柱花草響應炭疽菌和低磷脅迫的LysM-RLKs成員鑒定及表達模式分析

Abstract：To identify the members of the LysM-RLKs family of Stylosanthes guianensis （Stylo） in response to Coletotrichum gloeosporioides and low phosphorus stress，we used transcriptomedata inoculated with Colletot richum gloeosporioides and treated with low phosphorus to identify and name LysM-RLKs family members， and predict their subcellular location and protein sequence by bioinformatics methods. The specificity of tissue expression and the expression pattrns in response to chitin，anthrax and low phosphorus treatment were analyzed through the related tests of Stylosanthes plants.The results showed that 1l genes，members of LysMRLKs family，were characterized by using the corresponding transcriptome data， namely S g L Y K I ， S g L Y K 2 a S g L Y K 2 b ， S g L Y K 3 a ， S g L Y K 3 b ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 4 b ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 and S g N F R 5 ： The prediction of protein localization showed that most of LysM-RLK proteins were localized on the plasma membrane，contained typical extracellular LysM domains，transmembrane domains and intracellular kinase domains.The prediction of protein structure showed that alpha helix and random coil were the major secondary structure of the proteins，and the LysM-RLK proteins were diferent in terms of the three-dimensional structure.The gene expression pattern analysis showed that all the identified LysM-RLKs members had tissue-specific expression pattern. The S g L Y K I ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 and S g L Y K 8 may play important roles in responding to C ：gloeosporioides infection and chitin-induced immune responses，while S g L Y K 3 a may be involved in the responses to low phosphorus stress.This study could provide candidate genes for the breeding of anthracnose- and low phosphorus-resistant cultivars of stylo.

Key words： Stylosanthes guianensis； LysM-RLK family； Anthracnose； Low phosphorus stress； Expression patterns

植物模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）主要有兩類蛋白：類受體樣激酶（Receptor-likekinases，RLKs）和類受體蛋白（Receptor-likeproteins，RLPs）。其中RLKs由胞外結構域、跨膜結構域和激酶結構域組成。常見的胞外結構域有富含亮氨酸重復序列（Leucine-richrepeats，LRR）溶菌素基序（Lysinmotifs，LysMs）和凝集素型基序（Lectin-typemotifs）[1]。胞外結構域是LysMs的RLKs，含有許多參與識別病原菌侵染和進行免疫防御信號傳導的防御蛋白，這些蛋白主要通過感知幾丁質（Chitin）以誘導植物的免疫反應[2]。幾丁質是一種保守的病原體相關分子模式（Pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP），是真菌細胞壁的主要成分[3]。最早被鑒定到能感知幾丁質誘導免疫反應的LysM-RLKs是擬南芥（Arabidopsisthaliana）中的CERK1 （Chitin elicitor receptor kinase 。

LysM-RLKs基因家族在植物感知病原侵入方面起到關鍵作用[1]。通過生物信息學分析和多組學測序技術，目前許多植物的LysM-RLKs家族成員已被鑒定出來，例如在擬南芥、百脈根（Lotusjaponicus）大豆（Glycinemax）中分別鑒定到5個、20個和27個LysM-RLKs成員[5-7]。研究表明，LysM-RLKs在幾丁質觸發(fā)的免疫反應中起著保守和核心作用，同時在介導叢枝菌根（AM）共生中起到重要作用[1]。例如，在水稻（Oryza satioa）中，OsCERK1與OsMYR1/LYK2形成復合體，OsLYK2與短鏈殼寡糖（CO4）結合，介導AM共生8；在百脈根中，LjCERK6是幾丁質識別受體；在蒺藜苜蓿（Medi-cagotruncatula）中，MtLYK9/CERK1在免疫和共生中發(fā)揮雙重作用[9]。

柱花草（Stylosanthesguianensis，Stylo）是重要的熱帶豆科植物，它不僅是重要的熱帶牧草[10]，而且可在恢復退化土地[1、根系固氮12和保護生態(tài)環(huán)境13中發(fā)揮重要作用。由膠孢炭疽菌（Colletotri-chumgloeosporioides）引起的柱花草炭疽?。⊿tyloanthracnose）是柱花草的主要病害[14-15]。利用抗病基因培育抗病品種是防控柱花草炭疽病的重要方法[16]。目前，已知的柱花草抗炭疽病基因很少，亟需發(fā)掘用于柱花草抗病育種的相關基因。另外，柱花草有很好的低磷耐受性[17]，發(fā)掘其抗低磷脅迫基因對培育新品種具有重要應用價值。

