不同防霉劑對高水分首蓿干草捆營養(yǎng)成分和抑菌效果的影響

關(guān)鍵詞：苜蓿草捆；防霉劑；貯藏天數(shù)；抑菌效果；營養(yǎng)價值中圖分類號： 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）04-1281-08

Abstract：In order to harvest alfalfa hayat high moisture content，in this study three preservatives（calcium pro pionate，sodium propionate and Sodium diacetate propionate） were added to high moisture content （ 20 % - 2 5 % ） ）alfalfa bales according to the initial antimicrobial tests.Samples were taken at O，3O and 6O days after baling，and the nutritional quality，mold species and quantity were determined.The results showed that after 60 days of storage，C3 treatment （ 0 . 2 % Calcium propionate + 0 . 6 % Sodium propionate + 0 . 2 % Sodium diacetate），C5 （ 0 . 3 % Calcium propionate + 0 . 3 % Sodium propionate + 0 . 3 % Sodium diacetate），and C6 （ 0 . 3 % Calcium propionate + 0 . 3 % Sodium propionate + 0 . 4 % Sodium diacetate）were all effective to inhibit the number and species of mold. With the increase of the storage days，the alfalfa bales treated with C5 and C6 were significantly better than CK （ P lt; 0 . 0 5 ）in CP（Crude protein），NDF（Neutral detergent fiber）and ADF（Acid detergent fiber）． After 6O days of storage，the C6 treatment group had the best comprehensive value for high moisture alfalfa bales.

Key Words：Alfalfa bales；Preservatives；Days of storage；Bacteriostatic effect；Nutritional value

紫花苜蓿（MedicagosatiuaL.）是豆科苜蓿屬牧草，因其生產(chǎn)性能高、適口性好，且兼具高蛋白、低纖維的營養(yǎng)特點，在全球被廣泛種植[。苜蓿草在田間晾曬時經(jīng)常會遭遇不穩(wěn)定的天氣、惡劣的干燥條件等影響適時收獲，迫使生產(chǎn)者不得不在高水分情況下打捆[2]。打捆苜蓿草如果在高水分條件下貯藏，在溫度較高的季節(jié)會發(fā)生發(fā)熱、霉變，甚至產(chǎn)生各種真菌毒素，大大降低苜蓿干草品質(zhì)[3-5]。真菌毒素是引起高水分苜蓿草捆營養(yǎng)品質(zhì)下降的主要原因之一。真菌繁殖導致苜蓿草的營養(yǎng)成分被大量分解，部分真菌在生長過程中能夠產(chǎn)生霉菌毒素等次級代謝產(chǎn)物，嚴重威脅動物健康。因此，減少貯藏過程中霉變現(xiàn)象的發(fā)生是當前首蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展不可忽略的問題。添加防霉劑是目前最為有效的飼草防霉方式，它不僅能夠抑制霉菌，還能有效減少營養(yǎng)流失[6]。

丙酸及丙酸鹽（丙酸鈉、丙酸鈣、丙酸銨）可用作動物飼料防腐、食品防腐，通過抑制霉菌的生長及繁殖，防止飼料發(fā)霉變質(zhì)并延長貯存時間[]。丙酸鹽中的防霉成分主要是解離后生成的丙酸分子，通過破壞微生物細胞的正常生理功能來抑制微生物生長，但丙酸具有較強的揮發(fā)性，不利于長期貯存[8-9]。Lacey等[10-11]研究表明添加丙酸及其鹽類可以防止干草發(fā)霉，丙酸銨對霉變的抑制作用略差于丙酸，但其無刺激性氣味，揮發(fā)性較小，腐蝕性較小。還有研究表明添加不同濃度二丙酸銨的復合防霉劑能延遲霉菌大量繁殖的時間，其中的二丙酸銨能夠釋放2個丙酸根離子，充分發(fā)揮防霉作用[12]。雙乙酸鈉是一種廣泛用于食品和飼料的防腐保鮮劑，具有安全性高、成本低、用量少，防霉效果顯著等優(yōu)點[13]。雙乙酸鈉抑菌的有效成分是乙酸，通過滲透真菌、細菌細胞壁而干擾各種酶體系的相互作用，使蛋白質(zhì)變性，從而達到防霉、防腐等功能[14-15]。雙乙酸鈉較多的被添加到青貯飼料中，李艷芬等[16-17]研究表明添加適量的雙乙酸鈉可以抑制細菌及霉菌的生長與繁殖，顯著改善青貯飼料的營養(yǎng)品質(zhì)，提高飼用價值和發(fā)酵品質(zhì)。但是，目前對于施用丙酸鹽及雙乙酸鈉在高水分干草捆的適用比例、防霉效果尚不明確。本研究通過添加不同比例的防霉劑，探究其對高水分苜蓿干草捆營養(yǎng)成分和抑菌效果的影響，篩選出最適的防霉劑比例，從而為高水分苜蓿干草捆貯藏提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

