新疆部分規(guī)?；B(yǎng)豬場中豬圓環(huán)病毒2型和3型監(jiān)測

中圖分類號：S852.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）02-0502-08

0 引言

【研究意義】豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）是目前已知最小的DNA單股病毒，其直徑為 ，二十面體對稱結(jié)構(gòu)，同時也是可以在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的最小DNA病毒之一。PCV2和PCV3病原已在全球流行，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前PCV分為4個基因型，分別是PCV1、PCV2和新發(fā)現(xiàn)的PCV3、PCV4。PCV1于1974年在豬腎細(xì)胞系PK15中發(fā)現(xiàn)，無致病性[1]。PCV2在1998 年首次分離得到，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原[2]。PCV3病毒可引起心臟和多系統(tǒng)炎癥、仔豬消瘦腹瀉及母豬繁殖障礙疾病等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PCV2感染豬后對機(jī)體獲得性免疫能力的建立影響重大，主要包括在全身性淋巴細(xì)胞衰竭和組織細(xì)胞浸潤增殖[3-7]。造肥淋巴器官的細(xì)胞凋亡，使宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制效。豬只感染PCV3后會引起宿主細(xì)胞自噬、凋亡等，對先天免疫與炎癥反應(yīng)有一定影響，臨床表現(xiàn)為被毛粗亂、腹式呼吸、繁殖障礙疾病等。呼吸困難、體重減輕，個別豬只會出現(xiàn)腹瀉、黃疸等。目前新疆對PCV2和PCV3的研究較少，需闡明PCV2和PCV3在新疆的流行情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究采集7個規(guī)?；B(yǎng)豬場樣品檢測病原，調(diào)查PCV2和PCV3流行狀況，為PCV2和PCV3的防控和流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.1 材料

1.1.1采樣

2022年10月至2023年9月，在新疆選取7個規(guī)?；B(yǎng)豬場，定期前往場區(qū)采集樣品，采集新生健康乳豬辜丸液樣品523份，健康豬精液樣品364份，病弱豬血清樣品208份（乳豬血清樣品31份、保育仔豬血清樣品69份，育肥豬血清樣品63份，妊娠母豬血清樣品45份），死亡豬組織樣品200份（心、肝、脾、腎、肺混樣），流產(chǎn)死胎樣品22份，病弱豬臍帶樣品86份，共計1403份樣品。表1

1. 1.2 儀器和耗材

儀器：全自動核酸提取儀（北京標(biāo)馳澤惠生物科技有限公司），組織研磨儀（析牛科技公司）；離心機(jī)和移液槍（力辰儀器科技有限公司）；熒光PCR儀（拓赫機(jī)電科技有限公司）。

耗材：移液槍頭（比克曼生物科技有限公司）；快速磁珠法DNA/RNA提取試劑盒（北京標(biāo)馳澤惠生物科技有限公司）； 2 . 0 m L EP管和1.5mLEP管（力辰儀器科技有限公司）；八連排（愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司）;精液處理液（愛德士生物科技有限公司）；PCV3型熒光PCR檢測試劑盒（內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司）。

1. 1.3 PCV2引物和探針設(shè)計

豬圓環(huán)2型病毒引物和探針根據(jù)GB/T35901 設(shè)計，探針及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。表2

1. 1.4 PCV2標(biāo)準(zhǔn)品制備

所需標(biāo)準(zhǔn)品，據(jù)GenBank中公布的PCV2基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.5 PCV3引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品的來源

PCV3引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品均由內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

組織樣品、臍帶樣品、死胎樣品處理方式：每份樣品按 的重量剪取后放入 2 . 0 m L 無菌EP管中，加入適量滅菌生理鹽水，經(jīng)組織研磨儀研磨后放離心機(jī)， 離心 ，取上清液1 . 0 m L ，置于無菌 1 . 5 m L EP管中， - 2 0 % 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血清處理：全血常溫靜置，析出血清并轉(zhuǎn)移血清至 1 . 5 m L 無菌EP管內(nèi)， 離心5m i n ，取血清上清液 1 . 0 m L 置于 1 . 5 m L 無菌EP中，標(biāo)記血清信息，放入 冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

