甲酸與貯藏時間對柱花草青貯飼料化學(xué)成分及生物胺含量的影響

摘要：為評價(jià)甲酸與貯藏時間對柱花草（Stylosanthes guicmensis）青貯飼料化學(xué)成分及生物胺含量的影響，本試驗(yàn)設(shè)置對照組和甲酸（ 處理組，每組分別青貯1個月和12個月，然后測定化學(xué)成分和生物胺含量，并分析兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，甲酸處理顯著降低了青貯飼料 值和氨態(tài)氮含量 ，顯著提高了干物質(zhì)和可溶性糖含量 。貯藏1個月時，對照組青貯飼料中主要生物胺是尸胺 M）、腐胺1 ）及酪胺 ；隨著貯藏時間的延長，尸胺、酪胺及總生物胺含量顯著增加 。甲酸處理顯著降低了尸胺、腐胺、酪胺及總生物胺含量（ 。相關(guān)性分析結(jié)果表明，腐胺、尸胺、酪胺及總生物胺含量與pH值、游離氨基酸氮及氨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系 。因此，建議在柱花草青貯時添加甲酸，以提高青貯飼料的品質(zhì)和衛(wèi)生安全性。

中圖分類號：S816.53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）04-1335-08

Abstract：To evaluate the efect of formic acid and storage time on chemical composition and biogenic amines contents of stylo（Stylosanthes guicmensis） silage，the control and formic acid groups （ ）were preparedand stored forl and12 months in theexperiment，respectively.After silo opening，chemical composition and biogenic amines contents were determined and the correlation between the measured parameters was further analyzed. The results showed that the application of formic acid significantly decreased and ammonia nitrogen value （ ）and significantly increased dry matter and water soluble carbohydrates contents （ P lt; 0.05）.The main biogenic amines were cadaverine ，putrescine DM），and tyramine DM） in control silage stored for l month；With longer storage time， cadaverine，tyramine and total biogenic amine contents remarkably increased （ . Applying formic acid lowered cadaverine，putrescine，tyramine and total biogenic amine contents （ . The correlation analysis indicated that cadaverine，putrescine，tyramine and total biogenic amine were positively related to ，free amino acids nitrogen and ammonia nitrogen （ .Therefore，formic acid should be added to improve

silage quality and hygienic quality at stylo ensiling. Keywords：Stylo；Formic acid；Biogenic amine；Silage

青貯是一種常用的保存牧草技術(shù)1，青貯飼料質(zhì)地柔軟，適口性好，消化率高，有利于養(yǎng)殖業(yè)集約化經(jīng)營[2]。牧草青貯過程中真蛋白發(fā)生降解，游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫羧形成生物胺3。生物胺是一類低分子量含氮有機(jī)化合物，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)將其分為脂肪胺（腐胺、尸胺、精胺及亞精胺）芳香胺（酪胺和苯乙胺）及雜環(huán)胺（組胺和色胺）4。生物胺廣泛存在于青貯飼料中，尤其是高蛋白青貯飼料[5]。燕麥自然青貯中主要生物胺是腐胺（ DM）、尸胺 D及酪胺（896.9 ；苜蓿自然青貯中主要生物胺是腐胺 尸胺 及酪胺 ；全株玉米自然青貯中主要生物胺是腐胺 、尸胺 及酪胺 。高含量生物胺會對反芻動物產(chǎn)生潛在的安全危害[9，如影響適口性，引起酮癥，引發(fā)亞硝酸鹽與亞硝酸胺發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生10，損害瘤胃微生物群和瘤胃黏膜，導(dǎo)致動物酸中毒和相關(guān)炎癥疾病[11]。目前，動物飼料中尚未規(guī)定生物胺安全標(biāo)準(zhǔn)，可參考食品標(biāo)準(zhǔn)。生物胺食用安全標(biāo)準(zhǔn)為：組胺上限為 ；酪胺上限為 苯乙胺上限為 ；總生物胺上限為 。因此，降低青貯飼料生物胺含量對于優(yōu)質(zhì)青貯飼料安全生產(chǎn)和畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。常見的降低青貯飼料生物胺含量的添加劑有乳酸菌（植物乳桿菌、布氏乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌）[14-16]、糖蜜[17-18]、蔗糖7]、甲酸[19-20]丙酸及苯甲酸鈉[6]，其中甲酸的效果最為突出[19-20]。

