餅干中菌落總數(shù)不確定度評定

Evaluation of the Uncertainty in the Total Bacterial Count in Biscuits

， ， ， ， ， Food Inspection Centre， Kunming Institute for Food and Drug Control， Kunming 65oo34， China）

Abstract： To ensure the accuracy and scientific validity of the total bacterial colony count detection results in biscuits，an uncertainty evaluation method for the colony count in biscuits is established.Based on the GB 4789.2—2O22 plate count method，the colony count is tested，and the uncertainty introduced during the testing processis evaluated.The results show that the combined standard uncertainty of the total colony count detection is 0.056 O06，with an expanded uncertainty of 0.116 829 at a 95% confidence level. The confidence interval is between 60 684 CFU g^-1 and 103928CFU?g^-1 ，and the detection data follows a normal distribution. Analysis revealed that the relative standard uncertainty introduced by dilutionand repeatability testing is relatively high.It is recommended to reduce the uncertainty by strictly controling factors such as operator handling，instrument precision，and environmental conditions.

Keywords： biscuits; total bacterial count; evaluation of the uncertainty

餅干作為一種常見的便捷食品，不僅具有多樣化的口味和質(zhì)地，還富含多種營養(yǎng)成分。因其便攜性、長保質(zhì)期和多樣化的選擇，成為現(xiàn)代快節(jié)奏生活中重要的能量補充來源。如果食用被微生物污染的餅干，可能會對健康造成一系列的負(fù)面影響。菌落總數(shù)是食品微生物污染程度的一個重要監(jiān)測項目，也是評價食品衛(wèi)生狀況和質(zhì)量安全最常用的指標(biāo)，其結(jié)果直接影響評價的準(zhǔn)確性和可靠性[1]。不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，用以表征合理賦予被測量值的分散性[2]，是評估檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵指標(biāo)，不確定度越小，檢測結(jié)果越接近真值，其使用價值也越高，反之不確定度越大，檢測結(jié)果的可靠性越低。《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（GB/T27025—2019）3和《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》CNAS-CL01-A001：2022）4都對實驗室檢驗結(jié)果的測量不確定度提出了要求，通過對不確定度來源的分析和評定，可以明確檢測過程中的關(guān)鍵控制點，為優(yōu)化檢測方法提供依據(jù)。

本研究通過對餅干中菌落總數(shù)的不確定度評估，旨在科學(xué)表征檢測結(jié)果，特別是在臨界值附近時降低檢測風(fēng)險，以期為實驗室檢驗檢測結(jié)果的科學(xué)表征及檢驗檢測過程的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)[5]。

1材料與方法

1.1材料與試劑

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（230520），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉（210409），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；餅干（樣品），市售。

1.2儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器（MLS-3781L-PC），上海松下；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HPP260），德國美墨爾特；拍擊式均質(zhì)器（HBM-400B），恒奧；移液槍（ 100～ 1000μL 、 1～10mL ），艾本德；電子天平（ScoutPro），奧豪斯儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌落總數(shù)的測定

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（GB4789.2—2022）平板計數(shù)法，取同一品牌、同一批號的20份酥性餅干樣品，每份樣品做2平行，均由同一名技術(shù)人員進(jìn)行檢測。依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）[7]對檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定。

1.3.2 數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建

依據(jù)檢測方法，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型為

Y=A×D

式中： Y 為樣品中菌落總數(shù)， CFU?g^-1 ; A 為計數(shù)樣品稀釋度； D 為計數(shù)稀釋樣本的菌落數(shù)，CFU g^-1 。

1.3.3 不確定度來源分析

不確定度主要分為A類和B類。A類不確定度主要由樣品重復(fù)性檢測的操作過程引入，B類不確定度則主要來源于稱樣、稀釋和加樣等過程，其中量器校準(zhǔn)誤差和溫度變化導(dǎo)致的體積偏差是其主要來源。

2 結(jié)果與分析

2.1B類不確定度評定

2.1.1 稱樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

依據(jù)電子天平校準(zhǔn)證書，測量點在 1～ 100g 時擴(kuò)展不確定度 U=0.1g ，包含因子 k=2 ，實驗過程中需稱取餅干 25g ，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（GB4789.2—2022）[，本實驗稱取樣品后，將其置于含 225mL 生理鹽水的均質(zhì)袋中均質(zhì)混勻，制成 1：10 的樣品勻液。隨后，用 1mL 移液槍吸取 1：10 樣品勻液注入 9mL 生理鹽水中，混勻制成 1：100 的樣品勻液，此稀釋步驟重復(fù)兩次，最終獲得 1：1000 的稀釋度。在稀釋過程中，使用 250mL 量筒量取 225mL 生理鹽水， 10mL 移液槍吸取 9mL 生理鹽水，以及 1mL 移液槍吸取1mL 樣品勻液。不確定度主要來源于校準(zhǔn)誤差和溫度變化引起的體積偏差。依據(jù)《常用玻璃量器》（JJG196—2006）[8]，在 20^°C 下， 250mL 量出式量筒的容量允差 ±2.0mL （ a=2.0mL ），檢定證書顯示，10mL 移液槍容量相對誤差為 0.5% （ a=0.05mL ），1mL 移液槍相對容量誤差為 0.5% （ a=0.005mL ），均取矩形分布 ，由此校準(zhǔn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