精液處理：取 1 m L 精液樣本于 1 . 5 m L 的離心管中， 1 2 0 0 0 r / m i n 離心 4 m i n ，棄上清留沉淀，加入 4 0 0 μ L ReaL PCR 緩沖液（精液處理液）吹打混勻后 7 0 % 溫浴 離心 1 m i n ，取 4 0 0 μ L 澄清裂解液于管中 1 . 5 m L 的離心管中備用。標(biāo)記好樣品信息進(jìn)行檢測。

1. 2.2 核酸提取。

預(yù)封裝試劑準(zhǔn)備：從試劑盒中取出預(yù)封裝試劑，多次顛倒使融珠重懸，輕輕搖動孔板，使試劑和磁珠集中在孔板底部，小心撕去鋁箔封口膜，使用前請確認(rèn)板子方向。撕封口膜時避免振動，防止液體濺出。

自動化儀器提取步驟：在96孔板試劑的第1列和第7列（注意有效工作孔位）中加入 3 0 0 μ L 樣本（投入體積可兼容 1 0 0 ～ 4 0 0 μ L 。將96深孔板放入核酸提取儀中，裝上磁棒套，確認(rèn)磁棒套安裝到位，進(jìn)行自動化提取。自動化程序結(jié)束后，將第6列和12列孔中（注意有效工作孔位）的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；如不立刻使用，請將洗脫立物置于 - 2 0 % 保存。

1.2.3檢測

1.2.3.1 PCV2檢測

（1）將PremixExTaq、引物、探針（要注意通光放置）RNaseFree 和持檢測樣品已提取好的DNA，充分混后置于冰盒上待用。

（2）在 0 . 2 m L PCR八聯(lián)排中、Premix Ex Taq（ProbeqPCR）試劑盒說明書比例配制試劑。 2 × Premix E x Taq為 1 2 . 5 μ L ，分別為PCV2上游引物1 μ L 、PCV2下游引物 1 μ L 、PCV2探針 1 μ L 、RNase free 和總體積 2 4 μ L 。

（3）在上述（2）分裝好的反應(yīng)體系中加人2μ L 的樣品。

（4）將配制好的試劑，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件： 5 0 % 預(yù)反應(yīng) 反應(yīng)10 ，擴(kuò)增40個循環(huán)，在 時收集熒光

（5）熒光定量PCR通道選擇：為FAM（PCV2）單通道。

（6）陽性：被檢樣品 C t 值 ? 3 5 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為陽性；可疑：被檢樣品 C t 值 gt; 3 5 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為可疑，需進(jìn)行復(fù)測；如仍是可疑則判為陽性。陰性：被檢樣品無 C t 值。對于某些未呈現(xiàn)S型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)判定為陰性。

1.2.3.2 PCV3檢測程序

（1）取出PCR反應(yīng)液A和PCR反應(yīng)液B，待其融化后，充分混勻、瞬時離心后放置于冰盒上備用。

（2）反應(yīng)體系配制：PCR反應(yīng)液A 2 . 0 μ L× ，PCR反應(yīng)液 B 2 1 . 0 μ L× （ n + 1 ） ，總體積為 2 3 . 0 μ L× （ n+ 1 ） 。

（3）根據(jù)待測樣品、陰性對照、陽性對照總數(shù)量，準(zhǔn)備 0 . 2 m L PCR八聯(lián)管，向每個管中加入23μ L PCR反應(yīng)體系。

（4）吸取上樣品核酸、陰性對照和陽性對照各 2 μ L ，加人對應(yīng) 0 . 2 m L PCR八聯(lián)反應(yīng)管中，蓋好管蓋轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增區(qū)。

