斛、球花石斛、具槽石斛、角莖燈籠石斛和四角石斛在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，除四角石斛的SSC區(qū)長度為17217bp ，其余物種的SSC區(qū)長度均大于 18 300bp 其SSC區(qū)的長度范圍規(guī)律與本研究的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果相符，證實了IR/SC邊界的變動可能在不同植物群體的演化過程中表現(xiàn)出一定的規(guī)律性，且這一變動與系統(tǒng)發(fā)育存在緊密關(guān)聯(lián)[38]。

對葉綠體基因組數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)編碼基因或非編碼區(qū)的高變異熱點的分析，常用于蘭科的種間系統(tǒng)關(guān)系研究[44]。本研究基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)，對全部的非編碼區(qū)進(jìn)行比較并對68個蛋白質(zhì)編碼基因的長度信息、變異位點以及信息位點進(jìn)行統(tǒng)計，確定了12個非編碼區(qū)中的熱點變異區(qū)和10個變異位點率和信息位點率最高的編碼基因，這些變異區(qū)可作為候選的基因分子標(biāo)記用于屬下分類及種間系統(tǒng)關(guān)系研究。

葉綠體基因組的重復(fù)序列可為分類群的遺傳多樣性和系統(tǒng)關(guān)系研究提供依據(jù)[46]，簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記已被廣泛運(yùn)用于蘭科植物類群中[47]燈籠組石斛以密花石斛為模式種，本研究的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示其與球花石斛、具槽石斛、角莖燈籠石斛、四角石斛聚為一支，其單核苷酸數(shù)量均在30以上，支持了葉綠體基因組的重復(fù)序列與其系統(tǒng)發(fā)育具有關(guān)聯(lián)性。前人關(guān)于SSR的研究顯示，在許多植物中三核苷酸的占比高[48]，但石斛屬內(nèi)不同物種間三核苷酸的占比差值較大，如金釵石斛（ σ_?D .nobile）三核苷酸含量占比高達(dá) 37% （不包括單核苷酸）[49]，而黑喉石斛 （D .ochreatum）占比僅約 4%^[44] 以及本

3.2燈籠組石斛系統(tǒng)發(fā)育分析及分類學(xué)啟示

形態(tài)學(xué)時期，F(xiàn)inet基于花密集，短小的花下顎，唇瓣不完全與其他花部結(jié)構(gòu)連結(jié)的形態(tài)特征進(jìn)行燈籠組的分類界定。隨著分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的發(fā)展，前人利用傳統(tǒng)分子標(biāo)記構(gòu)建的石斛屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系普遍支持形態(tài)界定的燈籠組為非單系[10-11]。但這些研究所采用的基因信息位點有限，結(jié)果普遍存在支持率低、節(jié)點坍塌、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的問題，該組物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚未厘清。葉綠體基因組在蘭科植物中通常為母系遺傳，可避免由于基因重組等事件造成的分析誤差[15-16]，是系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標(biāo)記。本研究基于葉綠體基因組全長構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹整體支持率高且拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)果顯示10個燈籠組物種共聚類成4個不同的演化分支（CladeI～I(xiàn)V），同樣支持傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)界定的燈籠組為非單系。

CladeI分支包括燈籠組模式物種密花石斛以及四角石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛和球花石斛5種，與Xiang等4和Takamiya等52]基于傳統(tǒng)分子標(biāo)記所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果相似；此外，Takamiya等基于傳統(tǒng)分子標(biāo)記的研究支持本研究未取樣的燈籠組其余3種（D.amabile，D.griffithianum和D．guibertii）亦聚類在該分支中。CladeII分支包括聚石斛、四翅石斛和小黃花石斛（四翅石斛是Wei等[53]基于地理分布、形態(tài)差異以及系統(tǒng)發(fā)育分析報道的新隱存種），該分支與景洪石斛（ .D exicle）等4種組成的分支構(gòu)成姐妹類群，而在Xiang等4和Takamiya等[52]的研究結(jié)果中，這兩個分支相距甚遠(yuǎn)，Xiang等4提出將包含聚石斛和小黃花石斛的分支作為一個獨立分類單元（Sect.Lindleyum）的建議。CladeIII和CladeIV分支分別包括長蘇石斛和鼓槌石斛，這兩個分支一同嵌入在石斛組（Sect.Dendrobium）中，與Xiang等[4]和Takamiya等[52]的研究結(jié)果一致，且本研究未取樣的另一燈籠組成員D.harveyanum同樣嵌人在石斛組中[4]。

