紙基微流控芯片的構(gòu)建及其在檸檬黃檢測中的應(yīng)用

Construction of Paper-Based Microfluidic Chip and Its Application in Tartrazine Detection

WU Hongjing， LI Ziyu， XU Wenyi， NING Siying， LIU Ting （College ofScience and Technology，Nanchang University， Jiujiang ， China）

Abstract： In this paper，a fast and simple paper-based microfluidic detection method was developed based on the specific adsorption properties of polyamide films. Based on the color reaction and pH value response mechanism of tartrazine and Cu²⁺ ，the detection can be completed within 10min .The results show that the detection limit of the chip is 0.005mg?mL^-1 ，which has good stability and reliability，and has certain crossreaction to sunset yellow. Compared with the traditional method for detecting tartrazine，the paper based microfluidic method has the advantages of simple operation and no need for complex instruments.Eight samples randomly selected onthe market were tested，and through software analysis and visualization methods，it was posible to intuitively determine whether tartrazine was added to the sample.The method is suitable for rapid detection and screening in food field.

Keywords： tartrazine; rapid detection; paper-based microfluidic chip

檸檬黃（E102）作為一種人工合成偶氮類食用色素，憑借其優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、經(jīng)濟性及顯色性能，被廣泛應(yīng)用于飲料、烘焙制品等食品工業(yè)領(lǐng)域。盡管該色素在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物未表現(xiàn)出顯著毒性，但過量攝入可能引發(fā)腸道菌群失調(diào)、代謝功能紊亂、神經(jīng)發(fā)育異常等潛在健康風(fēng)險。目前，常規(guī)檢測手段如紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法等[]，雖具有較高的靈敏度，但普遍存在儀器設(shè)備昂貴、操作流程復(fù)雜、檢測周期較長以及對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求較高等局限性。針對食品工業(yè)現(xiàn)場的快速篩查需求，開發(fā)低成本、高通量、易操作的即時檢測技術(shù)已成為當前研究熱點[2-4]

微流控芯片技術(shù)是一種基于微米級通道網(wǎng)絡(luò)精確操控微量流體（通常在納升至微升級）的前沿分析技術(shù)[5]。其核心優(yōu)勢在于通過微結(jié)構(gòu)設(shè)計實現(xiàn)流體的定向傳輸、高效混合及精準分離。2001年，WHITESIDES等[將濾紙作為微流控元件基底材料，利用其天然毛細作用實現(xiàn)無泵驅(qū)動流體控制，由此發(fā)展出紙基微流控分析裝置[]。該技術(shù)通過蠟印[8]光刻、噴墨蝕刻[10等工藝構(gòu)建微流道網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合比色、電化學(xué)、熒光等檢測方式，為現(xiàn)場快速檢測提供了創(chuàng)新解決方案。

本文選用聚酰胺薄膜為芯片基底材料，通過優(yōu)化表面修飾工藝構(gòu)建三維微流控網(wǎng)絡(luò)?；跈幟庶S與 Cu²⁺ 在酸性介質(zhì)中的特異性顯色反應(yīng)（特征吸收峰位移至綠色波段）[]，結(jié)合pH值響應(yīng)型吸附－解吸機制[12（樣品在 pH=3.2 條件下通過靜電作用吸附于芯片功能化表面，隨后在 pH=9.6 緩沖體系中實現(xiàn)目標物的高效解吸）進行檢測。解離后的顯色復(fù)合物經(jīng)比色傳感器定量檢測，可在 10min 內(nèi)完成，優(yōu)于傳統(tǒng)分析方法[13]

1材料與方法

1.1實驗材料

隨機抽取市售果汁飲料8種，編號分別為 1～8 。

1.2儀器與試劑

AL104電子分析天平，梅特勒－托利多儀器有限公司；紫外分光光度計，屹譜儀器制造（上海）有限公司；GZ-93自動雙重純水蒸餾水器，上海亞榮生化儀器廠；HH-S3三溫恒溫水浴鍋，上海昶冠電子科技有限公司。