（5）反應(yīng)程序設(shè)定： 預(yù)反應(yīng) 反應(yīng)5s ，擴(kuò)增40個循環(huán)，在 5 7 % 時收集熒光。

（6）熒光定量PCR通道選擇：為FAM（PCV3）單通道。

（7）結(jié)果判定：若待檢樣品的擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S曲線，且 Ct 值 ? 3 5 ，則結(jié)果判定為陽性。若待檢樣品 C t 值 gt; 3 8 ，則結(jié)果判定為陰性。若待檢樣品 3 5 lt; C t 值 lt; 3 8 ，則結(jié)果判定為可疑，即該樣品需復(fù)檢。

1.3 數(shù)據(jù)處理

陽性樣品提交圣湘生物科技股份有限公司測序，樣品編號為 P C V 3- X J- 0 0 7 和PCV3-XJ-008。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對，將樣本序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的參考序列進(jìn)行序列分析。使用MEGA7程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Megaligement進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同場區(qū)PCV2和PCV3陽性率比較

研究表明，檢測的7個規(guī)?；B(yǎng)豬場均存在PCV2和PCV3感染。其中有45份樣品中檢出PCV2陽性，陽性率為 3 . 2 1 % ；有463份樣品中檢出PCV3陽性，陽性率為 3 3 . 0 0 % ；只有11份樣品同時檢測為PCV2和PCV3陽性，檢出率為0 . 7 8 % 。其中，C場陽性率最高，PCV2陽性率為7 . 4 6 % ，PCV3陽性率為 6 4 . 1 8 % （36/134），PCV2和PCV3混合感染率為 3 . 7 3 % ；F場陽性率最低，PCV3陽性率為 2 . 7 5 % （10/364），PCV2無檢出。PCV3在新疆規(guī)?；B(yǎng)豬場流行率遠(yuǎn)高于PCV2，且出現(xiàn)PCV2和PCV3混合感染。表3

2.2 不同類型樣品PCV2和PCV3陽性率比較

研究表明，在各類型樣品中，乳豬睪丸液樣品PCV2和PCV3陽性率最高，PCV2陽性率為4 . 7 8 % （25/523）；PCV3陽性率為 5 7 . 3 6 % （ 523），PCV2和PCV3同時檢出的樣品有乳豬丸液（3. 7 3 % ，5/523）臍帶樣（ 1 . 9 2 % ，3/86）組織樣 （ 1 . 7 5 % ， 3 / 2 0 0 ） 。表4

2.3 不同階段豬群血清 P C V2 + P C V3 陽性率

研究表明，在208份血液樣品中，PCV2陽性檢出率最高的是乳豬血清 3 . 2 3 % （1/31）;PCV3陽性檢出率最高的是乳豬血清 4 8 . 3 9 % （15/31）。僅1份乳豬血清同時檢出PCV2和PCV3，檢出率為 3 . 2 3 % 。表5

2.4 不同季度樣品PCV2和PCV3陽性率

研究表明，在1403份樣品中，第1季度檢測252份樣品，第2季度檢測486份，第3季度檢測501份，第4季度檢測164份。PCV2陽性率從高到低依次是第4季度 5 . 4 9 % （9/164）第1季度4 . 3 7 % （11/252）第2季度 2 . 6 7 % （13/486）第3季度2. 4 0 % （12/501）;PCV3陽性率從高到低依次是第3季度 3 6 . 3 3 % （182/501）、第2季度3 3 . 9 5 % （165/486）第1季度 2 8 . 1 7 % （71/252）、第4季度 2 7 . 4 4 % （45/164）。PCV3在1年4季的檢出率均較高。表6

2.5 基因序列的比較

研究表明， P C V 3- X J- 0 0 7 與參考序列之間的同源性最高的為福建KP1株（MF589111.1）9 9 . 7 % ，與參考序列之間的同源性最低的是新疆株、廣西株為 9 8 . 3 % 。 P C V 3- X J- 0 0 8 與參考序列之間的同源性最高的為江西S1株（MF589133）9 9 . 4 % 。與參考序列之間的同源性最低的是江西62株（KY075989）為 9 8 . 8 % 。圖1

