鴨茅銹病相關(guān)病原真菌生理特性研究及毒性分析

Abstract：Rust is one of the most important diseases that harms orchardgrass In order to clarify the pathogen species，physiological characteristics and toxicity of Dactylis glomerata rust in Sichuan （Ya'an） and Chongqing （Fengdu，Qianjiang and Rongchang），a total of 7 representative samples （3 strains of PD，PD1，PD2 in Rongchang area，2 strains of PD3，PD4 in ，1 strain of PD5 in Fengdu and 1 strain of PD6 in Qianjiang） were selected from the collcted samples in Rongchang area for morphological and molecular biological identification. Seven pathogens were identified as Puccinia graminis.The biological characteristics of rust fungi were studied from 4 aspects： temperature， ， light and nutrients. The results showed that the optimum temperature and for urediospore germination was and7for . The germination rate was ranged from 91 . 8 6 % to 9 3 . 0 4 % ： 0 . 1 % sucrose could promote the germination of spores within ，and 20 % juice could inhibit the germination of spores.Light conditions had no significant efect onthe germination of urediospores. Temperature of for was lethal to urediospores. At the same time，it was found that there were four physiological races in this area. Among them，the frequency of type I was 40 . 9 1 % ，which was the dominant physiological race of orchardgrass rust in this area. Key Words：Orchardgrass；Biological Characteristics；Puccinia graminis；Isolation and identification

植物病害是受生物或非生物因素脅迫，阻礙農(nóng)作物正常生長(zhǎng)、發(fā)育的進(jìn)程，降低農(nóng)作物產(chǎn)量與品質(zhì)，影響作物栽培與育種，造成經(jīng)濟(jì)損失的主要因素之一，在世界各地區(qū)頻繁發(fā)生[。真菌病害是常見的植物病害，約占植物病害的 70 % ～ 8 0 % ，受侵植物多，地理差異大，致病性真菌能夠引起植物出現(xiàn)根腐、萎蔫、葉斑、葉枯等病理癥狀，對(duì)寄主造成毀滅性的傷害[2-5]。銹病是由銹病菌寄生引起的一類植物病害，其分布廣且危害性大，多見于禾谷類作物、豆科植物和梨等，在世界范圍內(nèi)有大區(qū)流行的特點(diǎn)，主要危害植株的葉片、莖稈和果實(shí)，進(jìn)而作物減產(chǎn)甚至絕收[6-13]。

鴨茅（DactylisglomerataL.）又名果園草、雞腳草，是世界上最著名的冷季型禾本科牧草之一，為早熟禾亞科（Festucoideae）鴨茅屬（Dactylis）的唯一物種，在世界各地廣泛種植[14-17]。鴨茅為多年生草本植物，多葉高產(chǎn)，因其具有耐陰、耐寒、耐貧瘠、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，且鴨茅根系發(fā)達(dá)，能夠固定表層土，提高土壤抗侵蝕能力，常被用于草山草坡改良、人工草地、林草復(fù)合植被建設(shè)以及推進(jìn)石漠化地區(qū)的生態(tài)修復(fù)[18-19]。鴨茅具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于與紫花苜蓿（Medicagosativa）、白三葉（Trifoliumrepens）等豆科牧草混播放牧利用或調(diào)制干草和青貯飼料[20-22]

銹病是鴨茅中最常見的病害且危害嚴(yán)重的病害之一[23]，不同生長(zhǎng)階段都可發(fā)生，侵染鴨茅葉片、莖稈和花穗，從而影響鴨茅的飼草生產(chǎn)和種子生產(chǎn)[24-25]。銹病菌主要通過空氣傳播，造成一個(gè)地區(qū)的鴨茅不同程度的侵染[26]，銹病是西南地區(qū)鴨茅真菌病主要病害[24]，最宜發(fā)病溫度為 ，高濕環(huán)境下會(huì)加快銹病菌的擴(kuò)增和繁殖速度[2]。

由于品種引進(jìn)、互換以及繁育種子未進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)，病害的發(fā)生呈多元化、復(fù)雜化的趨勢(shì)。本研究中，通過對(duì)鴨茅病株采集的銹病菌的形態(tài)學(xué)觀察、柯赫氏法則驗(yàn)證和分子生物學(xué)手段，對(duì)鴨茅致病菌進(jìn)行鑒定，確定其生物學(xué)分類地位，并通過不同條件處理對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響探究其生物學(xué)特性，為明確重慶和四川地區(qū)鴨茅銹病病原菌及病原菌的生物學(xué)特性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣本采集及分離純化