柱花草（Stylosanthesguicmensis）是我國熱帶地區(qū)主要豆科牧草和重要青貯原料[21-22]，其具有牧草產(chǎn)量高，營養(yǎng)價(jià)值豐富，粗蛋白含量高，富含多種維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，以及適口性好等優(yōu)點(diǎn)[23]。目前，關(guān)于柱花草青貯飼料的研究主要集中在發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)成分、細(xì)菌群落及體外瘤胃發(fā)酵特性上，而關(guān)于生物胺的研究尚未見報(bào)道。此外，甲酸作為發(fā)酵抑制劑常用來抑制青貯飼料中不良微生物的生長和增殖，降低青貯飼料生物胺含量。因此，本研究旨在探究甲酸與貯藏時間對柱花草青貯飼料化學(xué)成分及生物胺含量的影響，為熱帶地區(qū)調(diào)制優(yōu)質(zhì)安全的柱花草青貯飼料提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科基地0 ， ，于2022年6月2日收割第一茬現(xiàn)蕾末期柱花草。

1.2 添加劑

試驗(yàn)所使用的添加劑為天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的甲酸（分析純， ）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。因素一為處理方式，包括蒸餾水對照（CK）和甲酸處理 ，記為FA）；因素二為貯藏時間，分別為1個月和12個月。每個處理組合進(jìn)行4次重復(fù)。

1. 4 試驗(yàn)方法

1.4.1青貯飼料調(diào)制將新鮮收割的柱花草用切紙刀切短至 ，混合均勻。配置甲酸添加劑溶液：量取 甲酸分析純?nèi)芤河谜麴s水定容至 。稱取 原料放入盆中，使用小型噴霧器噴灑溶液，CK組噴灑 蒸餾水；FA組噴灑 配置好的甲酸溶液，邊噴灑邊攪拌。拌勻后平均分成四等份，每份 裝入青貯袋，密封抽真空。每個處理組合4次重復(fù)，共計(jì)16個青貯袋；室溫 下分別貯藏1個月和12個月。

1.4.2測定方法稱取 樣品，加入 蒸餾水進(jìn)行榨汁，將榨汁液通過兩層紗布過濾[24]，每個樣品取兩份濾液（ 備用，用于后續(xù)pH值、氨態(tài)氮（Ammonianitrogen， 及游離氨基酸氮（Freeaminoacidsnitrogen，F(xiàn)AA-N）含量的測定[25]。 值采用 計(jì)進(jìn)行測定（雷磁 PHS-3C，上海儀電科儀公司）， -N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定，F(xiàn)AA-N含量采用芘三酮比色法進(jìn)行測定[26]

稱取 樣品裝入信封袋，放于凍干機(jī)凍干 所得凍干樣品用于測定干物質(zhì)（Drymatter，DM）含量。取上述凍干樣品用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后過 篩用于后續(xù)測定總氮（Totalnitrogen，TN）、可溶性糖（Watersolublecarbohydrates，WSC）及生物胺。TN采用凱氏定氮法進(jìn)行測定[27]，粗蛋白（Crudeprotein，CP）含量采用TN含量乘6.25計(jì)算得到，WSC含量采用蒽酮比色法進(jìn)行測定[28]。生物胺含量測定由福州貝瑞思生物科技有限公司完成，步驟如下：稱取上述凍干樣品 加入離心管中，加入 鹽酸，渦旋混勻，在室溫下提取 離心 ，取上清液。取 樣品到瓶中，加入 AccQ·TagUltraBorate緩沖液和 AccQ·Tag試劑，將反應(yīng)混合物在 加熱 ，冷卻后進(jìn)行高效液相色譜分析（HPLC）。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要是超高效液相色譜（Vanquish，UPLC，Thermo，USA）和高分辨質(zhì)譜（QExactive，Thermo，USA）。液相色譜條件：色譜柱：Waters BEH（ 流動相：A相為超純水（含 0 . 1 % 濃度甲酸），B相為乙腈（含 0 . 1 % 濃度甲酸）；流速 ；柱溫 ；進(jìn)樣量 ；洗脫梯度為 9 5 % 水和 5 % 乙腈， 90 % 水和 10 % 乙腈， ， 7 5 % 水和 2 5 % 乙腈， ， 40 % 水和 60 % 乙腈， 9 5 % 水和 5 % 乙腈， 9 5 % 水和 5 % 乙腈。整個分析過程中樣品置于 自動進(jìn)樣器中。質(zhì)譜條件：采用美國Thermo公司的QExactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行的采集。采用電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），鞘氣 ；輔助氣 ；離子噴霧電壓 ；溫度 ；離子傳輸管溫度 。掃描模式為全掃（FullMS），掃描方式為正離子。一級掃描范圍： 。1.4.3數(shù)據(jù)分析相關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2020進(jìn)行初步的匯總整理，隨后用SAS9.4數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行進(jìn)一步的分析整理。利用一般線性模型對貯藏時間（S）添加劑（A）以及交互效應(yīng)進(jìn)行方差分析。使用SPSS24軟件對柱花草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和生物胺含量進(jìn)行相關(guān)性分析，繪制成表。各處理均以“平均值\"來進(jìn)行表示。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均以 為顯著性水平。

