低強度脈沖超聲聯(lián)合BMP9修飾的BMSCs對大鼠牙槽骨缺損修復效果的研究

[摘要]目的：探討低強度脈沖超聲（Low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）聯(lián)合骨形成蛋白9（Bone morphogenetic protein 9，BMP9）修飾的骨髓間充質干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）對牙槽骨缺損的修復作用。方法：在大鼠上頜第一磨牙近中區(qū)造成牙周骨缺損構建牙槽骨缺損大鼠模型，將45只大鼠隨機平均分為5組，每組9只，即正常組、對照組、超聲治療組、細胞治療組、聯(lián)合治療組。通過CT掃描評價大鼠牙槽骨再生，通過HE染色、Masson染色和免疫組織化學染色觀察大鼠骨缺損修復程度。利用生物發(fā)光成像在體內追蹤BMSCs。結果：微型CT結果顯示，與對照組相比，超聲治療組，細胞治療組，聯(lián)合治療組促進了更多的新骨形成、BV、Tb.N增加、Tb.Sp降低，其中聯(lián)合治療組的新骨形成率明顯增加（P＜0.05）；HE染色和Masson染色結果顯示，在三組治療組中，均可以觀察到結締組織、新血管形成和鈣沉積物，聯(lián)合治療組中更明顯；免疫組化染色結果顯示，在三組治療組中，聯(lián)合治療組COL-I 和骨橋蛋白表達增高更明顯。生物發(fā)光顯像顯示LIPUS聯(lián)合BMP9修飾的BMSCs組的熒光信號明顯多于其他組，有較多的BMSCs定植于牙槽骨缺損區(qū)。結論：LIPUS聯(lián)合BMP9修飾的BMSCs可以促進牙槽骨再生，對牙槽骨缺損修復的效果更好。

[關鍵詞]低強度脈沖超聲（LIPUS）；骨形成蛋白9（BMP9）；骨髓間充質干細胞（BMSCs）；牙槽骨修復；聯(lián)合作用

[中圖分類號]R781.42" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）06-0006-05

Study on the Repair Effect of LIPUS Combined with BMP9 Modified BMSCs on Alveolar Bone Defects in Rats

LIN Lirong， LI Zhenxing

（ Shijiazhuang Medical College， Shijiazhuang 050000， Hebei， China ）

Abstract： Objective" Exploring the repair effect of LIPUS combined withBone morphogenetic protein 9（BMP9）modified Bone marrow derived mesenchymal stem cells（BMSCs）on alveolar bone defects. Methods" A rat model of alveolar bone defect was constructed by creating periodontal bone defects in the mesial area of the first maxillary molar in rats. 45 rats were randomly divided into 5 groups， with 9 rats in each group， namely the normal group：normal group， control group， beyond treatment group， cell therapy group， combination therapy group. Eight weeks after surgery， the rats were euthanized and samples were collected. Evaluate alveolar bone regeneration in rats using CT， and the degree of bone defect repair was observed using HE staining， Masson staining， and immunohistochemical staining. BMSCs were tracked in vivo using bioluminescence imaging. Results" The micro CT results showed that compared with the control group， the treatment group， cell therapy group， and combination therapy group promoted more new bone formation， BV， and Tb N increases， Tb Sp decreased， with a significant increase in new bone formation rate in the combination treatment group （P＜0.05）. The results of HE staining and Masson staining showed that in all three treatment groups， connective tissue， neovascularization， and calcium deposition were observed， with a more pronounced effect in the combination treatment group. The immunohistochemical staining results showed that among the three treatment groups， the combined treatment group had a more significant increase in COL-I and osteopontin expression. Bioluminescence imaging showed that the fluorescence signal of the LIPUS combined with BMP9 modified BMSCs group was significantly higher than that of the other groups， and more BMSCs were implanted in the alveolar bone defect area. Conclusion" Lipus combined with BMP9 modified BMSCs can promote alveolar bone regeneration and have a better effect on repairing alveolar bone defects.

