新疆地區(qū)奶疙瘩中乳酸菌的篩選及其特性研究

Screening Characterization Lactic Acid Bacteria in Cheese in Region

GUANPeibin'， XU Huil*， YU Ruihong2， ZHENG Fang2，WEI Shuhai2 （1. ， ， 0710oo， China; 2. ， ， 8410o0， China）

Abstract： As a traditional fermented dairy product， cheese is rich in a variety lacticacid bacteria resources，but many species have not been fully explored.In this study，traditionalcheese samples colected from different regions were used as the objects.Lactic acid bacteria were isolated purified by MRS medium， the strains were identified bycombining morphological observation， Gram staining 16SrRNA gene sequencing.Their safety tolerance were systematically evaluated.Atotal threelactic acid bacteria strains were isolated in the studynamelyLactobacillus paracasei G06，Pediococcus acidilactici GO8， Lactiplantibacillus plantarum G21.Tolerance safety evaluation showed that these strains were sensitive to at least 7antibiotics to varying degrees， none them had hemolysis，indicating that they have the potential to be used as food fermentation agents.This study provides a theoretical basis for the development microbial resources for specialty dairy products the preparation probiotic preparations.

Keywords： cheese; lactic acid bacteria screening; probiotic characteristics;antibacterial activity;16S rRNA identification

乳酸菌（LacticAcidBacteria，LAB）是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的統(tǒng)稱[1，在食品、醫(yī)藥、飼料等多個領(lǐng)域具有廣泛應用價值。在食品工業(yè)中，乳酸菌不僅能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機酸，降低食品pH值，抑制有害微生物生長，延長食品保質(zhì)期，還能產(chǎn)生特殊的風味物質(zhì)，改善食品的質(zhì)地和口感。例如，在酸奶、發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品的生產(chǎn)中，乳酸菌發(fā)揮著關(guān)鍵作用，賦予產(chǎn)品獨特的風味和質(zhì)地。在醫(yī)藥領(lǐng)域，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、增強機體免疫力的功能，可預防和治療腸道疾病。

奶疙瘩作為新疆地區(qū)極具特色的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，承載著當?shù)刎S富的飲食文化。其通常是將牛、羊奶等經(jīng)過自然發(fā)酵后，去除乳清，再經(jīng)晾曬或烘干等工藝制成[2]。在奶疙瘩的自然發(fā)酵過程中，多種微生物參與其中，乳酸菌是其中的優(yōu)勢菌群之一。然而，由于新疆地域廣闊，不同地區(qū)的奶疙瘩在原料、制作工藝、發(fā)酵環(huán)境等方面存在差異，導致其中乳酸菌的種類和特性也可能有所不同。

目前，針對新疆地區(qū)奶疙瘩中乳酸菌的研究相對較少。深人研究新疆不同地區(qū)奶疙瘩中的乳酸菌，篩選具有優(yōu)良特性的乳酸菌菌株，對于開發(fā)具有新疆特色的發(fā)酵乳制品、提升產(chǎn)品品質(zhì)、保護和傳承新疆傳統(tǒng)乳制品文化具有重要意義。優(yōu)良的乳酸菌菌株可用于優(yōu)化奶疙瘩的制作工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，同時也可為新型發(fā)酵乳制品的研發(fā)提供新的菌種資源。基于此，本研究旨在對新疆地區(qū)奶疙瘩中的乳酸菌進行篩選，并對其特性進行系統(tǒng)研究，為新疆特色乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料與設備

本研究所用奶疙瘩均為新疆不同地區(qū)少數(shù)民族利用傳統(tǒng)方法發(fā)酵制得。MRS培養(yǎng)基（青島海博生物）、革蘭氏染色液試劑盒（青島海博生物）、芽孢染色液（ 5% 孔雀綠水溶液， 0.5% 番紅水溶液）、3% 過氧化氫溶液（由 30% 過氧化氫溶液稀釋10倍制得）。

SW-CJ-1D超凈工作臺（滬凈凈化）、Vortex-M迷你漩渦混合器（上海滬析）BM252電子秤（AND）LDZF-30L高壓滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

參照彭斌等[3的研究方法并適當修改。在超凈工作臺中稱取粉碎的奶疙瘩 5g ，放入盛有 45mL 無菌水的三角瓶中，加入適量玻璃珠，置于搖床上150～200r?min^-1 振蕩 30min ，使奶疙瘩充分分散，制成 10^-1 稀釋度的菌懸液。用 1mL 無菌移液器吸取1mL10^-1 菌懸液，加入盛有 9mL 無菌水的試管中，充分混勻，重復上述操作，依次制備稀釋度為 10^-2 /10^-3 、 10^-4 一 10^-5 ！ 10^-6 、 10^-7 10^-8 的菌懸液，分別吸取菌懸液 100μL 加入已滅菌并冷卻至 左右的MRS培養(yǎng)基中，迅速搖勻后倒人無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固。每個稀釋度做3個重復，置于 37^°C 厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 48h 。

1.2.2 菌株初篩和種屬鑒定

通過形態(tài)學觀察、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、H₂O₂ 試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗和吲哚試驗對純化后的單菌落進行分類鑒定，具體步驟參照林瑛蘭等[4的研究方法。

將所篩菌株送往上海生工生物工程股份有限公司進行16SrDNA序列測定[5]。將獲得的菌株保存至甘油管中，于 -80^°C 超低溫冰箱保藏備用。

1.2.3 耐受性和安全性測定

對篩選獲得的菌株的藥敏性進行測定，具體步驟參照RODRIGUES等的研究方法。同時，將接種菌株的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基置于 37^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后，觀察其有無溶血現(xiàn)象，即利用溶血性試驗對菌株的安全性進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株分離及鑒定

2.1.1 分離菌株初步鑒定

從奶疙瘩樣品中共篩選獲得18株外觀具有乳酸菌特征的菌株，得到革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶試驗、 H₂O₂ 試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗和吲哚試驗均為陰性的菌株3株，可初步判定為乳酸菌[]。具體生化實驗結(jié)果如表1所示。

2.1.2分離菌株16S rDNA分子生物學鑒定

對分離菌株進行16SrDNA測序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。確定G06為干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei），Go8為乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici），G21為植物乳桿菌（Lactiplantibacillusplantarum）。

2.2 菌株安全性和耐受性測定分析

抗生素藥物敏感性試驗和溶血性試驗是評價益生菌特性的有效方法，其結(jié)果對菌株的安全性和耐

受性評判具有重要指導意義。如表2所示，3株乳酸菌至少對7種抗生素具有不同程度的敏感性，且均無溶血現(xiàn)象，對人體無危害。因此，3株乳酸菌均可用于食品發(fā)酵領(lǐng)域。

3結(jié)論

本研究從新疆奶疙瘩中分離得到18株外觀具有乳酸菌特征的菌株，再通過篩選得到革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶試驗、 H₂O₂ 試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗和吲哚試驗均為陰性的菌株3株，初步判定其均為乳酸菌。經(jīng)過16SrDNA序列測定，發(fā)現(xiàn)GO6為干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei），G08為乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici），G21為植物乳桿菌（Lactiplantibacillusplantarum）。3株乳酸菌至少對7種抗生素具有不同程度的敏感性，且均無溶血現(xiàn)象，說明其在工業(yè)生產(chǎn)中有較好的應用前景。

參考文獻

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