聚酰胺薄膜，臺州四甲生化塑料廠；檸檬黃標準品，上海染料研究所有限公司；日落黃標準品，上海染料研究所有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉、正丁醇、氨水及無水硫酸銅，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；維生素C、磷酸氫二鉀，西隴科學(xué)股份有限公司；檸檬酸鈉，北京博奧森生物技術(shù)有限責任公司；無水乙醇，上海泰坦科技股份有限公司；檸檬酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。上述試劑均為分析純。

緩沖劑（A液）： 0.1mol?L^-1 檸檬酸、 0.1mol?L^-1 磷酸氫二鉀不同體積比配制緩沖溶液（ pH=4.3 ）；解吸溶液（B液）：無水乙醇-氨水－水（體積比為12：2：1 ）；顯色劑（C液）： 20mg?mL^-1 硫酸銅溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1紙基微流控芯片的制備

選取尺寸為 5cm×5cm 的正方形聚酰胺薄膜，獲取百合花型圖案并打印，隨后將其復(fù)刻于聚酰胺薄膜之上。利用尖銳工具依據(jù)圖形除去聚酰胺粉，構(gòu)建疏水通道，并將各檢測區(qū)分隔開。

1.3.2 紙基芯片最優(yōu)條件的考察

（1）檸檬黃標準溶液的配制。準確稱取 0.05g 檸檬黃粉末，置于 500mL 容量瓶中，加水溶解并定容，制備得到濃度為 0.1mg?mL^-1 的檸檬黃標準溶液。

（2）不同濃度硫酸銅溶液的配制。分別準確稱取0.0.5，1.0，2.0，3.0g 和 5.0g 硫酸銅固體于小燒杯中，加入蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中并定容，配制成濃度分別為0、5、10、20、 30mg?mL^-1 和50mg?mL^-1 的硫酸銅溶液。

（3）顯色劑最佳濃度的確定。取6支潔凈試管，各加入 1mL 檸檬黃標準溶液，滴加A液，調(diào)節(jié)pH值至 3.5～4.5 。隨后用量程為 20μL 的移液槍分別吸取上述溶液 10μL 加入芯片的6個檢測區(qū)，待溶液充分吸收后加入B液，再分別加入上述不同濃度的硫酸銅溶液。觀察各檢測區(qū)溶液的顏色變化情況，拍照后進行顏色提取與分析，判斷顯色劑的最佳濃度。

（4）最佳反應(yīng)時間的確定。吸取 1mL 檸檬黃標準溶液于試管中，加入A液。利用移液槍吸取上述溶液 10μL 加入檢測區(qū)，待樣品吸收后加入B液，隨后加入C液。分別在加入C液2、3、5、10、30min 和 60min 后，觀察顏色變化，方法同1.3.2（3）步驟，以此確定最佳反應(yīng)時間。

1.3.3紙基芯片方法學(xué)驗證

（1）檸檬黃最低檢測濃度的確定。分別吸取0、50、100、300、400、500、 1000μL 和 2 000μL 檸檬黃標準液于 10mL 容量瓶中，加蒸餾水定容，制成濃度分別為 0， 0.0005， 0.0010， 0.0030， 0.0040， 0.0050、 和 的檸檬黃溶液。取上述不同濃度的檸檬黃溶液各 1mL 于試管中，同1.3.2（3）步驟確定檸檬黃能夠引起顏色變化的最低濃度。

（2）芯片耐用性的確定。分別對溫度、光照、濕度影響進行考察，確定芯片的耐用性。

（3）干擾試驗。分別吸取2.0、2.5、3.0、 3.5mL 和 4.0mL 檸檬黃標準溶液于試管中，分別與 1% 葡萄糖溶液、 1% 蔗糖、 0.0075% 維生素C溶液、 0.05% 氯化鈉、 0.2% 檸檬酸鈉、 0.01% 日落黃混合，使總體積均為 5mL ，同1.3.2（3）步驟考察上述物質(zhì)對芯片的檢測是否產(chǎn)生干擾影響。

（4）回收率的測定。移取 檸檬黃標準溶液于 100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，配制成 0.03mg?mL^-1 的檸檬黃標準溶液；各移取20mL 經(jīng)處理過的飲料于3個 50mL 容量瓶中，依次加入 0.03mg?mL^-1 檸檬黃溶液10、 20mL 和 30mL ，用蒸餾水稀釋至刻度，在最大吸收波長 426nm 處測定其吸光度，計算檸檬黃的回收率。