2.6 PCV3ORF2基因遺傳進(jìn)化

研究表明， 與福建株MF589111和福建株MF589108屬于同一分支，為PCV3c型毒株。PCV3－XJ-008 與江西株MF589133和江西株MF589107屬于同一分支，為PCV3b型毒株。

3討論

3.1PCV2感染后會影響仔豬生，引起母豬繁豬障礙，且保育豬和生長育肥豬會出現(xiàn)體型消瘦和咳嗽、打噴嚏等呼吸系統(tǒng)疾病2]。PhanTG等[3]報道了PCV3在患病母豬中檢出。PCV3可以引起多系統(tǒng)炎癥綜合征、繁殖障礙疾病、豬皮炎與腎病綜合征以及亞臨床感染，影響豬群健康狀態(tài)，但不會表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。

3.2回衛(wèi)榮等報道顯示，2015至2019年河北省PCV2的感染率為 4 4 . 0 8 % ～ 8 6 . 8 9 % ，PCV3陽性率為 2 5 . 6 % ，而PCV2和PCV3混合感染率為1 2 . 1 % 。甘雨等[10]報道，在1408份樣品中，PCV2陽性率為 5 1 . 9 2 % （731/1408），PCV3陽性率為3 3 . 4 5 % （471/1408），PCV2和PCV混合感染率2 5 . 0 7 % （353/1408）。鐘順平等[1研究表明，在

2019年云南省勐臘縣PCV2陽性檢出率為 3 6 . 0 5 % （31/86），PCV3陽性檢出率 1 7 . 4 4 % （15/86），PCV2和PCV3混合感染率為15. 12 % （13/86）。顏友榮等[調(diào)查表明，蘇中地區(qū)PCV2陽性率為 1 0 . 7 % （39/363）。陳翔鴻等[3調(diào)查表明，2019年至2020年我國中南地區(qū)豬場中豬PCV2陽性率為 3 6 . 0 8 % （616/1707）。黃正波等[14]研究表明，2021年東北地區(qū)PCV2陽性率為 1 9 . 0 0 % （38/200）。高詩敏等[15]對2019年山西省PCV3 陽性率調(diào)查結(jié)果顯示，陽性率為 8 5 . 2 2 % （444/521）。劉文波等[在2020至2022年廣西豬圓環(huán)病毒3型調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣品陽性率為 1 7 . 8 3 % （ 4 1 / 2 3 0 ） 。黃夢杰等[17對2021至2022年山東省1040份樣品檢測。結(jié)果顯示PCV3檢出率為 2 . 3 % （24/1040），不同季節(jié)和階段均可檢出。劉東旭等[18]在吉林省研究調(diào)查表明PCV3陽性率為 3 4 . 2 % （ 2 4 1 / 7 0 4 ） 。李蕊等[9]對北京市的調(diào)查研究顯示PCV3總體陽性率為 1 . 0 % （12/1177）。李靜等[20在2019年9月至2020年12月期間對新疆阿克蘇地區(qū)、巴音郭楞蒙古自治州、伊犁哈薩克自治州等6個地區(qū)PCV3陽性率研究表明，北部地區(qū)PCV3平均陽性率為 1 4 . 5 % （ 6 5 / 449）。袁科等21報道，在2021年10月至2022年7月新疆北部地區(qū)PCV3陽性率為 2 4 . 1 5 % （107/443），且不同階段豬群均可感染。莫紹江等[22]調(diào)查表明，阿克蘇部分地區(qū)PCV3陽性率為 7 . 5 3 % （44/584）。

