綜合生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示外源5-氨基乙酰丙酸調(diào)節(jié)‘德欽'紫花首蓿耐熱性的分子機(jī)制

Abstract： In order to reveal the molecular mechanism of exogenous 5-aminolevulinic acid（ALA） regulating Medicago satiua‘Deqin’and provide theoretical basis for heat-resistant breeding，alfalfa leaves with the same growth at for 35 days of seedling age were treated with different concentrations of ALA to screen the optimal concentration of ALA which could aleviate high temperature stress in this study. The leaves separately treated with room temperature without ALA（CK）， high temperature stress without ALA（Heat），sprayed with ALA and cultured at room temperature or under high temperature stress （ALA or HA） were determined physiological indexes and performed transcriptomic sequencing and bioinformatics analysis.The results showed that ALA improved the physiological indexes of alfalfa under high temperature stress at seedling stage，and the relief effect was the best.The differentially expressed genes（DEGs）among the samples were screened，and 27O DEGs were estimated to be potential genes related to the regulation of exogenous ALA in leaf response to high temperature stress.The results of GO and KEGG enrichment and coexpression trends of DEGs indicated that exogenous ALA mainly involved in key genes mediating two pathways，phenylpropanoid biosynthesis and phytohormone signaling，in response to high-temperature stress.This study provided a basis for the mining of heat-resistant genes in alfalfa and laid a theoretical foundation for molecular breeding in the future.

Key words：Medicago satiua； Exogenous ALA；Heat resistance；Phenylpropanoids；Plant hormone

紫花苜蓿（Medicagosatiua）素有“牧草之王\"的美譽(yù)，因其產(chǎn)量高、營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)[1-3]，具有極高的飼喂價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[4-6]。紫花苜蓿是溫帶牧草，主要在我國北方種植，南方地區(qū)也正逐步擴(kuò)大種植規(guī)模[。隨著全球氣候變暖，高溫脅迫已成為限制植物正常生長發(fā)育的主要環(huán)境因素[8]。溫度高于最佳生長條件 將引起植物熱休克或熱應(yīng)激[9]。當(dāng)溫度升高且超過紫花苜蓿適宜生長的日平均氣溫 時(shí)，尤其最高氣溫持續(xù)超過 ，紫花苜蓿則會受到高溫脅迫，顯著影響它的形態(tài)、生理和蛋白質(zhì)組學(xué)過程[10-12]。逐年升高的高溫氣候影響了紫花苜蓿的正常生長，更嚴(yán)重限制了紫花苜蓿的生產(chǎn)利用[7。因此，研究紫花苜蓿的耐熱性機(jī)制以提高其耐熱性，從而提高苜蓿生產(chǎn)力具有重要的科學(xué)意義和現(xiàn)實(shí)意義。

5-氨基乙酰丙酸對于緩解植物的逆境脅迫具有重要作用[13]，但相關(guān)機(jī)制的研究值得進(jìn)一步探討。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid，ALA）是生物界所有四吡咯化合物的共同合成前體14，在許多已知的激素、調(diào)節(jié)因子或小信號分子中，ALA被認(rèn)為是植物的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，對人類和牲畜沒有毒害作用，因此，在植物適應(yīng)非生物脅迫的研究中被廣泛應(yīng)用[15-16]。ALA可作為響應(yīng)逆境脅迫的正調(diào)控因子，從而提高植物的抗旱性和耐鹽性[17-18]。外源ALA可以誘導(dǎo)葉綠素合成，并促進(jìn)psbA和psbD的表達(dá)，提高光系統(tǒng)II反應(yīng)中心活性，從而緩解干旱脅迫對小麥（Triticumaestiuum）幼苗的傷害[19]。ALA處理通過提高垂穗披堿草（Elymusnutans）和大豆（Glycinemax）中SOD、APX、GR、CAT、血紅素加氧酶-1（HO-1）活性，從而增強(qiáng)植物的耐冷性[20-21]。在熱脅迫下，使用ALA處理可提高高羊茅（Festucaarundinacea）的光合能力，減少與抗氧化酶活性相關(guān)的氧化損傷[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下用外源ALA預(yù)處理黃瓜（Cucumissati-Uus）幼苗，可提高其葉片中的抗氧化酶活性，減少ROS的積累，進(jìn)而增強(qiáng)了幼苗的耐熱性。弱光脅迫下ALA處理可提高高羊茅對弱光脅迫的適應(yīng)能力[24]。外源ALA能提高植物的抗逆性[25]，但現(xiàn)有研究主要集中在蔬菜、瓜果、花卉等園藝作物上。但是，外源ALA在紫花苜蓿的耐熱性提升上的應(yīng)用研究報(bào)道較少。李宛宣等2研究發(fā)現(xiàn)，噴施ALA調(diào)節(jié)植物的生理過程，從而提高紫花苜蓿的抗熱性。然而，外源ALA調(diào)控紫花苜蓿耐熱性的分子機(jī)制和一些重要的高溫脅迫響應(yīng)基因尚不清楚，制約了對其耐熱高產(chǎn)的遺傳改良。