本試驗以‘中首三號'紫花苜蓿為試驗對象，試驗地位于農(nóng)業(yè)大學溫室基地。試驗試劑丙酸鈣、丙酸鈉和雙乙酸鈉均為分析純 （ gt; 9 9 % ），為菁騰商貿(mào)有限公司提供。

1. 2 試驗設(shè)計

將不同比例防霉劑（丙酸鈣、丙酸鈉和雙乙酸鈉）添加到統(tǒng)一處理的霉菌培養(yǎng)基內(nèi)，在其上接種霉菌，霉菌從發(fā)霉草捆中提取，防霉劑具體比例如表1所示，通過抑菌試驗篩選出3種適宜比例的防霉劑。

將抑菌實驗篩選的3種防霉劑比例作為最終添加劑量，選取第3茬初花期的苜蓿作為試驗劉割對象，劉割后在田間晾曬至含水量為 20 % ～ 2 5 % 時，將3種不同比例的防霉劑等量噴灑（噴灑量為 1 0 ～ 到首蓿干草上后打捆貯藏，對照組噴灑等量水，在貯藏不同天數(shù)后進行常規(guī)營養(yǎng)成分及霉菌種類和數(shù)量的測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1營養(yǎng)指標測定粗蛋白質(zhì)（CP）含量采用杜馬斯燃燒法進行測定[18]。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量采用范式洗滌纖維法進行測定[19]?；曳郑ˋsh）采用 燃燒法進行測定[20]。粗脂肪含量（EE）采用索氏提取法進行測定[20]。相對飼用價值（RFV）參照成啟明等[21]的方法計算得出，通過計算干物質(zhì)采食量（DMI和可消化干物質(zhì)（DDM）得到，公式如下：

1.3.2霉菌種類及數(shù)量檢測抑菌試驗參照馬天[22的方法，將Od及貯藏6Od的霉菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，采用平血計數(shù)法對各個處理組（CK，C3，C5和C6）的霉菌數(shù)量進行統(tǒng)計，用接種環(huán)剝?nèi)∩L出的霉菌至凍菌管中保存。從樣品中提取基因組DNA后，進行PCR擴增rDNA的ITS2區(qū)，引物序列如下：ITS3_KYO2：GATGAAGAACGYA-GYRAA，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC然后進行PCR擴增產(chǎn)物切膠回收，QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，IluminaPE250上機測序，該測序過程由廣州基迪奧公司完成[23]。1.3.3隸屬函數(shù)評價采用隸屬函數(shù)法進行綜合評價，根據(jù)隸屬函數(shù)值確定最適防霉劑組合。若測定指標與營養(yǎng)指標呈正相關(guān)，則隸屬函數(shù)值 ；若測定指標與營養(yǎng)指標呈負相關(guān)，則隸屬函數(shù)值 ，式中，X為測定值； 為測定指標的最大值； 為測定指標的最小值，之后求平均值并進行綜合排名[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用WPS對數(shù)據(jù)進行初始化整理，用SAS9.0程序?qū)σ志Ч筒煌A藏天數(shù)的防霉效果做單因素方差分析，用SPSS23.0軟件對不同天數(shù)、不同防霉處理及二者交互作用對營養(yǎng)成分的影響進行雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1添加不同防霉劑對霉菌的抑制效果

抑菌直徑表明抑菌能力的強弱，越小則說明抑菌效果越好。對照組為霉菌布滿培養(yǎng)基，其直徑為 。如圖1所示，各處理組的抑菌直徑均低于對照組，且與對照組差異顯著 ，表明添加防霉劑能夠抑制霉菌生長，添加復合防霉劑處理組（C1～C6）的抑菌效果明顯優(yōu)于添加單一防霉劑處理組（ 。其中，復合防霉劑處理組C3，C5和C6的抑菌直徑均小于 ，且與其他各處理組差異顯著（ ，因此，將復合防霉劑C3，C5和C6處理組作為合適比例噴施到大田中。