樣品分別采自草業(yè)教學(xué)基地30份、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)地25份、豐都縣包鸞鎮(zhèn)飛仙洞村2組17份和黔江區(qū)太極鄉(xiāng)黑溪鎮(zhèn)改革村10份。挑選具有典型銹病夏孢子堆的鴨茅葉片和莖稈，采用單孢子堆分離法分別分離感病鴨茅葉片和莖稈上剛顯孢的單個(gè)孢子堆，用一支已滅菌接種針（末端尖銳）尖部蘸取無菌水，粘附單個(gè)孢子堆上的孢子，以單株上的菌系為一個(gè)純合的單孢子堆菌株，收集后編號(hào)， 條件下保存。然后另取一根針分離另一鴨茅上的單孢子堆，如此重復(fù)數(shù)次即可完成單孢子堆的分離，獲得較純銹病菌孢子。

1.2 試驗(yàn)儀器

本研究采用的儀器如表1所示。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)特征分離純化后的菌株挑取孢子，制成水玻片，于多功能生物顯微鏡（ 4 0 × 1 0 倍）下觀察，每一菌株設(shè)三組平行，每組觀察100個(gè)，記錄孢子的形態(tài)、大小、顏色、表面特征及芽孔數(shù)，記錄并拍照[28]。

1.3.2致病性及致病類型鑒定挑選高感易感品種鴨茅—‘特友'以供接種。鴨茅葉片用 70 % 的酒精擦 遍以殺滅其它雜菌，然后用無菌水反復(fù)沖洗3～4次，用脫脂棉蘸取無菌水并夾住葉片，從葉片病斑下部向上抽提摩擦幾次進(jìn)行脫蠟處理，待聽到葉片摩擦聲即完成脫蠟。用接種針挑取單個(gè)孢子堆上的孢子，涂抹于脫蠟后的葉片背部，每個(gè)孢子堆分離的孢子接種一片葉片。接種完成的鴨茅套上黑色塑料袋，于 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng) 后轉(zhuǎn)為光照 ，每日日照時(shí)長(zhǎng) 條件下培養(yǎng)，期間定時(shí)噴灑無菌水于葉片表面保證高濕環(huán)境。

移栽處于分蘗期且生長(zhǎng)狀況良好的鴨茅作為鑒別寄主，通過毒性分析對(duì)榮昌鴨茅銹病菌致病類型進(jìn)行鑒定。安巴’‘特友'‘CF016332'‘滇北’‘寶興'‘CF016335'‘PI287799'‘PI231610'‘PI595083‘PI440270'共10個(gè)鴨茅資源品種作為鑒別寄主。采用1-3-1方法接種病原菌，接種后12d對(duì)鑒別寄主進(jìn)行反應(yīng)型調(diào)查。反應(yīng)型分級(jí)為： 0 ， 0 ； ， 1 ， 2 ， 3 ， 4 共6級(jí)。其中0～2級(jí)為抗?。≧）， 級(jí)為感?。⊿）。以單株分蘗為重復(fù)，每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)。

0級(jí)（免疫型）：植株無任何反應(yīng)癥狀。

O；級(jí)（近免疫型）：葉片上出現(xiàn)小型褪綠斑點(diǎn)，無孢子堆產(chǎn)生。

1級(jí)（高抗型）：葉片上出現(xiàn)圓形或近圓形褪綠斑點(diǎn)，產(chǎn)生少量孢子堆。

2級(jí)（中抗型）：夏孢子堆大小為小到中等，周圍葉組織枯死或褪綠。

3級(jí)（易感型）：孢子堆大而多，周圍組織出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)。

4級(jí)（高感型）：孢子堆大而多，布滿葉片，周圍組織沒有出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象。

1.3.3分子生物學(xué)鑒定從已采集樣品中挑選具有各地區(qū)代表性樣品進(jìn)行分子鑒定，其中榮昌地區(qū)3株編號(hào)為PD，PD1，PD2，雅安2株編號(hào)為PD3，PD4，豐都1株編號(hào)PD5和黔江1株編號(hào)PD6，共7株病原菌。