近10年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，其成本不斷下降，越來越多的研究人員對植物進(jìn)行測序并通過生物信息學(xué)分析篩選到重要的基因與信號通路，為相關(guān)的抗逆境育種工作提供了更加有效的方案[27]。李納鉀[28]在低溫弱光脅迫下使用外源ALA對煙草（Nicotianatabacum）幼苗處理，發(fā)現(xiàn)了影響谷胱甘肽代謝途徑的重要基因。本研究對紫花苜蓿苗期采用不同方式的處理，通過研究外源ALA介導(dǎo)的植株耐熱性的生理和分子機(jī)制，篩選出參與兩條途徑的重要基因，豐富紫花苜蓿的耐熱基因資源，有助于了解外源ALA介導(dǎo)紫花苜蓿中高溫脅迫耐受性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物生長條件與試驗(yàn)處理

供試材料為‘德欽'紫花苜蓿（Medicagosatiua‘Deqin'）由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畢玉芬教授贈送，當(dāng)年收獲的種子，存于 避光條件下。苜蓿種子處理?xiàng)l件及其種植方法和試驗(yàn)I處理參照前期課題組研究方法[29]。待長至 苗齡時(shí)，試驗(yàn)I篩選幼苗緩解高溫脅迫 ，晝/夜， 的最適ALA濃度。試驗(yàn)II用最適ALA濃度 ，處理設(shè)為4組，見表1，表中HA代表高溫脅迫 + ALA處理，數(shù)字 分別代表5種ALA濃度，4組處理結(jié)束后立即取樣。整個實(shí)驗(yàn)在人工智能氣候箱中進(jìn)行，每個處理重復(fù)3次，取樣時(shí)采集幼苗頂芽下第一片真葉，放置于一 冰箱保存，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.2 生理指標(biāo)的測定

根據(jù)紫花苜蓿生長表型，對每組處理中有代表性的個體進(jìn)行拍照，觀察植物葉片形態(tài)，測定植株葉片的鮮重和干重，葉綠素含量采用Wassie等11的方法稍作修改。根據(jù)制造商的說明，使用PocketPEA植物效率分析儀（Hansatech，英國）對幼苗的中上部成熟葉片進(jìn)行PSI的光化學(xué)效率（Fv/Fm）分析。相對電導(dǎo)率（Relativeconductance，REC）參照Fan等[30]的方法稍作修改，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[31]?？寡趸富钚灾械某趸锲缁福⊿uperoxidedismutase，SOD）活性和過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性分別采用氮藍(lán)四唑光化還原法和愈創(chuàng)木酚法測定[32]，過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用過氧化氫氧化法測定[3]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中的脯氨酸（Proline，Pro）、可溶性蛋白（Solubleprotein，SP）和可溶性糖（Solublesugar，SS）含量分別采用芘三酮-磺基水楊酸法、考馬斯亮藍(lán)G-250和比色法測定[33]

1.3隸屬函數(shù)值和隸屬度[29]