Key words： low-intensity pulsed ultrasound（ LIPUS ）; bone morphogenetic protein 9 （ BMP9 ）; bone marrow derived mesenchymal stem cells（ bmscs ）; alveolar bone repair; combined effect

牙周炎是人類最常見的口腔疾病之一，牙槽骨再生是牙周炎治療中的關鍵問題[1]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是維持骨代謝的主要細胞。BMSCs表現(xiàn)出多系分化能力，包括軟骨細胞和成骨細胞，其可通過遷移到骨損傷部位對骨缺損進行修復[2]。目前BMSCs已廣泛應用于組織修復和再生醫(yī)學[3-4]。基于BMSCs的治療，在促進牙槽骨和牙周組織再生方面是有效和安全的[5-7]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPS）在骨骼發(fā)育和骨形成過程中，具有介導促進間充質BMSCs向成骨細胞分化的作用[8]。骨形成蛋白9（BMP9）是BMPs家族成員之一，在促進成骨分化和骨形成方面發(fā)揮著重要作用[9]。BMP9作為最有效的成骨因子之一，是一種很有前途的骨組織工程細胞因子[10]。

低強度脈沖超聲（LIPUS）是一種非侵入性治療性超聲，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）批準用于治療骨折愈合和骨不連[11]。LIPUS治療可促進新牙槽骨的形成，加速牙周組織的重建[12-13]。當LIPUS與基于BMSCs的治療相結合時，促進脊髓損傷的更好的功能恢復[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可以增強骨折愈合過程中BMSCs的歸巢[16]。近年來，已有研究報道通過誘導BMSCs歸巢進而參與組織的修復和再生[17-18]。然而，目前關于LIPUS對BMSCs歸巢到牙周組織損傷部位的影響尚未闡明。本研究在大鼠體內建立了牙槽骨缺損模型，通過BMSCs靜脈注射，下頜骨暴露于LIPUS治療，探究BMP9修飾的BMSCs聯(lián)合 LIPUS治療對牙槽骨缺損的修復效果和作用機制，為臨床上應用BMSCs修復牙槽骨缺損提供理論依據(jù)。

1" 材料和方法

1.1 實驗動物：45只6周齡雄性[體重（180±20）g]Sprague Dawley大鼠購自南通大禹生物技術有限公司（China）[許可證號：SYXK（蘇）2022-0009]。本研究經石家莊醫(yī)學高等專科學校動物倫理委員會批準（批準號：20220014）。

1.2 細胞培養(yǎng)：處死兩個月大的大鼠以獲得脛骨[17]。然后用PBS洗滌脛骨，沖洗出骨髓，然后懸浮于含有10%胎牛血清（FBS；Hyclone）、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素（Hyclone）。第3～5代BMSCs用于以下研究。

1.3 Ad-BMP9轉染及形態(tài)學觀察：取鋪滿瓶底的第3代BMSCs，倒掉原培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍倒掉，加入1 ml 0.25%胰酶，37℃下消化約1 min，鏡下觀察大部分細胞縮小變圓，即可加入3 ml培養(yǎng)基終止消化，巴氏管吹打細胞，使細胞完全脫落，將細胞懸液轉移至離心管內，1 000 r/min，離心3 min，倒掉上清液，加入培養(yǎng)基3 ml，吹打細胞制懸，將細胞懸液轉移至T-25培養(yǎng)瓶內，補足培養(yǎng)基至4.5 ml，鏡下觀察細胞80%～90%已伸展貼壁時，加入Ad-BMP9病毒原液5μl，輕輕振蕩混勻，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，8 h后更換新鮮成骨誘導培養(yǎng)基，對照組加入Ad-GFP 5μl，空白對照組加入5μl PBS。分別在24 h、48 h鏡下觀察熒光表達情況，連續(xù)培養(yǎng)7 d。每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和狀態(tài)，并記錄。

1.4 BMSCs的分化

1.4.1 成脂分化：將補充有10%FBS、1 mM地塞米松、10 mM胰島素、200 mM吲哚美辛和0.5 mM IBMX（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）用作誘導介質。每3 d更新培養(yǎng)基，持續(xù)1周。然后將細胞用油紅0（Solarbio，Beijing，China）染色并進行顯微鏡檢查。

1.4.2 成骨分化：將補充有10%FBS、50μg/ml抗壞血酸（Sigma，St. Louis，MO，USA）、IOO nM地塞米松（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）和5 mM L-甘油磷酸鹽（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）用于誘導細胞分化。每3天更換培養(yǎng)基。3周后，將細胞用茜素紅（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）染色。

1.5 細胞標記：為了在體內追蹤BMSCs，用熒光素酶和EGFP蛋白標記BMSCs（將1×105個BMSCs接種于24孔培養(yǎng)板中）。用5μ/ml聚凝胺轉染pLenti-CMV-EGFP-連接子-Luc-PGK-Puro慢病毒（購自OBiO technology，Shanghai，China）24 h，并通過嘌呤霉素選擇。然后使用倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）檢測轉染。