采用GBCBIO公司的PlantDNAKit試劑盒分提取代表性菌株的DNA，用真菌通用引物ITS1（ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 和 -TCCTCC GCTTATTGA TATGC- 擴(kuò)增病原菌株核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列（internaltranscribed spacer，ITS）[29]

PCR反應(yīng)體系總體積 ：DNA模板 、 引物ITS1、ITS4各 mmol dNTPS Mix Pfu DNA Polymerase 、 1 0 × Buffer 的SterilizedddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋篜CR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 變性 退火 延伸 ，共30個(gè)循環(huán)，最后 延伸 ，保溫 。擴(kuò)增完之后，分別取擴(kuò)增后的產(chǎn)物 與 上樣緩沖液 loadingbuffer）混勻，點(diǎn)樣于 1 . 5 % 瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔，在 1 × TAE電泳緩沖液中電泳 （電壓 結(jié)束后，于UVP凝膠成像分析系統(tǒng)中分析擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶。PCR產(chǎn)物送到蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，DNA序列同源性通過 NCBI BLAST server（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)；采用Mega7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉（bootstrap）對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，鑒定病原菌種屬，1000次重復(fù)。

1.4病原菌的生物學(xué)特性研究

1.1.1溫度對(duì)銹病菌夏孢子萌發(fā)的影響采用水瓊脂玻片法30研究不同溫度條件下鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響。配制 2 % 的水瓊脂，將滅菌后的水瓊脂刷到滅菌后的載玻片上，待凝固后用小刷子將孢子懸浮液刷于瓊脂玻片上，滅菌培養(yǎng)皿中墊一張全濕的濾紙，將刷有水瓊脂的玻片置于培養(yǎng)皿中，設(shè)置 共7個(gè)處理，放入可控溫氣候培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理重復(fù)3次。 內(nèi)觀察記錄孢子萌發(fā)情況，每隔4h記錄一次，共記錄3次，每次記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.4.2 對(duì)鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響于 條件下設(shè)置3，4，5，6，7，8，9，10，11，12共10個(gè)pH值處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔4h記錄一次，共記錄3次，每次記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.4.3光照條件對(duì)鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響于 條件下設(shè)置全光照 交替光照和全黑暗共3個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔4h記錄一次，共記錄3次，每次記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.4.4營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響采用玻片水瓊脂法，于 條件下設(shè)置無菌蒸餾水為對(duì)照 . 1 % 葡萄糖液 . 0 . 5 % 葡萄糖液 . 0 . 1 % 葡萄糖液、 10 % 鴨茅葉片榨汁液、 20 % 鴨茅葉片榨汁液共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔4h記錄一次，共記錄3次，每次記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.4.5夏孢子的致死溫度及生存力收集銹菌夏孢子，將收集到的夏孢子分別置于 ， ， ， 條件下，分別處理 、 ，處理后的孢子用水瓊脂玻片法于 條件下并觀察其生存能力，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用以下公式計(jì)算銹菌夏孢子萌發(fā)率；利用Excel2010、IBMSPSSStatistics20等軟件進(jìn)行顯著性分析。

孢子萌發(fā)率 （ % ） = 夏孢子萌發(fā)總數(shù)/調(diào)查夏孢子總數(shù) × 1 0 0 %

2 結(jié)果與分析

2.1病害癥狀及病原菌形態(tài)學(xué)觀察

2015年1月—2018年3月連續(xù)3年田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，稈銹病主要危害鴨茅地上部分，孢子葉兩面生，排列無規(guī)則，其中以葉鞘和莖稈最重。感染初期，鴨茅葉片上有淺黃色斑點(diǎn)，隨著病情發(fā)展，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，葉片表面隆起，形成圓形或近圓形大小為 的淺黃色粉末狀夏孢子堆，形狀不規(guī)則，后期成熟夏孢子呈黃褐色、紅褐色，類似于鐵銹，從夏孢子堆中散落出來，隨氣流飄落布滿整個(gè)葉片甚至傳播到其他植株上（圖1A，B，C）。