在形態(tài)特征上，分子證據(jù)支持的CladeI分支包括燈籠組的模式物種密花石斛等8種，該分支物種的莖上部均有數(shù)片葉，花序粗壯且花密，唇瓣顏色明顯深于或區(qū)別于花被其他部分，但長度相似；由聚石斛、四翅石斛和小黃花石斛構(gòu)成的CladeII分支則莖上部僅有一片頂生葉，花序細(xì)長且花稀，唇瓣明顯長于花被其他部分；長蘇石斛（CladeIII）莖上部有數(shù)片葉，花序短且花僅1～2朵，唇瓣具流蘇；鼓槌石斛（CladeIV）莖上部有數(shù)片葉，花序細(xì)長花稀，唇瓣顏色與花被其他部分差別不大[5]。顯著的形態(tài)學(xué)差異亦支持本研究中的燈籠組為非單系的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果。

綜上，傳統(tǒng)形態(tài)定義的石斛屬燈籠組物種應(yīng)該給以重新界定：重新界定的燈籠組包括模式物種密花石斛以及四角石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛、球花石斛 ?_?D .amabile， D ：griffithianum和D. guibertii等8種；而小黃花石斛、聚石斛、四翅石斛、長蘇石斛、鼓槌石斛和 D .harueyanum等6種建議移出燈籠組，其中前3者組成獨立分支，后3者歸屬石斛組，但這些物種的系統(tǒng)發(fā)育位置仍有待進(jìn)一步厘清。

4結(jié)論

本研究通過全基因組低蓋度測序技術(shù)，首次組裝并報道了四角石斛、角莖燈籠石斛、具槽石斛和球花石斛4個石斛屬燈籠組物種的葉綠體基因組序列，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫已公開的6個數(shù)據(jù)，分析10個燈籠組物種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。燈籠組物種的葉綠體基因組全長大小范圍為151717～160123bp，GC含量范圍為37.1%～37.6% ；蛋白編碼基因的密碼子偏好以A/U（T）結(jié)尾；SSR總數(shù)范圍為 46～63 個，六核苷酸未出現(xiàn)在密花石斛、聚石斛和球花石斛中；基因組IR邊界收縮程度差異不大； trnK^UUU ， atpF，rpoC，trn– L^vAA，clpP，rpl76 這6個基因的編碼區(qū)具有顯著差異；系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)基于傳統(tǒng)形態(tài)定義的燈籠組為非單系，支持小黃花石斛、聚石斛、四翅石斛、長蘇石斛、鼓槌石斛和 D .harueyanum這6個物種移出燈籠組。本研究為燈籠組的物種鑒定、分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳育種及系統(tǒng)進(jìn)化等研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]PRIDGEONAM，CRIBBPJ，CHASEMW，etal.Genera orchidacearumVolume6：epidendroideae[M].Oxford：Oxford UniversityPress，2009：1-544

[2] CHASEMW，CAMERONKM，F(xiàn)REUDENSTEINJV，et al.An updated classification of orchidaceae[J].Botanical Journal of theLinneanSociety，2015，177（2）：151-174

[3] WOOD H P.The Dendrobiums[M.Ruggell：Gantner Verlag，2006：491-492

[4] XIANG XG，SCHUITEMANA，LID Z，et al. Molecular systematics of Dendrobium（Orchidaceae，Dendrobieae）from mainland Asia based on plastid and nuclear sequences[J]. MolecularPhylogeneticsand Evolution，2013，69（3）：950-960

[5] CHENX，LIU Z，ZHUG，et al.Flora of China[M].Beijing： SciencePress，2009：374-376

[6] LOUREIRO JD. Flora Cochinchinensis：sistens plantas regno cochinchina nascentes，quibus accedunt aliae observatae sinensi imperio，africa orientali，indiaeque locisvariis，omnes dispositae secundum systema sexuale linaeanum [M].Ulyssipone： Typis，et expensisAcademicis，1790：516-519

[7] SCHLECHTER R. Die Orchidacean von Deutsch-NeuGuinea.1O3.Ascoglossum[J].Repertorium Specierum Novarum RegniVegetabilis，Beihefte，1912（1）：401-560

[8] FINET M E A. Enumeration des espPcesde genre Dendrobium（Orchidées）formantlacollectionduMuséumdeParis[J]. BulletinduMuséumNationald'HistoireNaturelle（Paris），1903 （9）：295-303

[9]YUKAWA T，KITA K，HANDA T. DNA phylogeny and morphological diversification of Australian Dendrobium（Orchidaceae）[J]． Monocots：Systematics and Evolution. Collingwood：CSIRO，2000（6） ：465-471