（5）樣品的芯片檢測及陰性樣品加標實驗。分別各取 1mL 的8種樣品于試管中，按照1.3.2（3）步驟，確定微流控芯片的陽性檢出率；取陰性樣品，加入標準檸檬黃溶液，使其最終濃度為 0.03，0.05mgmL^-1 和 0.08mg?mL^-1 ，再用芯片檢測，確定陽性檢出率。1.3.4樣品的紙層析定性檢測和分光光度計定量檢測

采用紙層析法檢測樣品中是否含有檸檬黃[14]對紙層析法檢測出的陽性樣品采用分光光度法樣品進行定量測定[15]

2 結(jié)果與分析

2.1芯片的構(gòu)建

紙基芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計通常呈現(xiàn)為“十”字形或“米”字形（圖1）。這種結(jié)構(gòu)布局旨在便于在交叉點位置添加樣本，隨后樣本能夠憑借毛細作用力被吸收并流向檢測區(qū)域。然而，當采用聚酰胺作為檢測平臺時，由于聚酰胺材料對色素具有較強的吸附能力，大部分色素會被直接吸附在上樣區(qū)域，無法順利流動至檢測區(qū)域。因此，在本實驗中，樣品完成上樣并被吸附后，直接在上樣區(qū)域添加顯色劑進行反應(yīng)，即上樣區(qū)同時充當檢測區(qū)的角色。

選用聚酰胺薄膜作為芯片的基底材料，將百合花形圖案復(fù)刻于芯片之上，并借助尺子構(gòu)建疏水圖案。所制得的紙基芯片（圖2）不僅外觀精美，而且具備同時檢測6個樣品的能力，有利于不同樣品間的顏色對比分析。

2.2 紙基芯片的最優(yōu)條件

2.2.1 顯色液的最佳濃度

采用不同濃度的硫酸銅溶液作為顯色劑進行實驗，結(jié)果如圖3所示。當硫酸銅溶液濃度為 10mgmL^-1 時，即可使檸檬黃標準溶液發(fā)生變色反應(yīng)，且隨著檸檬黃濃度的逐漸升高，溶液的顏色變化更明顯。在實際樣品本身顏色較深，且檸檬黃的添加量相對較少的情況下，若使用低濃度的硫酸銅溶液，會導(dǎo)致顯色不夠明顯，難以準確觀察和判斷；而使用高濃度的硫酸銅溶液，則可能會對顏色變化的判斷產(chǎn)生干擾，影響實驗結(jié)果的準確性。

綜合考慮上述因素，最終確定采用中間濃度，即 20mg?mL^-1 的硫酸銅溶液作為顯色液，以確保在不同實驗條件下均能獲得較為準確、可靠的顯色效果，為后續(xù)的檢測和分析提供有力保障。

2.2.2 最佳反應(yīng)時間的確定

微流控芯片在不同反應(yīng)時間下的顯色變化結(jié)果如圖4所示。隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)體系的顏色變化逐漸減弱。由于在反應(yīng)過程中，芯片上的溶液會逐漸失水，溶液濃度發(fā)生變化，從而對顏色變化產(chǎn)生影響。因此，為確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性，將反應(yīng) 10min 作為最佳反應(yīng)時間，此時顏色變化最為顯著且穩(wěn)定，能夠更準確地反映真實情況，

2.3 芯片的方法學(xué)驗證

2.3.1 微流控芯片最低檢測濃度的確定

根據(jù)1.3.3（1）方法配制不同濃度梯度的檸檬黃溶液，并采用微流控芯片進行檢測。結(jié)果顯示，當檸檬黃濃度為 0.005mg^?mL^-1 時，微流控芯片即可將其檢出，且隨著檸檬黃濃度的逐漸增加，呈現(xiàn)的顏色更明顯。

依據(jù)《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》（GB2760—2024），合成色素檸檬黃在飲料食品中的最大允許添加量為 0.1g?kg^-1 。經(jīng)計算可知，本實驗所采用的微流控芯片檢測靈敏度可達國家標準最大添加量的 5% ，表明芯片檢測靈敏度較好。