于5月份銹病高發(fā)時(shí)節(jié)分別從感病鴨茅葉片和莖稈上采集得到銹病菌夏孢子樣品82份，并制作水鏡片于光學(xué)顯微鏡下對(duì)樣品進(jìn)行觀察（圖2），夏孢子為單胞，散生，孢子呈橢圓形、近球形，黃色或黃褐色，孢子表面不光滑有突起的小刺（圖2A），孢子大小 ，基部較頭部小，有 個(gè)芽孔沿赤道排列，部分孢子有明顯的柄，但易脫落，在失水條件下孢子會(huì)從中部發(fā)生皺縮。冬孢子為雙胞，呈棒狀，中間有明顯的隔且壁較厚，顏色較夏孢子深，呈黃褐色，孢子表面光滑無突起的小刺，有明顯的柄（圖2B，C）。

2.2 致病性測(cè)定

通過回接試驗(yàn)接種到鴨茅上后，第 接種葉片上無明顯變化，但能觀察到孢子附著，第4d時(shí)，接種部位開始出現(xiàn)圓形或近圓形的褪綠斑點(diǎn)，接種菌株手觸碰時(shí)無孢子散落，表明孢子已經(jīng)附著。接種后第5d，病斑處出現(xiàn)隆起，形成明顯孢子堆，但孢子未裸露；第7d時(shí)，病原菌開始穿透葉片表皮，孢子堆上有裸露在外的黃褐色孢子；接種后第9d，病斑處孢子堆增大，裸露的孢子增多，其他葉片上開始出現(xiàn)病癥，此時(shí)莖葉感病率可達(dá) 1 7 . 0 7 % 第12d時(shí)，葉片中上部基本布滿孢子堆，感病率達(dá)3 2 . 0 6 % ，且夏孢子能完全侵入鴨茅感病組織中?；亟釉囼?yàn)表明，病原菌夏孢子導(dǎo)致銹病流行的主要因素，在適宜溫度下，病原菌侵入高感易感品種鴨茅，4d內(nèi)能形成明顯毒害作用；高濕條件下有利于孢子的擴(kuò)散和附著，使病害流行，12d可造成全葉侵染（圖3）。

Fig.1Symptoms of rust disease in orchardgrass 注：A為銹菌侵染鴨茅葉片癥狀；B為銹菌侵染鴨茅莖稈癥狀；C為 銹菌侵染鴨茅穗癥狀 Note：A isthe symptom of rust infection in Dactylis glomerata leaves；B isthe symptom of rust infection of Dactylisglomerata stem；Cisthe symptomof rust infectionofDactylisglomerata ear

注：A為夏孢子；B為冬孢子；C為夏孢子和冬孢子；D為孢子萌發(fā)時(shí)芽孔 Note：Aisurediospore；Bis teliospore；Cisurediosporeand teliospore；Dis thebud holeduringspore germination

2.3病原菌在不同品種鴨茅上的毒性反應(yīng)

通過試驗(yàn)，觀察監(jiān)測(cè)到鴨茅銹病菌的致病類型在不同品種寄主上的反應(yīng)（表2），對(duì)榮昌鴨茅銹病菌群體的多樣性研究表明，榮昌區(qū)鴨茅共存在4個(gè)致病類型，即I型、Ⅱ型、Ⅲ型和N型。在所采的22份樣品中，鑒定出I型致病類型9份，出現(xiàn)頻率為40 . 9 1 % ，Ⅱ型致病類型6份，出現(xiàn)頻率為 2 7 . 2 7 % Ⅲ型致病類型5份，出現(xiàn)頻率為 2 2 . 7 3 % ， 型致病類型2份，出現(xiàn)頻率為 9 . 0 9 % （圖4）。由此可以看出工型致病類型是榮昌鴨茅銹病菌的優(yōu)勢(shì)致病型，Ⅱ型致病類型為榮昌鴨茅銹病菌亞優(yōu)勢(shì)致病型。試驗(yàn)結(jié)果表明，榮昌鴨茅銹病菌有較復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)和較高的內(nèi)部多樣性，優(yōu)勢(shì)致病類型有較強(qiáng)的致病性和較廣泛的致病范圍。