[10]WONGSAWADP，HANDAT，YUKAWA T.Molecular phylogeny of Dendrobium Densiflora-Dendrobium complex [C]//Proceedings of the 17th World Orchid Conference：“Sustaining Orchids for the Future”2O02，Natural History Publications （Borneo） Sdn Bhd，2005：131-133

[11] CLEMENTS M A. Molecular phylogenetics systematics in Dendrobieae（Orchidaceae）[J].Aliso，2006，22（1）：465-480

[12]LIU HM，F(xiàn)ANG C X，ZHANG T M， et al. Molecular authentication and differentiation of Dendrobium species by rDNA ITS region sequence analysis [J]．Applied Microbiology and Biotechnology Express，2019（9）：1-9

[13]SMITH D R，KEELING PJ.Mitochondrial and plastid genome architecture ： reoccurring themes， but significant diferences at the extremes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112 （33）：10177-10184

[14］洪森榮，林順來，李盈萍，等．甜高梁葉綠體基因組特征及密 碼子偏好性分析[J]．草地學(xué)報，2023，31（12）：3636-3650

[15]MASON-GAMERRJ，WEILCF，KELLOGGEA. Granule-bound starch synthase：structure，function，and phylogenetic utility[J].Molecular Biology and Evolution，1998，15（12）： 1658-1673

[16] GITZENDANNER M A，SOLTIS P S，WONG G K，et al. Plastid phylogenomic analysis of green plants：a bilion years of evolutionary history[J].American Journal of Botany，2018，105 （3）：291-301

[17]LI MH，LIU D K，ZHANGGQ，et al.A perspective on crassulacean acid metabolism photosynthesis evolution of orchids on diferent continents： Dendrobium as a case study[J]. Journal of Experimental Botany，20l9，70（22）：6611-6619

[18]FIRETTIF，ZUNTINIAR，GAIARSAJW，etal.Complete chloroplast genome sequences contribute to plant species delimitation： a case study of the Anemopaegma species complex[J]. American Journal ofBotany，20l7，104（10）：1493-1509

[19]JIN JJ，YU WB，YANG JB，et al. GetOrganelle：a fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes[J]. Genome Biology，2020，21（1）：241

[20]WICK RR，SCHULTZ MB，ZOBEL J，et al.Bandage：inter active visualization of de novo genome assemblies[J].Bioinfor matics，2015，31（20）：3350-3352

[21]LEHWARK P，GREINER S. GB2sequin-A file converter preparing custom GenBank files for database submission [J]. Genomics，2019，111（4）：759-761

[22]WYMAN S K，JANSEN R K，BOORE JL. Automatic annotation of organellar genomes with DOGMA[J].Bioinformatics， 2004，20（17）：3252-3255

[23] GREINER S，LEHWARK P，BOCK R. OrganellarGenomeDRAW（OGDRAW）version 1.3.1： expanded toolkit for the graphical visualization of organelar genomes[J].Nucleic Acids Research，2019，47（W1）：W59-W64

[24] ZHANG D，GAO FL，JAKOVLIC I，et al. PhyloSuite：an integratedand scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies[J].Molecular EcologyResources，2020，20（1）：348-355

[25]MEADEJC，SHAHP H，LUSHBAUGH W B. Trichomonas vaginalis ： analysis of Codon usage[J]. Experimental Parasitology，1997，87（1）：73-74

[26]BEIER S，THIEL T，MUNCH T，et al. MISA-web：a web server for microsatellite prediction[J].Bioinformatics，2O17，33 （16）：2583-2585

[27]KURTZ S，CHOUDHURIJV，OHLEBUSCH E，et al. REPuter：the manifold applications of repeat analysis ona genomic scale[J]．Nucleic Acids Research，20o1，29（22）： 4633-4642

[28] AMIRYOUSEFI A，HYVONEN J，POCZAI P. IRscope： an online program to visualize the junction sites of chloroplast genomes[J]. Bioinformatics，2018，34（17） ：3030-3031

[29]MAYOR C，BRUDNO M，SCHWARTZJR， et al. VISTA： visualizing global DNA sequencealignments of arbitrary length [J].Bioinformatics，2000，16（11）：1046-1047

[30]KATOH K，STANDLEY D M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7：improvements in performance and usability[J].MolecularBiologyand Evolution，2013，30（4）： 772-780

[31] MILLER M A，PFEIFFER W，SCHWARTZ T. Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees[C]//2O1o Gateway Computing Environments Workshop （GCE）.IEEE，2010：1-8

[32] STAMATAKIS A，HOOVER P，ROUGEMONT J. A rapid bootstrap algorithm for the RAxML Web servers[J].Systematic Biology，2008，57（5）：758-771

[33] SWOFFORDD L. Phylogenetic analysis using parimony [M].4th ed.Sunderland，Massachusetts： Sinauer Associates， 2002：1-52