2 結(jié)果和分析

2.1 原料特性

柱花草原料特性如表1所示，pH值為5.43，DM含量為 FM，WSC含量為 DM，CP含量為 DM，TN含量為21.13 g. DM，F(xiàn)AA-N含量為

TN， -N含量為 TN。柱花草原料中主要生物胺是腐胺（112. DM），其次是亞精胺 。尸胺、酪胺、精胺、苯乙胺及色胺含量較少，組胺在原料中未被檢測到。

2.2 青貯飼料化學(xué)成分

青貯飼料化學(xué)成分見表2。貯藏時間為1個月時，與CK相比，F(xiàn)A顯著降低 值、FAA-N及 -N含量 ，顯著提高DM和WSC含量L 。貯藏時間為12個月時，與CK相比，F(xiàn)A組 值、FAA-N及 -N含量顯著降低（ P lt; 0.05），顯著提高WSC含量 。隨著貯藏時間的增加，CK組 含量顯著增高 P lt; 0.05），WSC和FAA-N含量顯著降低 。從總體均值上看，F(xiàn)A使用在DM、WSC、FAA-N及 -N上具有顯著差異 ，貯藏時間在pH值、DM、WSC、FAA-N和 -N上存在顯著差異 。貯藏時間和添加劑的交互效應(yīng)僅顯著影響了柱花草青貯飼料WSC含量 0

2.3青貯飼料生物胺含量

青貯飼料生物胺含量相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。柱花草青貯飼料中主要生物胺為尸胺 DM）、腐胺 DM）及酪胺（127.34 DM），其余5種生物胺含量均不超過20 。與CK相比，F(xiàn)A降低所有生物胺含量以及總生物胺含量。隨著貯藏時間的增加，CK組尸胺、酪胺、苯乙胺及總生物胺含量顯著增加（ P lt; 0.05），而組胺、色胺、精胺及亞精胺含量顯著降低（ P lt; 0.05）。從總體均值上看，F(xiàn)A在尸胺、腐胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺及總生物胺上存在顯著差異 ，貯藏時間在8種生物胺和總生物胺上存在顯著差異 。貯藏時間和添加劑的交互效應(yīng)顯著影響了柱花草青貯飼料中酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺及總生物胺含量 。

2.4青貯飼料化學(xué)成分和生物胺含量相關(guān)性

青貯飼料化學(xué)成分和生物胺含量相關(guān)性分析見表4。青貯飼料中腐胺與 FAA-N及 -N呈極顯著正相關(guān) 。尸胺與 ，F(xiàn)AA-N及 -N呈極顯著正相關(guān) ，與WSC呈極顯著負(fù)相關(guān) 。酪胺與 ，F(xiàn)AA-N及 -N呈顯著正相關(guān) ?？偵锇放c FAA-N及 -N呈極顯著正相關(guān) 。