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：

式中： X 為紫花苜蓿植物中某一指標(biāo)的測定值， 為該指標(biāo)測定值的最小值， 為該指標(biāo)測定值的最大值；當(dāng)測定指標(biāo)與植物耐熱性呈正相關(guān)時(shí)采用公式（1），當(dāng)測定指標(biāo)與植物耐熱性呈負(fù)相關(guān)時(shí)采用公式（2）。

隸屬度

式中： 為指標(biāo)數(shù)量。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序與生物信息學(xué)分析

轉(zhuǎn)錄組RNA樣本分別從試驗(yàn)II中的CK，ALA，Heat，HA處理的葉片中提取。試驗(yàn)II中同一處理3次重復(fù)的6株紫花苜蓿幼苗的功能葉片混合為一個生物學(xué)樣品。根據(jù)制造商的程序，采用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取RNA。葉片RNA質(zhì)量檢測合格后，使用IlluminaNovaSeqTM6OOO（北京諾禾致源科技股份有限公司）進(jìn)行測序文庫構(gòu)建和測序。經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的CleanReads。

利用HISAT2軟件將CleanReads與‘中牧1號’（M.satiua‘ZhongmuNo.1'）基因組[34進(jìn)行序列比對，使用subread軟件中的featureCounts工具[35]對比對到參考基因組上的Reads進(jìn)行計(jì)數(shù)，并采用FPKM值來歸一化基因表達(dá)水平[36]，以|log2（FoldChange）|3 1 8 . FDR lt; 0 . 0 5 為篩選條件，獲得處理組間的差異表達(dá)基因（DEGs）。使用R軟件中的gplots根據(jù)FPKM表達(dá)值對DEGs進(jìn)行層次聚類。最后利用GeneOntology數(shù)據(jù)庫中找出與整個基因組背景相比，在DEGs中顯著富集的GO條目。為確定紫花苜蓿應(yīng)答高溫脅迫的代謝途徑，利用KOBAS軟件對DEGs進(jìn)行KEGGPathway富集分析。

1. 5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，從植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和苯內(nèi)烷類生物合成途徑中，共選擇12個DEGs用于qRT-PCR驗(yàn)證。將12個DEGs的cDNA序列作為模板，用NCBI在線工具Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，以MsActin為內(nèi)參基因，詳細(xì)的引物信息如表2所示。qRT-PCR定量反應(yīng)體系為

FastqPCRMix（SYBRGreen ，上下游引物各 ，cDNA模板 。反應(yīng)程序?yàn)椋? 預(yù)變性 變性 退火 ，

延伸20s，40個循環(huán)； 每s升溫0.11。DEGs的相對表達(dá)量采用 法計(jì)算[37]，并設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Exce12019計(jì)算和整理數(shù)據(jù)；用SPSS26.0對不同處理的各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析（ P lt; 0.05），用LSD和DunnettT3對各參數(shù)平均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較；用Origin2019做柱形圖和熱圖；在NovoMagic售后平臺（https：//magic.novogene.com）對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析和相關(guān)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1基于高溫脅迫下紫花苜蓿苗期ALA濃度的 篩選

為篩選紫花苜?？垢邷孛{迫的外源ALA最適濃度，對紫花苜蓿進(jìn)行不同濃度的外源ALA處理，測定各項(xiàng)指標(biāo)的變化，并觀察其表型形態(tài)（圖1）。

本研究外源ALA濃度梯度處理對高溫脅迫下苗期葉片的影響表現(xiàn)出濃度效應(yīng)。與CK相比，Heat處理使其葉片發(fā)生了枯萎失綠現(xiàn)象，而HA1～HA5處理下，葉片枯萎失綠程度則降低，HA4處理的失綠程度最?。▓D1A）。高溫脅迫抑制植株葉鮮重和葉干重，降低葉綠素含量和抗氧化酶活性，增加REC和MDA含量，而外源ALA的應(yīng)用顯著改善了這些參數(shù)。HA4的植物葉片鮮重干重、葉綠素含量、抗氧化酶活性得到提升，且顯著高于其他濃度處理，顯著降低REC和MDA含量（圖1B）。為了能夠清晰的反映不同濃度ALA處理對植株耐熱性的影響，采用隸屬函數(shù)分析所測定的8個指標(biāo)進(jìn)行了綜合排名，HA4處理的指標(biāo)隸屬函數(shù)值高于其他處理，隸屬度為0.786，排名第1，說明 ALA處理對紫花首蓿苗期高溫脅迫的緩解效果最佳，其耐熱能力也最強(qiáng)（表3）。