2.3.2芯片耐用性的確定

（1）溫度影響。以室溫下檸檬黃的保存率為基準，發(fā)現(xiàn) 4‰ 時檸檬黃保存率有所降低，而 及 時檸檬黃保存率均有所升高（表1）。芯片在不同溫度條件下的樣品中均能成功檢測出檸檬黃，這表明溫度變化對芯片的檢測性能無明顯影響。

（2）光照影響。以正常光照條件下檸檬黃的吸光度為基準，陽光直射及黑暗環(huán)境下檸檬黃的保存率均有所降低（表2）。芯片在這些光照條件下能夠準確檢出檸檬黃，說明光照條件對芯片的檢測結(jié)果無明顯影響。

（3）濕度影響。芯片在濕度為 75% 的環(huán)境中，分別于0、24、 48h 和 ^72h 進行檢測，結(jié)果均顯示能夠正常檢出檸檬黃，表明芯片在一定濕度范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。

2.3.3 其他物質(zhì)的干擾試驗

選取6種不同物質(zhì)作為干擾因素，分別與不同濃度的檸檬黃溶液混合，通過芯片檢測觀察其是否會對檸檬黃的顯色反應(yīng)產(chǎn)生影響，結(jié)果如表3所示。當體系中存在日落黃時，會使檸檬黃的混合液無法變?yōu)榫G色，從而對檢測結(jié)果的判斷產(chǎn)生干擾。當檸檬黃溶液濃度達到 0.09mg?mL^-1 時，日落黃對檸檬黃的檢測不再產(chǎn)生影響，芯片能夠準確檢出檸檬黃。這表明在一定濃度范圍內(nèi)，日落黃的干擾可以被消除，芯片對檸檬黃的檢測具有一定的特異性和準確性。

2.4紙層析法與紫外檢測結(jié)果

2.4.1紙層析法檢測樣品結(jié)果

采用紙層析法對8種飲料中的檸檬黃進行測定，實驗結(jié)果顯示2號、4號和8號3種樣品中均含有檸檬黃。

2.4.2紫外分光光度法檢測陽性樣品濃度

采用紫外分光光度法對上述3種陽性樣品進行進一步檢測。通過測定吸光度并結(jié)合標準曲線，計算得到3種陽性樣品中檸檬黃的濃度分別為0.0265、0.014 8、 。同時，對飲料中檸檬黃的回收率進行計算，結(jié)果如表4所示。檸檬黃的平均回收率在 90.83%～ 97.50% ，表明該方法具有較高的準確性和可靠性。

2.5樣品微流控芯片的檢測結(jié)果

取8種樣品用微流控芯片進行檢測，實驗結(jié)果如圖5所示。芯片檢出樣品4號、6號、8號均含檸檬黃。

取芯片檢測結(jié)果為陰性的1、2、3、5、7號樣品進行加標實驗，采用紙基芯片進行檢測。檢測結(jié)果顯示，加標后除2號樣品外，其余樣品均呈陽性反應(yīng)。

2.6芯片法與紙層析法的結(jié)果比較

采用紫外分光光度法對芯片法未檢出檸檬黃的2號樣品進行檢測，結(jié)果顯示2號樣品中含有檸檬黃（見表5中2號樣品）。對照2號樣品的配料表，推測可能是由于檸檬黃濃度較低，而含有的日落黃濃度較高，從而干擾了檸檬黃的顯色反應(yīng)。

經(jīng)紫外分光光度法檢測，紙層析法未檢出的6號樣品中檸檬黃濃度為 0.026lmg?mL^-1 （見表5中6號樣品）。紙層析法未能檢測出的原因可能是其檢測靈敏度相對較低，導(dǎo)致結(jié)果未能準確呈現(xiàn)。

將微流控芯片檢測法與層析法的檢測結(jié)果進行對比分析（見表6）。結(jié)果顯示，芯片法檢測出的陽性樣品有3種，陰性樣品有5種；層析法檢測出的陽性樣品有3種，陰性樣品有5種。然而，兩種檢測方法的總吻合率并不高，僅為 75% 。這表明微流控芯片檢測法與層析法在檢測結(jié)果上存在一定差異，可能與兩種方法的檢測原理、靈敏度等因素有關(guān)，后續(xù)需進一步探討和優(yōu)化。