3討論

3.1 原料特性

青貯是在厭氧條件下乳酸菌將原料中WSC轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸等有機(jī)酸，當(dāng)實(shí)現(xiàn)厭氧狀態(tài)并且pH值降至一定范圍時，霉菌等微生物的活動減少，達(dá)到保存飼草的目的[29]。在青貯過程中，除了需要創(chuàng)造厭氧環(huán)境，原料還必須保持適當(dāng)?shù)暮?，以及足夠的WSC，以確保乳酸菌發(fā)酵能夠順利進(jìn)行[30]。而豆科牧草往往WSC含量低，緩沖能值高，直接青貯效果不佳[31]。在本試驗(yàn)中，新鮮柱花草pH值為5.43，略低于田靜等32]報(bào)道的5.57；CP含量較高，為 ，與Dong等[33]研究結(jié)果相似。優(yōu)良青貯原料的理想DM含量一般為 ，低DM水平會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)被稀釋，提高梭菌活性，從而使乳酸菌發(fā)酵底物濃度下降，降低發(fā)酵品質(zhì)[35-36]。而高DM水平可能會導(dǎo)致牧草之間殘余空氣過多，不利于壓實(shí)和乳酸菌發(fā)酵[37]，發(fā)酵品質(zhì)變差，青貯料發(fā)臭。乳酸菌快速發(fā)酵則需要原料含有 的 。本試驗(yàn)中柱花草原料DM含量為 ，低于理想青貯DM含量，WSC含量也較低，為 DM，低于黃佩珊等[39]和吳碩等[40]報(bào)道的 DM和 ，可能不利于獲得高品質(zhì)柱花草青貯飼料。因此，柱花草青貯時須應(yīng)用添加劑，以改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。

3.2甲酸與貯藏時間對青貯飼料化學(xué)成分的影響

值是衡量青貯飼料青貯品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)[24]，青貯飼料pH值越高說明發(fā)酵品質(zhì)越差，有害微生物的活動沒有被很好地抑制，而pH值越低抑制了青貯飼料中有害微生物及部分乳酸菌活動。一般情況下，優(yōu)質(zhì)青貯飼料pH值在4.2以下，但對于柱花草這類豆科牧草來說，其WSC含量低，很難使其青貯pH值達(dá)到4.2以下[24]。本研究中，添加FA后青貯料pH值降低，是因?yàn)镕A直接酸化導(dǎo)致低pH值，而貯藏時間沒有對pH值產(chǎn)生顯著影響，這與李大璐等41和王子苑等42的研究結(jié)果相似。李大璐等41]的研究結(jié)果表明青貯pH值隨著青貯時間的延長呈現(xiàn)先降低后稍有升高的現(xiàn)象，本研究并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能是因?yàn)檠芯抠A藏時間點(diǎn)少，后續(xù)將增加貯藏時間點(diǎn)進(jìn)一步研究。

青貯飼料中乳酸是發(fā)酵的主產(chǎn)物，WSC可促進(jìn)乳酸菌的生長和繁殖，乳酸菌利用WSC產(chǎn)生乳酸和乙酸，降低pH值，從而抑制有害微生物對WSC分解。因此，WSC含量越高說明青貯原料發(fā)酵底物越多，青貯料發(fā)酵品質(zhì)可能越好[43]。本研究中隨著貯藏時間的增加，WSC含量顯著降低，這與王志敬等[44]和張潔等[45]的研究結(jié)果相似。這可能由于發(fā)酵初期柱花草WSC等物質(zhì)為乳酸菌生長繁殖提供營養(yǎng)，隨著青貯的進(jìn)行，青貯料中WSC逐漸降低，當(dāng)下降到一定含量時進(jìn)入穩(wěn)定期，此時各種菌的活性均比較低，同型乳酸菌不再占主導(dǎo)地位，異型乳酸菌開始生成乙醇、乙酸和二氧化碳等[28.32]，乳酸菌繁殖到一定數(shù)量時，剩余WSC不足以供給乳酸菌繼續(xù)進(jìn)行繁殖，并且WSC持續(xù)被消耗最終會慢慢抑制乳酸菌活動[46]。而添加FA顯著可以顯著提高青貯料中WSC含量，說明FA的添加抑制了微生物活性，從而降低了對WSC消耗，這與王輝47研究結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化過程分為兩步，首先是肽鍵被水解形成游離氨基酸和肽，其次，氨基酸被進(jìn)一步分解形成氨、有機(jī)酸及胺，氨基酸通過微生物脫氨作用形成 。 -N是衡量青貯飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)，該值的大小可反映出蛋白降解程度， N含量越低表明青貯品質(zhì)越好47]，相反，蛋白質(zhì)在不良微生物的作用下發(fā)生降解，導(dǎo)致 -N含量升高，從而使青貯品質(zhì)下降。FA作為一種發(fā)酵抑制劑，具有生產(chǎn)成本低和酸化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可以通過抑制發(fā)酵過程中梭狀芽孢桿菌和某些革蘭氏陰性菌活動，從而抑制蛋白質(zhì)分解[48]。植物蛋白酶也被認(rèn)為在青貯過程的蛋白質(zhì)分解中起著重要作用[49]。本試驗(yàn)中，隨著貯藏時間的延長， -N含量顯著升高，而添加FA會顯著降低其含量，說明FA抑制柱花草青貯料中蛋白質(zhì)分解，營養(yǎng)物質(zhì)得到了較好的保存，并且FA的添加使青貯飼料酸化，直接降低青貯飼料pH值和 -N含量，這與侯志江等[50]和曹欣等[51]的研究結(jié)果一致。