2.4 分子鑒定

提取7份樣品基因組DNA，并使用植物真菌通用引物從基因組DNA擴(kuò)增ITS序列，電泳檢測(cè)條帶有無和大小，結(jié)果所有DNA樣品均能擴(kuò)增出640bp左右的特異性條帶，結(jié)果如圖5所示。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過測(cè)序，得出序列經(jīng)BLAST同源性比對(duì)后，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載一致性較高的多條序列，與本研究中各條序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖6，7份樣品均與禾柄銹菌（Puc-ciniagraminis）序列聚在一支上，相似性達(dá) 9 9 % ，并選取具有代表性的一條序列上傳到GenBank，基因登錄號(hào)為：MH638997.1（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/MH638997.1？ repor genbank）。說明四川重慶地區(qū)鴨茅銹病病原均為禾柄銹菌。

2.5病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1溫度對(duì)銹病菌夏孢子萌發(fā)的影響通過水瓊脂玻片法研究溫度對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響（表3），結(jié)果顯示，禾柄銹菌夏孢子在 條件下均能萌發(fā)， 時(shí)萌發(fā)速率最快， 為孢子最適萌發(fā)溫度， 時(shí)萌發(fā)率高達(dá) 91 . 8 6 % ，達(dá)極顯著水平，其中 時(shí)孢子萌發(fā)速率最快； 條件下，孢子在8h后有較快的萌發(fā)速度；溫度達(dá) 后會(huì)抑制孢子的萌發(fā)， 條件下 時(shí)孢子萌發(fā)率僅為 4 . 0 3 % ；而低溫條件下孢子的萌發(fā)速率較高溫差異顯著。禾柄銹菌夏孢子能耐受較低溫度的脅迫，而高溫脅迫時(shí)會(huì)對(duì)孢子萌發(fā)產(chǎn)生抑制，甚至有可能失活。

2.5.2 對(duì)銹病菌夏孢子萌發(fā)的影響 對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響研究結(jié)果顯示（表4），在酸性條件下隨著pH的升高，萌發(fā)率逐漸上升， 內(nèi)萌發(fā)最快，以 為7時(shí)萌發(fā)效果最好， 內(nèi)萌發(fā)率高達(dá)$9 3 . 0 4 ＼% （ P { lt; } 0 . 0 1 ）$ ；堿性條件下，隨著 值的升高，萌發(fā)速率逐漸降低， 為12時(shí)，孢子萌發(fā)率僅為 6 . 5 4 % 。禾柄銹菌夏孢子萌發(fā)的pH值范圍為 ，最適pH為7，且夏孢子具有較好的耐酸性，而對(duì)堿性條件的脅迫較敏感。

Note：Different lower-case letters in the same column indicate signficant difference .Thedatawith different capital lettersin samecolumn show extremely significantdifference ！ The same asbelow

2.5.3光照條件對(duì)鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響光照條件對(duì)銹菌夏孢子的萌發(fā)影響不大，全光照和全黑暗條件下4h內(nèi)差異不顯著，但在 時(shí)，全黑暗條件下孢子萌發(fā)速率較快，達(dá)顯著性水平， 內(nèi)各種處理?xiàng)l件下孢子萌發(fā)率分別為 91 . 2 2 % ，90 . 0 1 % ，91. 16 % （圖7）。

注：不同小寫英文字母表示 不同大寫字母表示差異極顯著 0

Note：Differentlower-case lettersindicate .Differentcapital letters indicate

2.5.4營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)鴨茅銹菌夏孢子萌發(fā)的影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響見表5，葡萄糖和無菌水處理的孢子萌發(fā)率相對(duì)較高，在 時(shí)分別為91. 82 % ， 9 2 . 7 5 % ， 74 . 8 8 % ， 67 . 8 3 % ，而鴨茅榨汁處理下的孢子萌發(fā)率較低， 10 % 榨汁和 20 % 榨汁條件下 時(shí)孢子萌發(fā)率分別為 4 9 . 4 2 % ， 1 3 . 6 1 % 從時(shí)間上看，孢子萌發(fā)最快為前 后孢子萌發(fā)數(shù)量減少，其中， 0 . 1 % 的葡萄糖條件下 內(nèi)孢子萌發(fā)率最高為 $8 9 . 1 1 ＼% （ P { lt; } 0 . 0 1 ）$ 。其次為對(duì)照組，萌發(fā)率為 7 6 . 0 3 % 。而隨著葡萄糖濃度增高，萌發(fā)率逐漸呈顯著性降低。因此，低濃度的C源，有利于夏孢子的萌發(fā)。

