高效液相色譜法測定面包中丙酸及丙酸鹽的含量

Determination of Propionic Acid and Propionates in Bread by High-Performance Liquid Chromatography

ZHANG Yu， LIU Ying* （Tianjin Institute of Food Safety Inspection Technology， Tianjin 30o308， China）

Abstract： In view of the serious matrix interference， poor repeatability， and difficulty in qualitative and quantitative determination of propionic acidand propionate in existing food detection methods，this study optimized the HPLC detection method for propionic acid and propionate in bread.The sample was mixed with water and 1mol?L^-1 phosphoric acid solution and then ultrasonically extracted. The pH value was adjusted to about 3. The supernatant was filtered through a microporous filter membrane and separated by a C₁₈ chromatographic column. Phosphoric acid aqueous solution and methanol were used as the mobile phase for gradient elution and the determination was performed bya diode array detector.The results showed that the detection limitof this method was （20 0.02g?kg^-1 ，the quantification limit was 0.08g?kg^-1 ，and the recovery rate was 91.5%～105.0% when the content of propionic acid and propionate was 0.08～2.50g?kg^-1 ，and the relative standard deviation was 2.29%～4.79% This method is simple and fast to operate，can efectively separate the target peak and impurity peak inthe bread matrix， and the determination results are accurate and stable.

Keywords： high-performance liquid chromatography; propionic acid; propionates; bread

丙酸是一種無色透明且具有一定腐蝕性的液體，帶有刺激性氣味，被廣泛應(yīng)用于飼料防腐和食品防腐領(lǐng)域[1]。相較于其他防腐劑，丙酸具有在酸性條件下抑制細菌與霉菌但不會抑制酵母菌的優(yōu)勢，因此面包工業(yè)通常在面包中添加丙酸及其鈉鹽、鈣鹽作為防腐劑，起到延長保質(zhì)期的作用。國內(nèi)外法規(guī)均批準丙酸及其鈉鹽、鈣鹽在面包制作工藝中的合法使用。

為保障消費者的健康，對食品添加劑進行嚴格的監(jiān)督和標準化管理是確保食品安全的重要舉措之一。2024年3月12日，國家衛(wèi)生健康委員會網(wǎng)站公開發(fā)布了《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》（GB2760—2024），其中刪除了脫氫乙酸及其鈉鹽在面包中的使用規(guī)定。隨著新標準的實施，丙酸及其鈣鹽、鈉鹽因其安全可靠的特性成為面包生產(chǎn)企業(yè)替代脫氫乙酸及其鈉鹽的重要防腐添加劑被廣泛使用。然而，過量食用丙酸及其鈣鹽、鈉鹽也會導致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，從而引起相關(guān)的慢性疾病[2]?！妒称钒踩珖覙藴适称诽砑觿┦褂脴藴省罚℅B2760—2024）規(guī)定，面包中丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的使用限量為不得超過 2.5g?kg^-1 。

現(xiàn)有測定食品中丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法。其中，氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法前處理方法多采用液液萃取法，操作復雜且回收率較低，測定結(jié)果重復性差，故本研究采用高效液相色譜法進行檢測。由于面包在生產(chǎn)加工過程中可能使用多種食品添加劑，除目標峰外還可能出現(xiàn)其他雜峰，如山梨酸、脫氫乙酸等均可以在相同色譜條件下出峰，影響對丙酸的定性定量。因此，本研究意在建立一種高效、準確的高效液相色譜法，以實現(xiàn)面包中丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的定性定量分析，為市場監(jiān)管和質(zhì)量控制提供可靠保障。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器），美國安捷倫公司；Milli-QIntegral5超純水儀，美國默克密理博公司；MS204TS/02電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-800B超聲波水浴，昆山市超聲儀器有限公司；CHT205R離心機，湘儀離心機儀器有限公司；JJ-2B組織搗碎機，常州金南儀器制造有限公司；101-3AB鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司； S210pH 計，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司； 17765-Q 0.45μm 濾膜針頭過濾器，德國賽多利斯集團。

丙酸標準品（CAS號：79-09-4），純度 ?97% 磷酸（ H₃PO₄ ），色譜純；甲醇，色譜純，購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2標準溶液的配制

精準稱取 0.1g 丙酸標準品于 10mL 容量瓶中，加水至刻度，配成濃度為 10mg?mL^-1 的丙酸標準貯備液， 4^°C 冰箱中保存，有效期為6個月。

吸取丙酸標準貯備液 1mL 于 10mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成濃度為 1mg^.mL^-1 的標準工作液，再從中分別吸取 0.08， 0.10， 0.20， 0.50， 1.00， （20號2.00mL 和 5.00mL 至 10mL 容量瓶中，分別加入1mol?L^-1 磷酸 0.2mL ，用水定容至 10mL ，混勻，得到濃度分別為0.008、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200mgmL^-1 和 0.500mgmL^-1 的丙酸標準系列溶液。

1.3 樣品處理

取面包樣品置于鼓風干燥箱中， 37^°C 下干燥 2～ ³h ，置于組織搗碎機中磨碎。準確稱取樣品 5g ，置于 50mL 容量瓶中，加水約 20mL ，加入 1mol?L^-1 磷酸溶液 0.5mL ，混勻，經(jīng)超聲浸提 10min 后，用1mol?L^-1 磷酸溶液調(diào)節(jié) pH 值至3左右，用水定容至刻度，搖勻。將試樣全部轉(zhuǎn)移至 50mL 具塞塑料離心管中，以 4000rmin^-1 離心 10min ，取上清液，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾后，用液相色譜測定[3]。