2.2復合防霉劑對不同貯藏天數(shù)苜蓿營養(yǎng)成分的影響

隨著貯藏天數(shù)的延長，各處理組CP含量均呈現(xiàn)下降趨勢（表2）。在貯藏30d時，C5和C6處理組的CP含量顯著高于對照組（ ；在貯藏60天時，C3，C5和C6處理組的CP含量顯著高于對照組 ？ lt; 0 . 0 5 ） 。在同一處理下，NDF和ADF的含量隨著貯藏天數(shù)的增加呈逐漸上升趨勢。在貯藏 后，C5和C6處理組的NDF含量顯著低于對照組L ，而在貯藏60d后，C3處理組的NDF含量顯著低于對照組 。在貯藏60d后，各處理組的ADF含量均顯著低于對照組 。Ash含量在同一處理下不同貯藏期內(nèi)各處理組差異不顯著，在貯藏6Od時，復合添加劑處理組Ash含量均高于對照組，但各處理組差異不顯著。EE含量隨著貯藏天數(shù)的增加，各處理組均呈下降趨勢。在貯藏30d時，C3和C6的EE含量顯著高于對照組（ ？ P lt; 0 . 0 5 ） ，在貯藏6Od時，C5和C6處理組顯著高于對照組。隨著貯藏天數(shù)的增加，各處理組的RFV都顯著下降 。在貯藏30d時，C5和C6處理組的RFV顯著高于對照組 ，在貯藏60d時，C3和C6處理組的RFV顯著高于對照組（ P lt;

0.05）。天數(shù)對CP，NDF，ADF，EE和Ash含量具有極顯著影響 ，處理對CP，ADF和EE含量有極顯著影響（ ，對RFV具有顯著影響 ，天數(shù)和處理的交互作用顯著影響EE含量 ，但對CP，NDF，ADF和Ash含量無顯著影響。

2.3復合防霉劑對苜蓿干草捆霉菌數(shù)量及種類的影響

不同貯藏期，不同處理的霉菌數(shù)量不同（圖2），在貯藏Od時，各處理組的霉菌數(shù)之間差異不顯著。

在貯藏6Od時，各處理組的霉菌數(shù)量均顯著低于對照組 ，其中，霉菌數(shù)量最低的為C6處理組，最高的為對照組，各復合防霉劑處理組間的霉菌數(shù)量差異不顯著。

利用ITS2代測序?qū)Σ煌A藏天數(shù)的不同處理進行物種分類鑒定，苜蓿干草樣品的612個OTUs分屬于4門。由圖3所示，在貯藏0d時，各處理組均出現(xiàn)子囊菌門（Ascomycota）。在貯藏6Od時，各處理組出現(xiàn)擔子菌門（Basidiomycota）與子囊菌門（Ascomycota）。C3，C5和C6中子囊菌門的相對豐度要高于對照組，在C6處理組出現(xiàn)毛霉菌門（Mucoromycota）。

由圖4所示，在貯藏前后，鑒定到共19菌屬。在貯藏Od時，各處理間均發(fā)現(xiàn)曲霉屬（Aspergillus），其他菌屬豐度相對較低。在貯藏6Od時，漢納酵母屬（Hannaella）成為優(yōu)勢屬，在各處理組中相對豐度均為最高，對照組的相對豐度大于各處理組。對照組相對豐度較高有的曲霉屬（Aspergilus）和根霉屬（Rhizopus），曲霉屬隨著貯藏時間的延長在各處理組呈下降趨勢。C3處理相對豐度較高的菌屬有小囊菌屬（Plectosphaerella）和曲霉菌屬（Aspergillus），C5處理相對豐度較高的菌屬有擔子菌屬（Vishniaco-zyma）和青霉菌屬（Penicillium），C6處理相對豐度較高的菌屬有Lectera和線黑粉菌屬（Filobasidium）。

2.4 隸屬函數(shù)評價

將貯藏60d后的苜蓿干草捆采用營養(yǎng)指標（CP，NDF，ADF，EE和Ash）RFV以及霉菌數(shù)量進行隸屬

函數(shù)分析，其中CP，EE和RFV為正向指標，其余為負向指標。根據(jù)隸屬函數(shù)值進行綜合排序，在貯藏 后，C6處理的高水分首蓿草捆綜合價值最高（表3）。