2.5.5鴨茅銹病夏孢子致死溫度的測(cè)定采用水瓊脂玻片法測(cè)定銹病菌夏孢子的致死溫度（表6），結(jié)果顯示，夏孢子在 條件下處理達(dá) 后，將夏孢子重新置于 環(huán)境下依然能夠萌發(fā)，說明鴨茅銹病夏孢子能短時(shí)間耐受較高溫度的脅迫； 條件下處理 后孢子依然能夠萌發(fā)， 條件下處理時(shí)間達(dá) 后，孢子已失活，喪失萌發(fā)能力，說明鴨茅銹病菌夏孢子的致死溫度為 。

3討論

3.1 鴨茅銹病病原菌的鑒定

鴨茅作為銹菌的主要寄主，能引起鴨茅銹病的銹菌較多主要有禾冠柄銹菌（PucciniacoronataCorda）、大葉銹菌（Pucciniadactylidina）禾柄銹菌（Pucciniagraminis）條形柄銹菌（Pucciniastriifor-mis）等，廣泛分布于世界各地。目前，由禾柄銹菌引起的鴨茅稈銹病已在美國(guó)、澳大利亞、奧地利和意大利等國(guó)家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)也有報(bào)道[31]。孢子的形態(tài)學(xué)特征是區(qū)分不同銹菌的重要手段[32]。本試驗(yàn)中根據(jù)孢子的形態(tài)特征，菌株夏孢子均為單胞，表面有突起狀小刺，芽孔3～4個(gè)處于孢子中央赤道處；冬孢子棒狀，雙胞壁光滑且有易脫落的柄，在形態(tài)特征上與Puccinia屬有較高的相似性[33-34]，但對(duì)于同一Puccinia屬下的銹菌種類無法根據(jù)孢子的形態(tài)特征來準(zhǔn)確鑒定。目前分子進(jìn)化分析對(duì)于真菌鑒定有最高的準(zhǔn)確性，是生物學(xué)鑒定必不可少的手段之一[35]。本試驗(yàn)通過對(duì)具有地方代表性的7株樣品基因組DNA進(jìn)行提取并通過PCR擴(kuò)增ITS序列，分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果為供試菌株的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)為DQ417384.1，JX424512.1，DQ417391.1，JX047475.1，DQ460727.1的Pucciniagraminis在同一分支上，且ITS序列同源性為 9 9 % 。形態(tài)學(xué)和分子鑒定的結(jié)果表明，四川和重慶地區(qū)鴨茅銹病病原菌均是禾柄銹菌，引起的銹病類型為鴨茅稈銹?。⊿temrust）。

3.2鴨茅銹病的致病性測(cè)定

銹病菌因?yàn)橛袕?fù)雜的生活史，稈銹病、葉銹病和條銹病三種致病菌均是由性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔(dān)孢子5種類型孢子組成的全孢型大循環(huán)銹菌，性生殖階段是誘導(dǎo)病菌致病性發(fā)生突變的主要途徑，該過程已被證實(shí)主要發(fā)生在小檗上[36]。李巧[在研究野生小檗在小麥條銹菌系的分離及致病力測(cè)定時(shí)，從小檗上分離出8株小麥條銹菌系，因其致病力有差異而被劃分為不同的生理小種，表明同一種屬病原菌在有性生殖過程中會(huì)突變出致病性有強(qiáng)弱差異的生理小種[38]。李星星[39]在調(diào)查貴州省小麥條銹菌生理小種時(shí)，通過分離得到的條銹菌在19個(gè)我國(guó)小麥條銹菌生理小種鑒別寄主上致病性的類型不同，鑒別出貴州小麥條銹菌存在多個(gè)生理小種。