3.3研究表明，新疆PCV2總體陽性率 3 . 2 0 % ，低于蘇中地區(qū)的 1 0 . 7 % ；低于中南地區(qū)的 3 6 . 0 8 % ;低于東北地區(qū)的 1 9 . 0 0 % ；整體陽性率處于全國較低水平，PCV3總體陽性率為 3 3 . 0 % （463/1403），高于李靜等（ 1 4 . 5 % ）、袁科等（ 2 4 . 1 5 % ）和莫紹江等（ 的研究結(jié)果，相較于山西低5 2 . 2 2 % ；比山東高 3 0 . 7 % ；比北京高 3 2 . 0 0 % ；比廣西高 1 5 . 1 7 % ，與甘雨等[10]（ 3 3 . 4 5 % ，471/1408）和劉旭東等[18]（ 3 4 . 2 % 2 4 1 / 7 0 4 ）研究結(jié)果相接近。PCV2和PCV3混合感染率（ 7 . 8 4 % ）低于河北0 1 2 . 1 % ）、云南（ 1 5 . 1 2 % ）混合感染率。目前尚無一款商品化PCV3疫苗，解除PCV2感染造肥的機(jī)體免疫抑制，增強(qiáng)自身健康情況，降低PCV3感染風(fēng)險[23]，減少PCV2和PCV3混合感染率。

4結(jié)論

目前，在新疆PCV2陽性率為 3 . 2 0 % （ 4 5 / 1403），PCV3流行率達(dá) 3 3 . 0 0 % （463/1403），

PCV2和PCV3混合感染率為 7 . 8 4 % （11/1403）。C 場PCV2和PCV3陽性檢出率最高，PCV2為7 . 4 6 % （10/134），PCV3為 6 4 . 1 8 % （36/134），PCV2和PCV3混合感染率為 3 . 7 3 % （5/134）。新生乳豬睪丸檢出PCV2和PCV3陽性率最高，PCV2陽性率為 4 . 7 8 % （25/523）;PCV3檢出率為5 7 . 3 6 % （300/523）。PCV2和PCV3不僅可以感染不同階段的豬只，而且一年四季感染率較高。新疆部分地區(qū)，PCV2感染率處在全國低等水平，PCV3感染率處于全國中等水平，且新疆部分地區(qū)PCV3流行毒株為PCV3b和PCV3c型。

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Monitoring of Porcine circovirus （PCV） types 2 and 3 in some large - scale pig farms in Xinjiang

QI Weiyi1，XU Heng2，LIU Yingyu1，ZHENG XIA Lining'，LIU Junfei2

（1. College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830o52，China; 2. Xinjiang Tekon Animal Husbandry Science and Technology Co. Ltd. ，Changji Xinjiang 8311oo， China）

Abstract：【Objective】 To investigate the prevalence of Porcine circovirus type 2（PCV2） and Porcine circovirus type 3（PCV3）in Xinjiang.【Methods】From October 2022 to September 2023，1403 samples from 7 large- scale pig farms were detected and sequenced by fluorescent quantitative PCR. 【Results】The overall positive rate of PCV2 was 3 ， 2 0 % （45/1403），the overall positive rate of PCV3 was 3 3 . 0 0 % （463/ 1403），and the combined infection rate of PCV2 and PCV3 was 7 . 8 4 % （11/1403）. The positive detection rate of PCV2 and PCV3 in C field was the highest，with PCV2 7 . 4 6 % （10/134），PCV3 64.18%（36/134）， and PCV2 and PCV3 mixed infection rate 3 . 7 3 % （5/134）. The positive rate of PCV2 and PCV3 was the highest，and the positive rate of PCV2 was 4 . 7 8 % （25/523）. The detection rate of PCV3 was 57.36%（300/ 523）．The detection rates of PCV2 and PCV3 were high in allseasons，and the PCV3 strain was PCV3b and PCV3c.【Conclusion】PCV3 infection has been found in some large - scale pig farms in Xinjiang and the prevalence rate of PCV3 is much higher than that of PCV2，and PCV3 strain is PCV3b and PCV3c.

Key words：Porcine circovirus type 3； Porcine circovirus type 2； fluorescent quantitative PCR； pig