由于量筒的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于水的膨脹系數(shù)，因此僅需評估溫度變化對水體積的影響。水的膨脹系數(shù)α 為 2.1×10^-4°C^-1 ，實驗溫度控制在（ 20±3 ） ^°C 。在量取 225mL 水時，溫度變化引起量筒取樣體積變化為 ±0.14175mL ，即區(qū)間半寬度 a=0.14175 ；移液槍吸取 9mL 生理鹽水和 1mL 樣品勻液時，溫度變化引起取樣體積變化分別為 ±0.00567mL 、 ±0.00063mL ，即區(qū)間半寬度a分別為0.00567和 0.000 63 。按照矩形分布 ，溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

因此，量筒、 10mL 移液槍和 1mL 移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

綜上所述，由稀釋過程引人的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.3 加樣引入的B類不確定度

實驗中加樣體積為 1mL ，此過程只用考慮由1mL 移液槍引入的不確定度，使用的移液槍與2.1.2使用的 1mL 移液槍為同一把，因此由加樣引入的相對不確定度為 u_rel（ 加樣 ）=u_rel（V₁）=0.002910 0

2.2A類不確定度評定

A類不確定度主要是由重復(fù)性檢測引入。由于微生物間存在互生、共生和拮抗等復(fù)雜關(guān)系[]，檢測結(jié)果分散，因此直接基于平均值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法并不合理，通常采用對數(shù)轉(zhuǎn)換后結(jié)合貝塞爾公式進(jìn)行計算。本實驗中，由同一技術(shù)人員對20份樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，以提高自由度，具體結(jié)果見表1。

通過計算20個試樣的合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，得到

每個樣品檢測兩次，故兩次測量平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

20份試樣菌落總數(shù)對數(shù)值平均值為

因此，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

實驗過程中，由 2.1～2.2 中引入的不確定度因素都是相互獨立的，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 統(tǒng)計描述

利用軟件SPSS27進(jìn)行統(tǒng)計分析，由于樣本量小于50，因此選擇Shapiro-Wilk檢驗，顯著性0.614gt;0.05 ，圖1的平板計數(shù)測量結(jié)果正態(tài)Q-Q圖顯示檢測數(shù)據(jù)的對數(shù)值圍繞直線分布，說明檢測數(shù)據(jù)的對數(shù)值符合正態(tài)分布。

2.5擴(kuò)展不確定度及報告檢測結(jié)果

取置信概率 p=95% ，自由度 ν=m（n-1）=20×（2-1）= 20，查 t 分布表得 。則擴(kuò)展不確度為 。故實驗中，菌落總數(shù)的對數(shù)值為 lgx=（4.899905±0.116829）lgCFUg^-1 ，即 4.783 076?lgx?5.016 734 ，取反對數(shù)，在 95% 置信限下，菌落總數(shù)區(qū)間為 60684～103928CFU?g^-1 0

3結(jié)論與討論

本研究對餅干菌落總數(shù)檢測過程中稱樣、稀釋、加樣、重復(fù)性檢測等關(guān)鍵環(huán)節(jié)引入的A類和B類不確定度進(jìn)行評定，結(jié)果表明，各環(huán)節(jié)對檢測結(jié)果的不確定度影響程度各不相同，其中稀釋和重復(fù)檢測引人的不確定度較高，主要來源于量筒和移液槍校準(zhǔn)引入的不確定度，應(yīng)定期對移液槍和玻璃器血等進(jìn)行計量校準(zhǔn)和期間核查，確保儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，而溫度變化導(dǎo)致的體積偏差對不確定度的影響較小，在日常評定中可忽略不計。此外，檢測人員操作的熟練程度和技術(shù)誤差等因素雖難以量化，但仍需通過規(guī)范化培訓(xùn)和操作考核加以控制，值得注意的是，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)基性能等因素引入的不確定度尚未納入本次評估范圍，這將是本實驗室未來研究的重點方向。

綜上所述，在后續(xù)檢測工作中，應(yīng)嚴(yán)格遵循相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，從技術(shù)人員、量器設(shè)備、培養(yǎng)基質(zhì)量及環(huán)境條件等方面實施全面質(zhì)量控制，以進(jìn)一步降低不確定度，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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