1.6 模型構建和干預方法：大鼠腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。在無菌環(huán)境下，在上頜第一磨牙的近中區(qū)域上手術創(chuàng)建牙周骨缺損[12-13]。具體操作如下：①在上頜第一磨牙的近中區(qū)域和齦溝上制作緩解切口，并且用骨膜分離器分離骨膜。②在鹽水沖洗下通過手鉆以低速（≤1 500 rpm）去除骨組織。③在形成臨界尺寸的缺損（4 mm×5 mm×1 mm）后，在生理鹽水洗滌后，應用膠原屏障膜（Bio-Gide?，Geist-lich，Beijing，China）來填充這些缺損。④替換皮瓣并使用可吸收縫線閉合傷口。

將大鼠隨機分成五組（n=9）。①正常組：正常無缺損；②對照組：注射磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）；③超聲治療組：LIPUS治療；④細胞治療組：注射Ad-BMP9-BMSCs；⑤聯(lián)合治療組：注射Ad-BMP9-BMSCs并LIPUS聯(lián)合治療。

術后靜脈注射1×106個EGFP-Luc標記的BMSCs或 PBS。在靜脈注射后第1天、第3天、1周、4周追蹤BMSCs。

1.7 LIPUS治療：LIPUS裝置由國家超聲醫(yī)學工程研究中心（重慶醫(yī)科大學重慶分校）設計制造。將超聲探頭與牙周缺損區(qū)域進行固定和接觸。將建模區(qū)域暴露于LIPUS（200-μs爆發(fā)正弦波，頻率為1.5 MHz，脈沖重復頻率為1.0 kHz，強度為30 mW/cm2）。BMSCs/LIPUS組動物缺損區(qū)用LIPUS處理2周，每天20 min。對照組和骨髓間充質干細胞組動物缺損面積處理方法相同，LIPUS裝置關閉。

1.8 CT掃描：8周后在CO2室中處死大鼠。解剖下頜骨并使用CT掃描儀（vivaCT 40，Scanco Medical AG，Bassersdorf，Switzerland）掃描。使用以下掃描儀設置進行掃描：X射線源電壓70 kV，電流114 μA，功率8 W，體素尺寸19 μm。使用Scanco Medical分析軟件生成三維重建。使用Scanco Medical分析軟件在定向的樣品中進行骨密度測量。牙冠的第一，第二，第三磨牙是可見的軸向平面。在定向之后，選擇235～1 000的閾值作為用于分析的感興趣區(qū)域。分析從分叉首次出現(xiàn)的切片開始，向頂部進行。記錄各組的骨體積（BV）、組織體積（TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁間隔（Tb.Sp）值并取平均值（對于所有CT分析，n=9）。

1.9 組織學和免疫組織化學染色：樣本在4%的多聚甲醛中固定48 h，并在石蠟包埋和切片前使用10%的EDTA進行脫礦。切片（5μm）然后脫蠟和脫水使用二甲苯和乙醇。蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色和馬尾松染色按照生產廠家的說明書（Solarbio，Beijing，China）進行。這些切片在BX41顯微鏡下成像（日本奧林巴斯）。用抗骨橋蛋白抗體和抗膠原Ⅰ（Abcam，Cambridge，UK）抗體進行免疫組織化學染色。然后使用DAB試劑盒（ZSGB-BIO，北京，中國）檢測抗體并用蘇木精復染。使用BX41顯微鏡（Olympus， Japan）獲得圖像。

1.10 生物發(fā)光成像：將大鼠麻醉并在成像前用D-熒光素IP注射。在第1、3、7和28天使用IVIS Lumina Series Ⅲ系統(tǒng)（Perkim Elmer，Waltham，USA）對大鼠成像。

1.11 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗重復至少三次，結果表示為（xˉ±s）。通過Student's t檢驗或單因素ANOVA分析數(shù)據(jù)，并通過GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學顯著性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結果

2.1 BMSCs的形態(tài)學表征：48 h后將原代BMSCs附著于培養(yǎng)皿（見圖1A）。第3代BMSCs顯示出均勻的成纖維細胞樣形態(tài)（見圖1B）。在成脂誘導中觀察到脂滴，這些脂滴對于油紅O染色是陽性的（見圖1C）。在成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)后形成礦化結節(jié)。在誘導的BMSCs中觀察到茜素紅的陽性染色（見圖1D）。

2.2 細胞標記：轉染后，在嘌呤霉素選擇前后，在BMSCs中均觀察到綠色熒光（見圖2）。

2.3 BMSCs體內標記：結果顯示，在正常組、對照組和LIPUS超聲治療組中4周內均未觀察到生物發(fā)光信號（見圖3）。在細胞治療組和聯(lián)合治療組中，在第1天和第3天在下頜骨、心臟或肺處檢測到生物發(fā)光信號，其中信號在心臟或肺區(qū)域較為強烈。在第1周和第4周，聯(lián)合治療組在下頜骨檢測到周信號，其他組中未顯示信號。