LysM-RLKs在植物免疫和共生中具有重要作用，但在柱花草中尚未得鑒定和研究。本文利用柱花草接種炭疽菌和低磷處理轉錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法鑒定和命名柱花草的LysM-RLKs家族成員，并進行幾丁質處理、接種炭疽菌以及低磷處理的表達模式分析。研究成果可為柱花草LysM-RLKs基因家族的功能研究和柱花草抗逆品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1. 1 植物材料

試驗使用的植物材料是‘熱研5號'柱花草（ losanthesguianensis‘ReyanNo.5'），其種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究中心提供。柱花草種子在熱水（ 中浸泡3分鐘后，在黑暗條件下發(fā)芽 。一批幼苗移栽到裝有蛭石和營養(yǎng)土 的育苗盒中，在溫室大棚中生長30d后，分別進行組織采集、接種炭疽菌[18]；另一批幼苗在改良的Magnavaca營養(yǎng)液中水培14d[19]后，進行磷處理。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 柱花草LysM-RLKs家族成員的鑒定利用保存于NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的柱花草接種炭疽菌[20]和磷處理[21]轉錄組數(shù)據(jù)，其中接種炭疽菌轉錄組數(shù)據(jù)編號為SUB8868028，磷處理轉錄組數(shù)據(jù)編號為PRJNA660932，使用TBtools的“BatchTranslateCDStoProtein\"工具將編碼序列（Codingsequence，CDS）翻譯成蛋白質序列。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載LysM結構域（PF01476）和Pkinase結構域（PFOOO69）的隱馬爾可夫模型（HMM），使用TBtools的“SimpleHMMSearch\"工具初步篩選出柱花草LysM-RLKs家族成員，然后通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站進行結構域驗證，去掉不含有LysM和Pkinase結構域的序列，最后將上述兩種方法獲得的家族成員用BioEdit軟件進行BLAST比對，去除重復序列，從而獲得最終的柱花草LysM-RLKs家族成員。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育分析在擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/browse/gene_family）下載擬南芥的LysM-RLKs基因家族成員，在Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome-next. jgi.doe.gov/）下載大豆和百脈根的基因家族成員。通過MAFFT軟件將擬南芥（At）、大豆（Gm）、百脈根（Lj）、柱花草（Sg）的LysM-RLKs基因家族成員進行多序列比對，默認參數(shù)。使用MEGA11軟件選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建進化樹，設置Boot-strap值為1000來檢測進化樹的可靠性，選擇pdistance和pairwisedeletion，其他為默認值。使用ITOL網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）進行進化樹美化。

1.2.3理化性質及亞細胞定位預測分析使用WoLFPSORT網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc. jp/）預測亞細胞定位。使用ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質的長度、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)和親水性。

1.2.4保守基序（Motif）和結構域（Domain）分析利用保守基序在線預測工具MEME（https：//meme-suite.org/meme）對SgLysM-RLKs蛋白序列進行預測，保守基序數(shù)設置為10，其他參數(shù)設置為默認。使用TBtools的“BatchSMART\"工具預測SgLysM-RLKs蛋白的保守結構域，以及進行可視化。1.2.5蛋白質二、三級結構預測在SPOMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page °eq /NPSA/npsa_sopma_f.html）預測蛋白質二級結構占比情況。在ALPHA-FOLD2網(wǎng)站（https：//colab.research. google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb）預測蛋白3D結構，使用PyMOL軟件進行可視化。

1.3SgLysM-RLKs家族成員響應炭疽菌及低磷脅迫的轉錄組學分析

使用前面提到的兩組柱花草轉錄組數(shù)據(jù)，以 （FPKM + 0 . 1 ） 值表述SgLysM-RLKs基因在炭疽菌侵染以及低磷處理條件下的表達模式，使用TBtools的\"HeatMap\"工具制作熱圖。

1.4SgLysM-RLKs家族成員的表達模式分析

1.4.1組織特異性表達模式分析采集4周齡柱花草植株的根、葉、莖組織，檢測SgLysM-RLK家族成員組織特異性的表達水平，設置3個生物學重復。1.4.2幾丁質處理根據(jù)高靜等22]的方法進行柱花草無菌苗的培育。柱花草生長20d左右時，使用 幾丁質噴灑在柱花草葉片上，分別在噴灑后 0 ， 0 . 2 5 ， 0 . 5 ， 1 ， 2 ， 4 和6h收集柱花草的葉片，每個時間點3個生物學重復。

1.4.3炭疽菌處理使用課題組保存的膠孢炭疽菌菌株WC-O2和DZ-19[23]，其中WC-02為弱致病菌，DZ-19為強致病菌。炭疽菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上生長7d后，轉移到CM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3d，用雙層紗布過濾菌絲，收集孢子，并用無菌水稀釋至每毫升 個分生孢子；用含有 0 . 0 2 % sil-weetL-77的孢子懸浮液噴霧接種柱花草，在0，0.5，1，4，8，12和 收集柱花草的葉片，每個時間點3個生物學重復。