3討論

3.1添加不同防霉劑對霉菌的抑制效果

雙乙酸鈉進入霉菌細胞內(nèi)，通過對酶活性的破壞而使霉菌死亡[25]。張錚等[26]通過對四種防霉劑的防霉效果研究發(fā)現(xiàn) 0 . 3 % 的雙乙酸鈉的防霉效果優(yōu)于其他單一防霉劑的防霉效果，本試驗中添加雙乙酸鈉的抑菌效果也優(yōu)于添加丙酸鹽類的抑菌效果，說明雙乙酸鈉釋放的雙乙酸分子較丙酸鹽揮發(fā)釋放的游離丙酸作用更強，對霉菌的抑制效果更好。靳雙星等[27-29]研究表明雙乙酸鈉與丙酸鈣復配對霉菌的抑制效果要優(yōu)于單獨防霉劑的抑菌效果，這在本試驗中也得到了證實。本試驗中，復合防霉劑C3，C5和C6抑菌效果優(yōu)于單一防霉劑處理（S1～S3），說明丙酸鹽與雙乙酸鈉組合在一起能夠更好地抑制霉菌生長，其增效和協(xié)同作用可以克服單一防霉劑在抑菌效果的局限性，擴大抑菌作用和范圍。同時，使用復合防霉劑具有提高使用安全性、增加抑菌強度、拓寬抑菌譜等效果[30]。

3.2添加復合防霉劑對苜蓿干草捆貯藏效果的影響

添加復合防霉劑對高水分條件下打捆的苜蓿干草有一定防霉效果。受溫度和濕度的影響，在干草貯藏的第1d開始發(fā)生復雜的微生物變化，包括從田間真菌種類到貯藏真菌種類的轉(zhuǎn)變[31]。在本試驗中，苜蓿干草在打捆的0d后取樣，各處理組均檢測到少許的霉菌，在貯藏6Od時，各處理組的霉菌數(shù)量上升，其中，對照組的霉菌數(shù)量最多。這是因為在高水分條件下打捆時為霉菌的生長提供了一個較為舒適的環(huán)境，霉菌等微生物利用草捆內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)進行了大量繁殖。而C3，C5和C6處理的苜蓿干草捆的霉菌數(shù)量顯著低于對照組，與Killerby等[32]研究結(jié)果一致，說明復合防霉劑對苜蓿草捆霉菌生長繁殖有一定抑制作用，由于丙酸鹽揮發(fā)產(chǎn)生丙酸后，與雙乙酸鈉協(xié)同發(fā)揮作用，產(chǎn)生丙酸、乙酸分子抑制細胞酶活性，從而抑制霉菌繁殖。周永紅等[33]同樣研究發(fā)現(xiàn)添加丙酸及特殊增效劑能夠發(fā)揮增效協(xié)同作用，使其抑菌效力更強，抑菌譜更廣，與本研究結(jié)果相似。

在貯藏Od時，由于是在高水分條件下打捆，曲霉屬在高水分條件下快速繁殖生長。在貯藏60d時，C3，C5和C6處理的曲霉屬的相對豐度下降，低于對照組，說明添加復合防霉劑對曲霉屬有一定的抑制作用，這與榮磊等[34]研究結(jié)果一致。赭曲霉毒素A（OTA）是由青霉菌和曲霉菌產(chǎn)生的，發(fā)霉的紫花苜蓿干草含有赭曲霉時，會引起牛流產(chǎn)[35]，對比復合防霉劑處理組，對照組的曲霉屬相對豐度占比更大，因此更容易產(chǎn)生OTA。隨著貯藏時間的延長，各處理均發(fā)現(xiàn)根霉屬，根霉屬主要通過利用首蓿草營養(yǎng)物質(zhì)進行孢子繁殖，破壞細胞壁，影響苜蓿品質(zhì)。添加復合防霉劑C6處理組的根霉屬相對豐度最低，可能是復合添加劑丙酸鹽分解產(chǎn)生的丙酸抑制了病原菌孢子的萌發(fā)時需要的營養(yǎng)活性物質(zhì)，抑制菌絲的生長[36]。在各處理中均發(fā)現(xiàn)漢納酵母屬，C3，C5和C6組的漢納酵母屬的相對豐度占比低于對照組，說明添加丙酸鈣和丙酸鈉對漢納酵母屬產(chǎn)生抑制作用，由于在丙酸鹽脅迫條件下，使細胞壁完整性受到了一定程度的威脅甚至破壞[37]