1.4 色譜條件

色譜柱：SVEA C₁₈ Gold柱（ 250mm×4.6mm 5μm ）；柱溫： 50°C ；流動相：A為 0.1% 磷酸水溶液，B為甲醇（色譜純），梯度洗脫；流速：1mL?min^-1 ；檢測波長： 214nm ；進樣量： 20μL 梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品處理方法的選擇

高效液相色譜法檢測丙酸及其鈣鹽、鈉鹽含量的前處理方法主要分為蒸餾法和直接浸提法。本研究中，樣品為面包，其基質(zhì)復雜，除含有丙酸外，還含有淀粉、蛋白質(zhì)、酵母等成分，在加熱蒸餾時，這些成分可能會發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生氣體。例如，酵母在一定溫度下可能會繼續(xù)發(fā)酵或其他成分分解產(chǎn)生二氧化碳等氣體，這些氣體在液體中積聚，容易導致爆沸。因此，本研究選取直接浸提法進行實驗。

面包水分含量較高，為驗證其水分含量是否會影響丙酸檢測結(jié)果，本研究對比了干燥和不干燥樣的測定結(jié)果。將均質(zhì)后的同一樣品，一部分置于干燥箱中風干，另一部分直接進行前處理，每組分別進行6次平行重復實驗。如表2所示，風干樣品的相對標準偏差小于未風干樣品，說明對樣品進行干燥有助于提高檢測結(jié)果的重復性。

2.2 流動相選擇

面包在生產(chǎn)加工過程中可能使用多種食品添加劑，導致在檢測中出現(xiàn)大量雜峰，如山梨酸、脫氫乙酸等，這些雜峰在相同色譜條件下與目標峰重疊，影響丙酸的定性定量分析。為了優(yōu)化分離效果，本研究比較了兩種流動相條件： 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =95+5 （V/V）和 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =90+10 （V/V）。

對面包基質(zhì)加標樣品進行色譜分析，色譜圖見圖1、圖2。結(jié)果表明，流動相為 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =90+10 （V/V時，目標峰與雜質(zhì)峰出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，不能完全分離，分離度不能達到檢測要求；流動相為0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 時，目標峰峰形較好，且能與雜質(zhì)峰完全分離，達到定性定量的準確性要求。因此，本研究中選擇 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 作為流動相[4?？紤]到面包基質(zhì)較為復雜，所含添加劑種類較多，本研究 20min 后提高甲醇比例，加快雜質(zhì)的洗脫。同時，采用梯度洗脫以減小雜質(zhì)峰未洗脫完全對后續(xù)檢測的影響。

2.3柱溫的選擇

本研究選取了35、50、 種柱溫進行比較。實驗結(jié)果顯示，柱溫為 時，目標峰峰形最好，且與雜質(zhì)峰的分離效果最為理想，故選取柱溫為50^cC 。各溫度下的色譜圖見圖3、圖4、圖5。

2.4方法學驗證

按照上述實驗條件，對1.2配制的丙酸標準系列溶液進行檢測，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到的線性回歸方程為 y= 626.23804x+0.446168 ，相關(guān)系數(shù) （R²） 為 0.99996 0以3倍信噪比和10倍信噪比作為計算標準，計算該方法檢出限為 0.02g?kg^-1 ，定量限為 0.08g?kg^-1 。

分別選取0.08、0.50、 2.50g?kg^-1 濃度水平，在空白樣品中進行6平行加標回收實驗，結(jié)果見表3。方法回收率為 91.5%～ 105.0% ，相對標準偏差為2.29%～4.79% ，該方法回收率、精密度均滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T27404—2008）中的要求。

2.5 樣品分析

采用本研究建立的檢測方法，隨機對市售的20種面包進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20個樣品中有14個含有丙酸及其鈣鹽、鈉鹽，含量分別為0.510、0.615、0.478、0.286、0.566、0.478、0.607、0.480、1.030、0.540、0.183、0.485、 0.451g?kg^-1 和 0.585g?kg^-1 ，占比為 70% ；未添加防腐劑的樣品共4個，占比為20% ；僅含有丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的共5個，占比為25% ；含有丙酸及其鈣鹽、鈉鹽與山梨酸及其鉀鹽，采用復合防腐工藝的樣品共9個，占比為 45% 。20個隨機樣品中丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的含量范圍為0.183～1.030g?kg^-1 ，均低于《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》（GB2760—2024）中規(guī)定的面包中限量（ 2.5g?kg^-1 ），且防腐劑混合使用時各自用量占其最大使用量的比例之和均小于 1^[5]

3結(jié)論

本研究基于現(xiàn)有測定丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的高效液相色譜方法進行色譜條件優(yōu)化，與現(xiàn)行方法相比，更易于色譜分離時目標峰與雜質(zhì)峰的分離，減少了雜質(zhì)峰的干擾，有助于對丙酸含量的定性定量分析。對市面上銷售的面包進行丙酸及其鈣鹽、鈉鹽含量檢測，發(fā)現(xiàn)20個樣品中 70% 面包中添加丙酸及其鈣鹽、鈉鹽，單獨使用丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的樣品占 25% ，使用丙酸及其鈣鹽、鈉鹽結(jié)合山梨酸及其鉀鹽復配防腐工藝的樣品占 45% 。本研究建立的檢測方法操作步驟簡單、高效，靈敏度、準確度、重復性高，能滿足面包中丙酸及其鈣鹽、鈉鹽的檢測要求，為食品監(jiān)管提供了新的技術(shù)補充。

參考文獻

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[3]劉群，曹倩蕾，馮彥勇，等.高效液相色譜法測 定食品中丙酸鈉、丙酸鈣的含量[J].現(xiàn)代食品，2023（18）： 145-147.

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