1.4.4低磷處理正常水培柱花草14d，挑選長勢良好、均一的植株分別在缺磷（LP， ）以及正常磷供給（HP，300 的改良Magnavaca營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換1次營養(yǎng)液，10d后分別收取地上部和根部樣品，設置3個生物學重復。

1.4.5LysM-RLKs家族成員的表達模式分析所有材料均通過液氮速凍收集，并儲存在一 下直

至提取RNA。

使用TRNzolUniversalTotalRNA提取試劑盒（TIANGEN，貨號DP424）提取植物中的總RNA，使用HiScriptIII RT SuperMix forqPCR（Vazyme，貨號R323）試劑盒反轉為cDNA，使用ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix（ToloBio，貨號22204）試劑進行實時定量聚合酶鏈式反應（Real-TimeQuantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR），以 作為內(nèi)部參考基因[24]，表達水平通過 方法確定。

引物使用primer5軟件設計，使用NCBI網(wǎng)站的“Primer-BLAST\"工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）檢測引物特異性，所有引物如表1所示。

使用Excel和GraphPadPrism軟件進行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結果與分析

2.1SgLysM-RLKs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析與命名

通過分析柱花草轉錄組數(shù)據(jù)[20-21]，共鑒定到11個SgLysM-RLKs家族成員，其中在接種炭疽菌的轉錄組中鑒定到5個成員，在低磷處理的轉錄組中鑒定到了11個成員（其中5個與接種炭疽菌轉錄組重復）。這表明，SgLysM-RLKs在柱花草中產(chǎn)生了功能分化，不僅有抵抗病原菌的作用，而且還進化出了應對低磷脅迫的作用。

通過對比柱花草近緣物種大豆GmLysM-RLK家族基因序列，在鑒定到的11個成員中，發(fā)現(xiàn)7條

SgLysM-RLKs具有完整的開放閱讀框（Openread-ingframe，ORF），而Unigene29792（SgLYK2a），Unigene43983（SgLYK2b），Unigenel5056（SgLYK3b）和Unigene20089（SgLYK7）這4條無完整ORF序列。因此使用快速擴增cDNA末端聚合酶鏈式反應（Rapid Amplification of cDNA Ends PolymeraseChainReaction，RACE-PCR）試劑盒（Accurate，貨號AG11618）進行 試驗，獲得其全長ORF序列。將獲取到Unigene29792（SgLYK2a），Unigene43983（SgLYK2b），Unigene15056（SgLYK3b）和Unigene20089（SgLYK7）的全長ORF序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中，GenBank登錄號為PV098358至PV098361。

由于SgLysM-RLKs尚未命名，因此利用柱花草、擬南芥、大豆和百脈根LysM-RLKs之間的進化關系進行命名。

采用鄰接法構建上述4種植物共63個LysM-RLKs進化樹，其系統(tǒng)發(fā)育分析表明，柱花草、擬南芥、大豆和百脈根的LysM-RLKs家族成員被分為7個亞組（圖1）。其中：亞組V只有大豆；亞組Ⅲ、Ⅳ有柱花草、大豆和百脈根，沒有擬南芥；其它4個亞組中4種植物均有LysM-RLKs家族成員分布。根據(jù)11個SgLysM-RLKs與GmLysM-RLKs的進化關系，進行一致的命名，如表2所示。

2.2SgLysM-RLKs家族成員的理化性質分析及亞細胞定位預測

如表2所示，柱花草轉錄組SgLysM-RLK家族成員的理化性質表明，其氨基酸數(shù)量為 個，相對分子質量為 ，理論等電點為 ；約81. 82 % 的成員為酸性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)范圍為 ，僅SgLYKl，SgLYK5和SgLYK3b的不穩(wěn)定系數(shù)小于4O，為較穩(wěn)定的蛋白質，其余蛋白質（8個成員，占比 7 2 . 7 3 % 穩(wěn)定性較差；總平均親水性指數(shù)范圍為 僅 數(shù)值為正值，屬于疏水蛋白，其余的均為負值，屬于親水蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，9個成員定位于膜上，1個成員定位于葉綠體，1個成員定位于細胞質。

2.3SgLysM-RLKs家族成員的保守基序和結構域分析

利用MEME在SgLysM-RLKs中共搜索10個保守基序（表3），結果（圖2）表明：SgLysM-RLKs保守基序的分布相似，motif1，motif3，motif4，motif5，motif7，motif8和motif10在所有成員中均存在，保守程度較高，其中motif1的保守性得分最高；SgNFR5中不存在motif2，SgLYK2a中不存在motif6和motif9，SgLYK3a和SgLYK3b中均不存在motif9，其中SgLYK2a的motif數(shù)量最少，僅8個。