本試驗(yàn)于接種后第4d肉眼可觀察到接種部位出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，此時(shí)，夏孢子已開始侵入鴨茅葉片，表明禾柄銹菌夏孢子在寄主植物上具有較短的潛伏期，在適宜溫濕度條件下即可萌發(fā)并侵染寄主，這與本研究中鴨茅銹菌夏孢子的生物學(xué)特性相吻合。預(yù)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，于葉片正面接種時(shí)，接種成功率僅為 30 % 且孢子潛育期較長(zhǎng)，而葉背接種第4d均可觀察到接種部位發(fā)生明顯變化，第7d開始形成裸露孢子堆，這與Zhang等4關(guān)于蠶豆單胞銹菌侵染蠶豆葉片和鄭素嬌等41研究的紅小豆銹菌夏孢子的侵染過程的報(bào)道結(jié)果基本一致，但產(chǎn)孢時(shí)間略有差異，這與病原菌類型及病原菌與寄主互作體系不同和試驗(yàn)條件有差異有關(guān)。馮東昕等[42]報(bào)道了疣頂單胞銹菌可從葉片氣孔和葉片表皮入侵寄主中，這與本研究預(yù)試驗(yàn)結(jié)論略有差異，可能是病原菌種類的不同以及寄主植物的差異造成的。張重梅等43報(bào)道了小麥條銹菌夏孢子在水稻葉片上的侵染主要通過銹菌夏孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管從氣孔伸入組織中，但大部分夏孢子芽管卻只能在氣孔附近形成膨大的附著胞、氣孔下囊、初級(jí)侵染菌絲和吸器母細(xì)胞等侵染結(jié)構(gòu)。關(guān)于禾柄銹菌在鴨茅上的侵染途徑是否與其他禾本科作物一致還有待后期進(jìn)一步研究。

3.3病原菌的生物學(xué)特性

銹菌是有性孢子（Pycniospore）、銹孢子（Aecicepore）夏孢子（Urediospore）冬孢子（Teliospore）和擔(dān)孢子（basidiospore）五種類型的全孢型大循環(huán)真菌[44]。小麥條銹菌冬孢子在 下均能萌發(fā)，其中以 萌發(fā)最佳， 條件下 大多數(shù)單孢子可萌發(fā)[45-46]。此外，冬孢子還具有較強(qiáng)的生存能力，在美國(guó)太平洋西北部地區(qū)，自然條件下冬孢子自7月份開始產(chǎn)生，可存活到翌年3月，持續(xù)時(shí)間達(dá)9個(gè)月。本試驗(yàn)針對(duì)夏孢子生物學(xué)特性開展，以明晰鴨茅銹菌夏孢子的生物學(xué)特性及生存力，為鴨茅銹病的系統(tǒng)性研究提供參考，也為銹病的綜合防治提供理論依據(jù)。

禾柄銹菌夏孢子生物學(xué)特性和夏孢子生存力的研究結(jié)果表明，禾柄銹菌菌夏孢子的萌發(fā)受環(huán)境溫度 、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光照條件的影響。在 100 % 相對(duì)濕度且有水膜附著的條件下，禾柄銹菌夏孢子在 的溫度條件下均能萌發(fā)， 時(shí)萌發(fā)速率最快，以 條件下夏孢子的萌發(fā)率最高， 時(shí)萌發(fā)率為 91 . 8 6 % ，其中 時(shí)孢子萌發(fā)速率最快；當(dāng)溫度達(dá) 以上時(shí)，孢子萌發(fā)速率隨溫度的升高而降低，芽管生長(zhǎng)速度較慢且發(fā)生扭曲變形；當(dāng)溫度達(dá) 時(shí)，夏孢子萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率僅為4 . 0 3 % ，甚至部分夏孢子不萌發(fā)，這與雒富春等47研究的首蓿銹菌夏孢子的生物學(xué)特性及殺菌劑對(duì)其室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果具有相似性。余仲東等[48]也研究過松楊柵銹菌夏孢子的生物學(xué)特性，其夏孢子受溫度的影響，萌發(fā)率規(guī)律與本研究結(jié)果一致。早期，國(guó)外也針對(duì)小麥稈銹病的病原菌夏孢子萌發(fā)溫度做過類似研究，得出小麥稈銹病上的夏孢子最適萌發(fā)溫度為 ，低溫和高溫均對(duì)孢子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，結(jié)論與本研究結(jié)果規(guī)律相似[49]。