2.2外源ALA對紫花苜蓿幼苗耐熱性緩解作用的檢測

以 ALA為處理?xiàng)l件，對幼苗進(jìn)行不同處理，測定高溫脅迫下植株苗期各耐熱性生理指標(biāo)，并觀察在高溫脅迫下外源ALA對植株的影響（圖2）。Heat下幼苗的REC和MDA含量分別增加了 1 5 2 . 8 3 % 和 1 4 8 . 7 6 % ，而HA處理顯著降低了高溫脅迫下的電解質(zhì)泄露和MDA含量 ，但與CK植株相比差異不顯著。與CK植株相比Heat處理導(dǎo)致苗期葉片的 顯著降低了 8 . 6 4 % ，HA處理的 有所緩解，但差異不顯著。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可作為高溫脅迫緩解的指標(biāo)，Heat處理葉片的Pro和SP含量均顯著降低（ ，SS含量略微升高，而HA處理下葉片的 ，SP和SS含量均顯著增加 ，但與CK植物相比差異不顯著。

植物會涉及復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，為應(yīng)對非生物脅迫引發(fā)的氧化損傷，包括一些功能相關(guān)的抗氧化酶。Heat處理下的CAT，SOD，POD活性分別降低了 3 8 . 8 0 % ， 23 . 0 0 % 和 3 5 . 4 8 % ，而HA處理的幼苗中CAT，SOD，POD活性顯著增加 ，但與CK植株差異不顯著。噴施外源ALA后施加高溫脅迫的紫花苜蓿各生理指標(biāo)有著顯著變化，則外源ALA可提高其耐熱性。

2.3測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

進(jìn)一步解析外源ALA調(diào)控高溫脅迫下植株苗期耐熱性的分子機(jī)制，使用IlluminaNovaSeqTM6000測序平臺對4組樣品進(jìn)行了葉片的轉(zhuǎn)錄組測序。對測序數(shù)據(jù)相關(guān)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各樣品的GC含量均大于 40 % ，并經(jīng)過測序質(zhì)量控制后，共得到

25.69GbCleandata，堿基Q3O的百分比在9 3 . 7 9 % ～ 9 4 . 4 2 % 之間。以紫花苜蓿中牧1號基因組作為參考，將Cleanreads與其序列進(jìn)行比對，各樣品的比對率均大于 7 5 % （表4）。根據(jù)RNA-seq的基因表達(dá)值用FPKM對測序深度和基因長度進(jìn)行了校正和組內(nèi)及組間樣品的相關(guān)性分析，所有樣品中基因表達(dá)量的FPKM值表達(dá)趨勢一致，呈正態(tài)分布，樣品組內(nèi)相關(guān)性大于組間相關(guān)性，樣品組間有差異（圖3），表明測序質(zhì)量較好，所選參考基因組的組裝結(jié)果可靠，能滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.4不同處理下差異表達(dá)基因的鑒定

對不同處理下葉片的DEGs進(jìn)行兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)，在‘ALAvsCK，HeatvsCK，HAvsCK，HAvsHeat'4個比較組中，檢測到總的基因中DEGs分別有4802（2112上調(diào)，2690下調(diào)），6749（3139上調(diào)，3610下調(diào)），6063（2779上調(diào)，3284下調(diào)）和4599（2557上調(diào)，2342下調(diào)）（圖4A）。韋恩圖可以較為直觀地看出各處理比較組DEGs的數(shù)量，4個比較組中特有的DEGs個數(shù)分別為1699，1429，1261和868個，有270個DEGs是不同處理下所共有的（圖4B），推測這些共有的DEGs是外源ALA調(diào)控‘德欽'紫花苜蓿葉片響應(yīng)高溫脅迫的潛在相關(guān)基因。