3.3復合防霉劑對不同貯藏天數(shù)苜蓿營養(yǎng)成分的影響

牧草的營養(yǎng)價值是評定其品質(zhì)的重要指標之一，其營養(yǎng)價值主要取決于CP，NDF和ADF含量。CP含量是反映飼草料營養(yǎng)價值的重要指標之_[38]。在本試驗中，隨著貯藏天數(shù)的增加，各處理組CP含量呈下降趨勢，NDF和ADF含量呈上升趨勢，與楊燕燕等[6.39-40]研究結(jié)果一致，高水分條件下打捆，在初始貯藏過程中，草捆內(nèi)部溫度濕度升高，微生物加速繁殖并消耗了大量營養(yǎng)物質(zhì)，使得草捆內(nèi)部發(fā)熱嚴重，發(fā)生發(fā)霉現(xiàn)象[41]。添加復合防霉劑后，CP含量顯著高于對照組，并且不同處理對CP含量有顯著影響。Reyes等4研究發(fā)現(xiàn)最低添加0 . 5 % 的木質(zhì)素磺酸鈉和丙酸在高水分苜蓿干草上可以防正蛋白水解損失，說明添加復合防霉劑處理后能夠有效抑制霉菌的活動，減緩霉菌孢子繁殖速度，減少CP被降解消化利用。子囊菌門是腐生菌，能夠產(chǎn)生纖維素酶，分解纖維素[43]。本試驗中，C3，C5和C6處理組的子囊菌門相對豐度高于對照組，子囊菌門通過分解纖維素降低NDF和ADF的含量，因此，各處理組的NDF和ADF含量顯著低于對照組。NDF和ADF含量下降，充分說明在高水分打捆時添加復合防霉劑能夠通過改變霉菌活動來改變NDF和ADF進而影響RFV。RFV是NDF和ADF的綜合反映，是飼草質(zhì)量的評定指數(shù)，其值越高說明飼草營養(yǎng)價值越高，代表干草品質(zhì)越好[44-45]。孫雷雷[46]研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，苜蓿干草品質(zhì)均呈降低趨勢，剛打捆的苜蓿干草品質(zhì)最優(yōu)。在本試驗同樣發(fā)現(xiàn)RFV隨著貯藏天數(shù)的增加呈下降趨勢，且不同貯藏天數(shù)對RFV影響顯著，在貯藏60d時，C3和C6處理的苜蓿草捆的RFV相對最優(yōu)。在貯藏60d時，C3，C5和C6處理組的Ash含量均高于對照組，這與丁武蓉等[47研究結(jié)果一致。其原因是復合防霉劑中含有鈣鹽和鈉鹽，在貯藏過程中隨草捆水分快速蒸發(fā)干燥，從而增加了Ash的含量。飼草中EE含量超過 5 % 時容易引起家畜腹瀉或過肥，抑制家畜瘤胃微生物繁殖[48]，本試驗中，各處理組的EE含量均不超過 5 % ，各處理組的EE含量隨著貯藏天數(shù)的延長而下降，但均高于對照組，與李改英等[12]研究結(jié)果一致，同時，不同防霉劑處理及不同貯藏天數(shù)的交互作用顯著影響EE含量，說明添加復合防霉劑能夠有效抑制打捆后貯藏期內(nèi)首蓿草捆EE含量的下降。總體而言，添加復合防霉劑處理后能夠有效減緩高水分苜蓿草捆的營養(yǎng)損失。

4結(jié)論

綜合營養(yǎng)成分、貯藏前后的防霉效果及隸屬函數(shù)法評定得出C6處理為最優(yōu)添加劑組合。添加C6處理后，隨著貯藏天數(shù)的增加，能夠有效保存苜蓿干草捆的CP含量以及降低RFV的損失。在貯藏60d后，添加C6處理能夠有效抑制霉菌數(shù)量及種類。綜上所述，在高水分條件下貯藏，C6處理（ 0 . 3 % 丙酸鈣 + 0 . 3 % 丙酸鈉 + 0 . 4 % 雙乙酸鈉）可以作為適宜的復合防霉劑添加到苜蓿草捆中。

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（責任編輯 彭露茜）