2.4 微型CT分析：顯微CT圖像顯示，與對照組相比，超聲治療組、細胞治療組、聯(lián)合治療組促進了更多的新骨形成（見圖4A）。與對照組相比，超聲治療組、細胞治療組、聯(lián)合治療組BV、Tb.N增加，其中聯(lián)合治療組增加顯著（P＜0.05），見圖B～C。與對照組相比，超聲治療組、細胞治療組和聯(lián)合治療組的Tb.Sp降低（P＜0.05），見圖4D。Tb.N和Tb.Sp指標表明聯(lián)合治療組新骨形成和成熟較早。TV指數(shù)和Tb.Th指數(shù)各組之間無顯著差異（見圖4E～F）。

2.5 LIPUS聯(lián)合BMP9修飾BMSCs在牙槽骨再生的作用：HE染色顯示牙周缺損組缺損區(qū)邊緣有少量新生骨形成，中心區(qū)以纖維連接組織為主。在超聲治療組和細胞治療組中，可以觀察到一些結締組織、新血管形成和少量的鈣沉積物。在聯(lián)合治療組中，可以看到更多的結締組織、新血管形成和鈣沉積物，有利于后續(xù)牙槽骨再生。Masson染色的結果更能反映骨成熟度，并且結果與HE染色一致。術后8周，超聲治療組和細胞治療組缺損區(qū)可見新生骨組織和鈣沉積物，但少于聯(lián)合治療組。免疫組化染色結果顯示，超聲治療組、細胞治療組和聯(lián)合治療組骨缺損區(qū)均可見骨橋蛋白（OPN）陽性細胞，主要分布于新骨和類骨質形成區(qū)。COL-I的免疫組織化學染色顯示出類似的趨勢。見圖5。

3" 討論

在牙周炎中，細菌誘導的炎癥總是導致牙槽骨破壞。目前臨床上已采用了多種再生治療策略，如骨移植、引導組織再生和引導骨再生。然而，再生是有限的和不可預測的?；诩毎闹委?，特別是BMSCs的治療，可增加新生骨量、促進血管新生，加快骨質修復，已被報道在促進牙槽骨和牙周組織再生方面是有效和安全的[19-20]。有研究表明，BMP9具有促進BMSCs分化的功效[21-22]。裘吉雨等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Ad-BMP9能促進牙周膜細胞早、晚期成骨分化能力。正如本研究的結果所顯示的，經BMP9誘導后BMSCs能夠分化成脂肪細胞和成骨細胞，這表明了它們在骨修復和再生方面的潛力。LIPUS已廣泛應用于骨折治療、牙周病治療、種植體周圍炎等的治療[24-25]。Azuma Y等[26]報道，在手術后連續(xù)接受LIPUS治療17～24 d的骨骼中，骨折部位的骨橋形成更廣泛。此外，與未處理的骨骼相比，LIPUS處理的骨骼的硬度顯著增加。Konno M等[27]報道說，在骨損傷后的早期，LIPUS治療可有效加速骨愈合。體內實驗發(fā)現(xiàn)，LIPUS輻照后，鈣鹽沉積加快、新骨成熟時間縮短且機械強度增加[28]。有研究表明，LIPUS可能通過機械效應增強基于BMSCs的骨再生，促進BMSCs的成骨分化[29]。有實驗證明LIPUS可促進BMSCs細胞歸巢至骨折部位[30]。本研究結果表明，相比LIPUS和Ad-BMP9-BMSCs單獨治療，聯(lián)合治療組生成更多的新骨且新骨形成和成熟較早，更有利于增強骨形成。生物發(fā)光成像結果顯示，聯(lián)合治療組出現(xiàn)更高的生物發(fā)光信號，且在1周之后，只有聯(lián)合治療組在下頜骨檢測到生物發(fā)光信號，初步預測LIPUS可以促進BMSCs向牙周缺損區(qū)歸巢。

綜上，Ad-BMP9-BMSCs聯(lián)合LIPUS治療具有促進牙槽骨再生的作用，對牙槽骨缺損修復的效果更好，可能受益于LIPUS增強循環(huán)BMSCs歸巢至損傷部位有關，從而支持更有效的LIPUS和基于BMSCs的療法的臨床應用的轉化開發(fā)。

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[收稿日期]2024-04-03

本文引用格式：林利榮，李振興.低強度脈沖超聲聯(lián)合BMP9修飾的BMSCs對大鼠牙槽骨缺損修復效果的研究[J].中國美容醫(yī)學，2025，34（6）：6-11.