禾柄銹菌夏孢子在 的pH值范圍內(nèi)均能萌發(fā)，最適pH為7，萌發(fā)率為 9 3 . 0 4 % ，而pH在5＼～7范圍內(nèi)萌發(fā)率普遍高于其他，表明禾柄銹菌夏孢子喜中性環(huán)境，過酸或過堿都會(huì)對(duì)孢子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制，張佳星等50研究白術(shù)枯斑病原菌生物學(xué)特性時(shí)也得到同樣的結(jié)果，表明禾柄銹菌同大部分真菌一樣喜中性的生存環(huán)境，對(duì)酸性或堿性環(huán)境較敏感。對(duì)比研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)銹菌夏孢子在酸性條件下 0的萌發(fā)率顯著高于堿性條件 ，萌發(fā)率分別為 2 8 . 7 1 % 和 2 6 . 3 4 % ，隨酸度的增加，萌發(fā)率降低幅度高于堿性條件的改變，表明未柄銹菌能耐受較強(qiáng)的酸脅迫，而對(duì)堿脅迫敏感，這與王樹和等[51研究的模擬酸雨對(duì)小麥條銹病夏孢子的萌發(fā)結(jié)果一致，在其研究結(jié)果中顯示，弱酸雨 處理下，小麥條銹菌生理小種的萌發(fā)率均未收到抑制。

不同環(huán)境物質(zhì)對(duì)禾柄銹菌夏孢子的萌發(fā)影響也有顯著性差異，其中以 0 . 1 % 的葡萄糖水效果最佳。0 . 1 % 的葡萄糖水為基質(zhì)的條件下，夏孢子 時(shí)萌發(fā)率可達(dá) 9 2 . 7 5 % ，在處理后8h內(nèi)，孢子萌發(fā)速率達(dá)89 . 1 1 % ，極顯著高于無菌水條件下的孢子萌發(fā)率；而高濃度的葡萄糖溶液下孢子的萌發(fā)率均顯著低于對(duì)照組處理，表明低濃度的葡萄糖溶液能提供孢子萌發(fā)所需要的部分C源，促進(jìn)孢子的萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)。不同濃度鴨茅榨汁處理下的萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組，且濃度越高，萌發(fā)率越低，表明鴨茅榨汁對(duì)夏孢子的萌發(fā)有一定的抑制作用，這可能是由于榨汁中含有一些抑制銹菌的氧化物、酚類物質(zhì)造成的[52]。本試驗(yàn)結(jié)果與趙志祥等[30.53]的研究結(jié)果一致。 條件下，全光照、2h光照交替和全黑暗三種光照條件處理對(duì)孢子的萌發(fā)率分別為 9 1 . 2 2 % ， 9 0 . 0 1 % 91 . 1 6 % ，差異不顯著，但在 時(shí)，全黑暗條件下的夏孢子萌發(fā)速率顯著高于全光照和2h交替光照處理下的萌發(fā)率，表明禾柄銹菌夏孢子萌發(fā)初期，黑暗條件下能促進(jìn)孢子的萌發(fā)。

夏孢子致死溫度和生存力的測(cè)定結(jié)果顯示，禾柄銹菌夏孢子在 條件下處理達(dá) 時(shí)依然具有萌發(fā)能力， 條件下處理 后孢子也依然能夠萌發(fā)， 條件下處理時(shí)間達(dá) 后，孢子已失活，喪失萌發(fā)能力，說明鴨茅銹病菌夏孢子的致死溫度為 。這與趙志祥等[30報(bào)道的南繁區(qū)玉米多堆柄銹菌夏孢子的致死溫度一致，表明同一柄銹菌屬下的銹菌夏孢子生物學(xué)特性上存在一定的相似性。

禾柄銹菌夏孢子的生物學(xué)特性與苜蓿銹菌和玉米柄銹菌等的研究結(jié)果具有相似性，但最適萌發(fā)條件略有差異，這可能是病原菌種類的不同和生活環(huán)境的差異造成的。本研究?jī)H針對(duì)四川、重慶地區(qū)鴨茅銹病病原菌種類和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，關(guān)于鴨茅禾柄銹菌在鴨茅上的侵染途徑和致病機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究明確重慶和四川地區(qū)鴨茅銹病的病原為禾柄銹菌，該病原菌在溫暖濕潤(rùn)氣候條件下生長(zhǎng)和產(chǎn)孢速度較快，炎熱干旱條件下銹病孢子的萌發(fā)收到抑制甚至死亡。銹菌隨氣流傳播，對(duì)寄主植物侵染速度較快，且會(huì)分化出不同的生理小種。根據(jù)銹菌的生理特性，生產(chǎn)上可采取有效防治措施，降低銹病對(duì)作物的損傷，深入挖掘，利用我國(guó)內(nèi)生真菌資源，開發(fā)生物防治菌劑，為我國(guó)農(nóng)牧業(yè)的健康發(fā)展提供新思路。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）