[34]RONQUISTF，TESLENKOM，VANDERMARKP，et al. MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space[J]. Systematic Biology，2012，61（3）：539-542

[35]WANG HC，YANG J，SUN WB.Complete chloroplast genome of the endangered Corybas taliensis（Orchidaceae），a plant species with extremely small populations endemic to China [J].Mitochondrial DNA Part B，2020，5（2）：1884-1885

[36] GUO Y Y，YANG JX，LIHK，et al. Chloroplast genomes of two species of Cypripedium：expanded genome size and proliferation of AT-biased repeat sequences[J].Frontiers in Plant Science，2021（12）：609729

[37]LIU D K，TU X D，ZHAO Z，et al. Plastid phylogenomic data yield newand robustinsights into thephylogenyof CleisostomaGastrochilusclades（Orchidaceae，Aeridinae）[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2020（145）：106729

[38]ZAVALA-PAEZM，VIEIRALD N，DEBAURAVA，et al.Comparative plastid genomics of Neotropical Bulbophyllum （Orchidaceae;Epidendroideae）[J].Frontiers in Plant Science， 2020（11）：799

[39]KIMYK，JOS，CHEONSH，etal.Plastomeevolutionand phylogeny of Orchidaceae，with 24 new sequences[J]. Frontiers in Plant Science，2020（11）：22

[40]KIMYK，JOS，CHEONSH，etal.Plastome evolution and phylogeny of subtribeAeridinae（Vandeae，Orchidaceae）[J]. MolecularPhylogeneticsand Evolution，2020（144）：106721

[41]LUOJ，HOUBW，NIUZT，etal.Comparative chloroplast genomes of photosynthetic orchids：insights into evolution of the Orchidaceae and development of molecular markers for phylogenetic applications[J]. PLos One，2014，9（6）：e99016

[42]郭松，梁湘蘭，彭姿，等，莓葉委陵菜葉綠體基因組特征及其 系統(tǒng)發(fā)育分析[J].草地學(xué)報，2024，32（11）：3383-3390

[43]NIUZT，XUEQY，WANGH，etal.Mutationalbiasesand GC-biased gene conversion affect GC content in the plastomes ofDendrobium genus[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（11）：2307

[44]杜致輝，楊瀾，張朝君，等．黑喉石斛葉綠體基因組特征及比 較分析[J].熱帶作物學(xué)報，2021，42（11）：3111-3119

[45]鄧鳥絮，羅中元，孫志軒，等．螺旋果苜蓿組葉綠體基因組進(jìn) 化和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].草地學(xué)報，2024，32（8）：2394-2407

[46]GUISINGERMM，CHUMLEYTW，KUEHLJV，etal. Implications of the plastid genome sequence of Typha（Typhaceae，Poales）for understanding genome evolution in Poaceae [J].JournalofMolecularEvolution，2010，70（2）：149-166

[47]HUANGY，LIF，CHENKS.Analysis of diversity and relationshipsamongChineseorchid cultivarsusingEST-SSRmark ers[J].Biochemical Systematics and Ecology，2OlO，38（1）： 93-102

[48]KUMPATLA S P，MUKHOPADHYAY S.Mining and survey of simple sequence repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous species[J].Genome，2005，48（6）：985-998

[49]LUJJ，KANGJY，F(xiàn)ENGSG，etal.TransferabilityofSSR markersderivedfromDendrobiumnobileexpressed sequence tags（ESTs）and their utilization in Dendrobium phylogeny analysis[J].ScientiaHorticulturae，2O13（158）：8-15

[50]GOULDING SE，OLMSTEADRG，MORDENCW，etal. Ebband flowof the chloroplast inverted repeat[J].Molecular amp;General Genetics，1996，252（1/2）：195-206

[51]DOWNIE S R，JANSEN R K.A comparative analysisof wholeplastid genomes from the Apiales：expansion and contractionof the inverted repeat，mitochondrial to plastid transferof DNA，and identification of highly divergent noncoding regions [J].Systematic Botany，2015，40（1）：336-351

[52]TAKAMIYAT，WONGSAWADP，SATHAPATTAYANONA，et al. Molecular phylogenetics and character evolution ofmorphologically diverse groups，Dendrobium section Dendro bium and allies[J].AOB Plant，2014（6）：plu045

[53]WEICY，LIRY，WUYW，etal.Dendrobium tetrapterum，a cryptic species in theD. lindleyialliance（Orchidaceae;Dendrobiinae）：evidence from morphological and molecular data[J]. Phytotaxa，2024，655（2）：209-218

（責(zé)任編輯劉婷婷）