2.5高溫響應(yīng)核心DEGs的GO和KEGG富集 分析

將共有的270個DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集結(jié)果（圖5A）表明：不同ALA預(yù)處理后植株高溫脅迫共有的葉片DEGs主要富集到生物刺激反應(yīng)（Responsetobioticstimulus）、防御反應(yīng)（Defenseresponse）、黃素單核苷酸結(jié)合（FMN-binding）、蛋白異源二聚體活（Proteinheterodimerizationactivity）、氧化還原酶活性（Oxidoreductaseactivity）相關(guān)的條目，以上富集較多的過程中涉及的DEGs可能參與了外源ALA調(diào)控紫花苜蓿高溫脅迫過程。KEGG富集結(jié)果（圖5B）表明：共有的270個DEGs涉及的代謝通路中，類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis， ）、苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis， ）、植物晝夜節(jié)律（Circadian rhythm-plant，koO4712）、亞油酸代謝（Linoleicacid metabolism，koOO591）和谷胱甘肽代謝（Glutathionemetabolism， 富集程度最高。其中，類黃酮和苯丙烷類生物合成與植物抵抗逆境脅迫的抗氧化酶活性物質(zhì)如POD活性相關(guān)，植物晝夜節(jié)律與植物的光合作用有關(guān)，亞油酸代謝與植物抗旱相關(guān)，谷胱甘肽代謝也是植物體內(nèi)很好的自由基清除劑和抗氧化劑。結(jié)果表明，注釋到這些代謝通路上的基因可能均由外源ALA調(diào)控誘導(dǎo)而發(fā)生差異，與‘德欽'紫花苜蓿耐熱相關(guān)。

2.64個比較組中所有DEGs的共表達(dá)趨勢分析

為更深入地了解外源ALA處理對紫花苜蓿高溫脅迫的影響，將4個比較組中所有的11370個DEGs使用主流層次的聚類分析，通過基因FPKM值將其分為4個基因聚類表達(dá)模式，并將4個聚類結(jié)果進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖6）。結(jié)果顯示，4個不同處理下的DEGs在聚類表達(dá)模式1和2中有兩個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，分別在ALA和Heat處理點(diǎn)中上調(diào)或下調(diào)；在聚類表達(dá)模式3中DEGs平均變化模式呈直線水平趨勢，在4組處理上穩(wěn)定波動；在聚類表達(dá)模式4中，4組處理的DEGs呈直線上升趨勢且在HA處理點(diǎn)上達(dá)到峰值。

（A） （B） microtubul Lysine biosynthesis DNA binding transcr 氨酸生物合成 sequence- 列 Vitamin B6 motabolism 維生素B6新陳代謝 proteinser Brassinosteroid biosynthesis 蕓苔素類固醇生物合成 xire Fatty acid degradation * 脂肪酸降解 加氧麗活性 Protein processing in endoplasmic reticulum O

uodiosea xidreduct 小 . ： 0 8 H 100 moveentll 0.00 alphaLinolencad酸代 0.00 protein-DNAcoe n Sunitc olex . Gut新代 -亞麻酸代謝 小體 . Linoleic acid metabolism chromatin ·亞油酸新陳代謝 nucleosor 核小體組裝 ·Crcadlan carb 前 Phenylpropanodosynss 固碳作用 responsetob物激反應(yīng) defense r 都H . . Fa 苯丙類生物合成 0.02 0.04 0.06 0.08 0.05 0.10 0.15 GeneRatio GeneRatio 基因比例 基因比例