3.3甲酸與貯藏時間對青貯飼料生物胺含量的影響

生物胺是植物細(xì)胞的內(nèi)源性代謝成分，有部分是天然存在的，也有部分是在儲存、老化和腐敗過程中通過微生物新合成的5，廣泛存在于青貯飼料和發(fā)酵飼料中[8.52]。生物胺的形成主要是通過微生物進(jìn)行游離氨基酸脫羧反應(yīng)，少數(shù)由植物酶引起[53]。青貯飼料中生物胺含量一般高于原料[54]，其類型和含量的差異可能是由于原料種類、附著微生物群落結(jié)構(gòu)和發(fā)酵條件的變化[55]。在本研究中腐胺、尸胺及酪胺是柱花草青貯飼料中主要生物胺，這與Steidlova等15和Jia等6的研究結(jié)果一致。腐胺、尸胺及酪胺的前體分別是精氨酸、賴氨酸及酪氨酸。這些氨基酸在發(fā)酵的第一階段由植物蛋白水解酶水解生成，隨后脫羧形成生物胺[17]。紫花苜蓿青貯飼料中腐胺主要是由梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌及檸檬酸桿菌形成；尸胺主要是由大腸桿菌和克雷伯氏菌形成；酪胺主要是由梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌及克雷伯氏菌形成[。添加FA對精胺和亞精胺降低效果不顯著，而CK組隨著貯藏時間的延長，精胺和亞精胺含量顯著降低，這可能是因?yàn)榫泛蛠喚凡皇怯砂被崦擊确磻?yīng)直接形成而是從腐胺轉(zhuǎn)化而來[55]，并隨青貯時間延長，腐胺含量有所降低，導(dǎo)致精胺和亞精胺含量隨之降低。

3.4青貯飼料化學(xué)成分和生物胺含量相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)，組胺是組氨酸脫羧酶通過L-組氨酸脫羧形成的，與克雷伯氏菌和大腸桿菌呈顯著正相關(guān)[17]，而這些細(xì)菌即使在低細(xì)菌數(shù)等惡劣條件下也能夠產(chǎn)生大量組胺[56]。本試驗(yàn)中，隨著貯藏時間的延長，F(xiàn)A對組胺降低效果不明顯，而CK組組胺含量顯著降低，尸胺、酪胺及苯乙胺顯著增加。這可能是青貯發(fā)酵開始的1個月，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被植物細(xì)胞和微生物消耗，DM減少。腐胺和尸胺主要是由腸桿菌形成的，組胺和酪胺是由乳酸菌形成[17]，隨著青貯時間的延長，乳酸菌數(shù)量逐漸減少，組胺和酪胺含量增加緩慢，尸胺和腐胺含量逐漸累積，而FA的抑制效果對主要生物胺顯著[15]，對貯藏12個月的組胺抑制效果不明顯，可能是因?yàn)榻M胺含量較低，組胺含量在貯藏1個月時達(dá)到高峰，后期則逐漸減少。在本研究中CK組總生物胺含量隨著青貯時間的延長而增加，可能是因?yàn)镃K組在青貯發(fā)酵過程中微生物活性不斷增強(qiáng)，添加FA后總生物胺含量急劇下降，結(jié)果表明FA對生物胺的形成具有很強(qiáng)的抑制作用，這與VanOs等[17]的研究結(jié)果相似。

4結(jié)論

柱花草自然青貯發(fā)酵品質(zhì)差，主要生物胺是尸胺、腐胺及酪胺；隨著貯藏時間的延長，尸胺、酪胺及總生物胺含量顯著增加。貯藏時間為1和12個月時，甲酸處理均顯著改善了柱花草青貯品質(zhì)，降低了尸胺、腐胺、酪胺及總生物胺含量。綜上所述，甲酸處理的青貯品質(zhì)更好，因此，建議使用甲酸處理的青貯柱花草進(jìn)行飼喂。

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（責(zé)任編輯付宸）