3結(jié)論

紙基微流控芯片技術(shù)作為一種新興的生化分析工具，在檸檬黃檢測中展現(xiàn)了顯著優(yōu)勢。相較于傳統(tǒng)檢測方法，該技術(shù)操作簡便、檢測速度快、成本低廉，且能夠同時檢測多個樣品，適用于現(xiàn)場快速篩查。本研究構(gòu)建了一種含有6個檢測區(qū)的微流控芯片，能夠一次性完成對6種不同樣品的檢測，顯著提高了檢測效率，較好地滿足了日常生活中對檸檬黃檢測的需求。

該方法基于檸檬黃與 Cu²⁺ 的顯色反應(yīng)及pH值響應(yīng)機制，實現(xiàn)了在 10min 內(nèi)完成檢測。實驗結(jié)果表明，芯片檢測限為 0.005mg?mL^-1 ，展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和可靠性，但對日落黃存在一定的交叉反應(yīng)。此外，芯片在不同溫度、光照和濕度條件下均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和耐用性。

然而，該技術(shù)也存在一定的局限性。例如，合成色素日落黃的存在會干擾檸檬黃的檢測結(jié)果，導(dǎo)致檢測出現(xiàn)偏差。此外，紙基微流控芯片在定量測定方面仍需借助精密儀器，限制了其在實際應(yīng)用中的便捷性。未來的研究應(yīng)致力于提高紙基微流控芯片的抗干擾能力和定量測定的準確性，以進一步推動其在食品安全檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。通過優(yōu)化芯片設(shè)計和檢測方法，有望實現(xiàn)更高效、更可靠的現(xiàn)場快速檢測，為食品安全提供有力保障。

參考文獻

[1]石媚，邙明哲，沈辰諭，等.食品中檸檬黃快速檢測方法研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2022，48（23）：352-359

[2]宣芳，許子旋，胡耀娟.表面增強拉曼光譜在食品添加劑檢測方面的應(yīng)用進展[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報，2020，36（6）：6-12.

[3]靜平，張曉梅，許艷麗，等.納米材料電化學(xué)傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用[J]食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2013，4（2）：379-382.

[4]陳圣全，張卓旻.食品著色劑前處理及快速分析方法研究進展[J].食品科技，2020，45（11）：255-262.

[5]吳靜，徐軍飛，石聰燦，等.紙基微流控芯片的研究進展及趨勢[J].中國造紙學(xué)報，2018，33（9）：57-64.

[6]WHITESIDESG，STROOCKA.Flexible methodsfor microfluidics[J].Phys Today，2001，54（6）：42-48.

[7]李澤嫻.基于紙基微流控芯片檢測水果中葡萄糖、果糖和維生素C的應(yīng)用研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2017.

[8]LU Y，SHI W W，JIANG L，et al.Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost， portable bioassay[J].Electrophoresis，2009，30（9）：1497-1500.

[9]ANDRESMW，SCOTTT P，MANISHJB，et al. Patterned paper asaplatform for inexpensive， low-volume， portable bioassays[J].Angewandte Chemie International Edition，2007，46（8）：1318-1320.

[10]ABEK，SUZUKIK，CITTERIOD，etal.Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper[J].Analytical Chemistry，2008，80（18）：6928-6934.

[11]景順杰，李建晴，姚建紅.飲料中檸檬黃色素穩(wěn)定性的研究[J].運城學(xué)院學(xué)報，2007（5）：37-39.

[12]潘華，謝俊平.一種食品合成色素快速檢測的方法及食品合成色素檢測盒：200810029995.9[P].2010-02-10.

[13]齊驥，相佳雯，林棟，等.微流控技術(shù)在海洋分析監(jiān)測中的應(yīng)用研究[J].分析化學(xué)，2023，51（10）：1545-155.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準食品添加劑檸檬黃：GB4481.1—2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

[15]林壯森，蔡澤鳳，陳楚珊，等.分光光度法快速檢測飲料中檸檬黃的研究[J].廣西輕工業(yè)，2011，27（2）：8-9.