本研究重點(diǎn)分析聚類表達(dá)模式1和2，兩種表達(dá)模式中的外源ALA能誘導(dǎo)高溫脅迫下植株葉片的次生代謝物，KEGG富集通路主要為異喹啉生物堿的生物合成（ko00950）、苯丙烷類生物合成 ）類黃酮生物合成（ko00941）、酪氨酸代謝（ko00350）、光合作用天線蛋白（ko00196）、植物MAPK信號通路（ko04016）以及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（ko04075）（圖6B）。因此，4組處理共有的DEGs功能分類的結(jié)果與所有的DEGs共表達(dá)聚類富集分析的結(jié)果類似，以上途徑為進(jìn)一步挖掘‘德欽'紫花苜蓿耐熱基因提供了新的思路。

2.7苯丙烷類生物合成的關(guān)鍵基因表達(dá)譜分析

從共聚類表達(dá)模式1得知，HA處理誘導(dǎo)了葉片中苯丙烷類生物合成途徑，進(jìn)一步分析了不同處理?xiàng)l件下DEGs在這條途徑中的表達(dá)（圖7）。苯丙烷類生物合成途徑中8個家族的34個DEGs存在顯著差異，包括編碼 β -葡萄糖苷酶（ β -GLU）、苯丙氨酸解氨酶 （ P A L ）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A（4CL）羥基-肉桂酰輔酶A莽草/荃寧酸酯轉(zhuǎn)移酶（HCT）、咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）、咖啡酰輔酶A-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）過氧化物酶（ P O D ）的基因。在‘Heat/CK'中上游的5個P A L 基因顯著上調(diào)表達(dá)，但大部分 β -GLU基因下調(diào)表達(dá)，并且 H C T 基因顯著下調(diào)，導(dǎo)致下游的10個P O D 基因也顯著下調(diào)；與之相反的是‘HA/Heat'上游的6個 P A L 和3個 β -GLU基因顯著下調(diào)表達(dá)，但H C T 基因顯著上調(diào)，導(dǎo)致下游的3個 P O D 基因顯著上調(diào)表達(dá)。由此結(jié)果推測外源ALA可以誘導(dǎo)‘德欽'紫花苜蓿葉片在高溫脅迫下促進(jìn)苯丙烷類生物合成途徑的中間產(chǎn)物 H C T 基因的表達(dá)來增加POD活性以提高其耐熱性。

2.8植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)譜分析

共表達(dá)聚類模式2及功能富集分析中，HA刺激了葉片中的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖8）。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，不同比較組除赤霉素以外的7大類激素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的59個DEGs存在顯著差異。生長素、脫落酸、乙烯和茉莉酸通路中，4個比較組均存在顯著性DEGs較多，推測HA處理調(diào)控這4種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來響應(yīng)高溫脅迫的可能性更高。

在‘Heat/CK'下，與IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的負(fù)調(diào)控因子 （ A U X / I A A 絕大部分顯著下調(diào)，具有吲哚乙酸氨基酸化合成酶功能的（ G H 3 顯著上調(diào)，編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白的（SAUR）上下調(diào)都有，但‘HA/Heat'下的DEGs情況卻相反（圖8A），說明高溫脅迫下的外源ALA誘導(dǎo)的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到負(fù)調(diào)控作用的基因轉(zhuǎn)錄更活躍，使生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度在高溫期間有所降低，可能存在某種反向保護(hù)機(jī)制。在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中 S n R K 2 ， P P 2 C 以及ABA受體 P Y L 基因的表達(dá)在‘Heat/CK'下呈下降趨勢，暗示葉片生長過程中與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄受到明顯抑制，而‘HA/Heat'可促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)（圖8C）。ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子EIN4基因（MsG0780041690.01）以及下游的正調(diào)控器EIN3基因（MsG0380015861.01）均下調(diào)，暗示外源ALA使高溫脅迫下的葉片對ET敏感性有所降低（圖8F）。JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)DEGs整體表達(dá)趨勢與ET類似（圖9G）。

其他植物激素中，4個與SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因在‘Heat/CK'下均顯著下調(diào)，而‘HA/Heat'與‘Heat/CK'相比顯著上調(diào)，表明外源ALA在整個高溫脅迫過程中可能起促進(jìn)作用（圖8B）。與之不同的是3個與BR信號途徑相關(guān)基因表達(dá)在‘Heat/CK'下整體呈上升趨勢，而在‘HA/Heat'后與‘Heat/CK'相比顯著下調(diào)（圖8D）。4個與CTK信號途徑相關(guān)基因，在‘Heat/CK'下上下調(diào)各一半，而在‘HA/Heat'后與‘Heat/CK'相比4個基因均顯著上調(diào)（圖8E）。

2.9qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

由于RNA-seq具有一定的缺陷，可能會得到假陽性的結(jié)果，為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，從植物激素信號途徑和苯丙烷類生物合成途徑中，各隨機(jī)選取了6個DEGs用于qRT-PCR驗(yàn)證（圖9）。

（MsG0580028603.01）、COMT （MsG0580030145.01）、PAL（MsG8780040944.01）（圖9A）；植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中5個上調(diào)基因?yàn)?A U X / I A A （MsG0180004272.01、MsG0380015754.01、MsG0480021367.01）、MsG0480021366.01和 A R R - B （ M s G0780040418.01），1個下調(diào)基因?yàn)?P Y L （ M s G 0 480018569.01（圖9B），所有基因表達(dá)的差異趨勢與RNA-seq數(shù)據(jù)高度一致，這證實(shí)了本研究的DEGs是可信的。

3討論

外源ALA在農(nóng)林生產(chǎn)上具有廣闊用途，可調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[38]，從而提高植物的抗逆性。如 的ALA有利于紫花苜蓿生長，提高植株的耐熱性[26] 可以增強(qiáng)辣椒（Capsicumannum）幼苗的耐熱性[39]； 處理可有效減輕高溫脅迫對裸燕麥（Avenanuda）的傷害[40]； 的5-ALA緩解芍藥（Paeonia lac-tiflora）夏季高溫脅迫，且改善其觀賞品質(zhì)效果最佳[41]。不同植物間的反應(yīng)有所差異，而外源ALA能明顯提高植物的抗熱性。本研究的表型和生理指標(biāo)結(jié)果表明， 的外源ALA可減輕 高溫脅迫下苜蓿的生長抑制，有效緩解高溫脅迫對其傷害，增強(qiáng)‘德欽'紫花苜蓿對高溫脅迫的適應(yīng)能力，這與張鶴等[29]的研究結(jié)論一致。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在苜蓿屬中廣泛用于鑒定重要性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因，例如篩選疾病應(yīng)答基因[42]，響應(yīng)鋁脅迫基因[43]，篩選鹽脅迫相關(guān)候選基因[44-45]。轉(zhuǎn)錄組的趨勢分析可用來挖掘具有相同表達(dá)模式的基因，其實(shí)質(zhì)是對表達(dá)趨勢相同的基因進(jìn)行歸類。李博等[46]對金花茶（Camellianitidissima）花瓣轉(zhuǎn)錄組分析，利用趨勢分析對花瓣發(fā)育調(diào)控進(jìn)行基因挖掘。徐俊等[47]對菊花（Chrysanthemum）根狀莖的基因表達(dá)模式的Cluster分析，篩選出根狀莖發(fā)育的關(guān)鍵基因。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?個比較組鑒定出的270個共有DEGs功能分類以及全部DEGs的共表達(dá)趨勢分析，發(fā)現(xiàn)外源ALA處理后紫花苜蓿葉片經(jīng)高溫脅迫的DEGs顯著富集到苯丙烷類生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

苯丙烷類生物代謝途徑是植物次生代謝產(chǎn)物的主要合成方式之一，起始反應(yīng)由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶催化，進(jìn)而產(chǎn)生木質(zhì)素和類黃酮兩類最主要的分支代謝產(chǎn)物[48]。目前苯丙烷類生物代謝研究中，高溫可促使水稻（OryzasatiuaL.）穎花苯丙烷類代謝關(guān)鍵酶活性，從而增強(qiáng)其耐熱性[48-49]。高溫脅迫下‘德欽'紫花苜蓿根中苯丙烷代謝途徑富集顯著，從而應(yīng)對熱脅迫[50]。本研究發(fā)現(xiàn)苯丙烷類生物合成途徑富集顯著，促進(jìn)蔗糖分解成葡萄糖的3個 β -GLU下調(diào)表達(dá)，說明HA處理下首蓿葉片生長發(fā)育不消耗多余能量，Heat下葉片耗能降低。外源ALA誘導(dǎo)高溫下葉片積累更多的蔗糖含量，最終導(dǎo)致葉片可溶性糖含量也相應(yīng)增加，進(jìn)而提高植株苗期耐熱性，這與本研究的生理結(jié)果表現(xiàn)一致。與CK相比，Heat下苯丙烷類生物合成途徑大部分關(guān)鍵基因顯著下調(diào)，尤其是 P O D ，催化苯丙醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素類。但與之相比，HA處理下的中間產(chǎn)物 H C T 顯著上調(diào)，使得下游的大部分 P O D 基因下降趨勢得到緩解，導(dǎo)致POD活性得到提高，這一研究結(jié)果與趙穎[5]研究相反，原因可能是外源ALA處理可誘導(dǎo)高溫脅迫下首蓿葉片HCT基因的表達(dá)從而提高POD活性。

植物內(nèi)源性激素是植物防御反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑之一，在幫助植物適應(yīng)不利環(huán)境方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[52-53]。生長素在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，可控制植物對脅迫的生長反應(yīng)[54]。脫落酸是一種脅迫激素，它充當(dāng)介導(dǎo)植物對脅迫反應(yīng)的重要內(nèi)部信號，并且脅迫會誘導(dǎo)ABA的合成[55]。本研究的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中大部分DEGs與IAA和ABA信號通路有關(guān)，這與趙雁等[56]研究結(jié)果相似。IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)第一步是生長素受體與AUX/IAA的相互作用，從而導(dǎo)致AUX/IAA降解[57]。本研究結(jié)果表明Heat下AUX/IAA蛋白編碼的DEGs S A U R 和IAA顯著下調(diào)，而HA下S A U R 和 I A A 顯著上調(diào)。在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，PYR/PYL受體能間接調(diào)控SnRK2的活性[58]。當(dāng)ABA與PYR/PYL受體結(jié)合后能觸發(fā)受體的構(gòu)象變化，從而使受體-ABA復(fù)合物與 P P 2 C 結(jié)合并抑制其活性[59]。本研究發(fā)現(xiàn)7個ABA受體 P Y L 的表達(dá)在Heat下顯著受到抑制，唯一的DEGsSnRK2和2個 P P 2 C 也在Heat的表達(dá)顯著下調(diào)，表明葉片在高溫脅迫過程中ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，ABA對植物氣孔調(diào)節(jié)機(jī)制的抑制作用顯著降低，而HA中大部分 P Y L 也顯著下調(diào)且下調(diào)倍數(shù)高于Heat下的倍數(shù)。高溫脅迫下，外源ALA預(yù)處理可上調(diào) S A U R 和 I A A 表達(dá)，同時(shí)下調(diào) P Y L ，這意味著外源ALA通過調(diào)控 和 P Y L 這些基因在高溫脅迫下的表達(dá)來提高‘德欽'紫花苜蓿的耐受性。

4結(jié)論

本研究綜合了生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究外源ALA調(diào)節(jié)‘德欽'紫花苜蓿對高溫脅迫的響應(yīng)變化，發(fā)現(xiàn) 的外源ALA緩解苜蓿高溫脅迫效果最佳。在響應(yīng)高溫脅迫的過程中，4個比較組的差異表達(dá)基因主要被富集到苯丙烷類生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路。經(jīng)qPT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證兩條通路中隨機(jī)挑選的12個基因符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，外源ALA通過調(diào)控兩條通路的 H C T ， S A U R ，I A A ， P Y L 等核心基因來提高‘德欽'紫花苜蓿耐熱能力。生理特性研究和轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的關(guān)鍵基因及代謝通路，將為調(diào)控紫花苜蓿耐熱性機(jī)理研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為外源ALA在紫花苜蓿耐高溫生產(chǎn)中的應(yīng)用和耐熱育種等方面提供參考。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）