結構域分析共鑒定出7種保守結構域，如圖3所示，所有SgLysM-RLKs都含有典型的胞外LysM結構域、跨膜結構域和胞內(nèi)激酶結構域；定位在質膜的成員均含有信號肽，而定位在葉綠體和細胞質的成員則沒有信號肽。

2.4SgLysM-RLKs家族成員的蛋白質二、三級結構預測

蛋白二級結構分析結果如表4所示：SgLysM-RLKs蛋白的二級結構均含有 α 螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈形式，其中 α 螺旋的占比為 3 3 . 1 4 % ～ 40 . 6 % ， β 折疊的占比為 2 . 9 9 % ～ 9 . 0 2 % ，無規(guī)卷曲的占比為 3 5 . 8 0 % ～ 4 7 . 7 2 % ，延伸鏈的占比為

1 4 . 1 7 % ～ 1 9 . 2 5 % 。因此，SgLysM-RLKs的二級結構以 α 螺旋和無規(guī)卷曲為主，延伸鏈為輔。

為了觀察蛋白空間結構的變化，使用AlphaFold2對SgLysM-RLKs蛋白的三級結構進行預測（圖4），結果顯示：所有成員的LysM結構域均存在 α 螺旋和β折疊結構，跨膜結構均為 α 螺旋結構，激酶結構域均存在 α 螺旋和β折疊結構。

2.5SgLysM-RLKs家族成員響應炭疽菌及低磷脅迫的轉錄組學分析

SgLysM-RLKs家族成員在響應炭疽菌及低磷脅迫處理下的轉錄組學分析結果如圖5所示。

由圖5A可知，在接種炭疽菌的處理下，S g L Y K I ， S g L Y K 3 a 和 S g L Y K 8 基因在 時表達量顯著下調(diào)， S g L Y K 4 a 基因的表達量在各個時間點無顯著差異， S g L Y K 5 基因在 時表達量顯著上調(diào)， 則顯著下調(diào)。

由圖5B和圖5C可見，在磷處理18d后，SgLysM-RLKs家族成員在根中均無顯著差異，在葉片中， S g L Y K 4 a 顯著下調(diào)， S g L Y K 4 b 顯著上調(diào)，剩余的9個成員在葉片中均無顯著差異。

2.6SgLysM-RLKs家族成員的組織特異性表達分析

SgLysM-RLKs家族成員在根、莖、葉組織的表達模式如圖6所示，SgLysM-RLKs家族成員在3種組織中均有表達， S g L Y K 4 b ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 主要在根中表達，其中 S g L Y K 2 b ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 7 在莖中的表達量也相對較高，表明它們可能主要在根或莖中發(fā)揮功能； S g L Y K 2 a ， S g L Y K 3 a ， S g L Y K 3 b ， S g L Y K 8 S g N F R 5 主要在莖中表達，其中 S g L Y K 3 a 在葉中的表達量也相對較高，表明它們可能主要在莖或葉中發(fā)揮功能。

2.7SgLysM-RLKs家族成員響應不同生物脅迫的表達模式分析

柱花草葉片SgLysM-RLKs響應幾丁質處理的表達模式分析結果如圖7所示。幾丁質處理后，S g L Y K I ， S g L Y K 2 a ， S g L Y K 3 a ， S g L Y K 3 b ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 和 S g N F R 5 的表達量隨處理后時間的延長顯著上調(diào)（與 相比）；S g L Y K 2 b 的表達量先顯著下調(diào)后上調(diào)；而 S g L Y K 4 b 在任何時間點的表達量與 相比均無顯著差異。

柱花草葉片SgLysM-RLKs響應炭疽菌DZ-19接種的表達模式分析結果如圖8所示。與 相比，S g L Y K 4 a ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 的表達量隨處理后時間的延長顯著上調(diào)； S g L Y K I 的表達量先顯著上調(diào)后下調(diào)； S g L Y K 3 b 的表達量先顯著下調(diào)后上調(diào)； S g L Y K 2 b ， S g L Y K 4 b ， S g L Y K 3 a ， S g N F R 5 的表達量顯著下調(diào)；而 S g L Y K 2 a （圖中未列出）在處理后不表達。

柱花草葉片SgLysM-RLKs響應炭疽菌WC-02接種的表達模式分析結果如圖9所示。與 相比，S g L Y K 1 ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 的表達隨處理后時間的延長顯著上調(diào)； S g L Y K 3 a SgLYK3b的表達量先顯著上調(diào)后下調(diào)； S g L Y K 2 b SgLYK4b的表達量顯著下調(diào)； S g N F R 5 在任何時間點的表達量與0h相比無顯著差異；而 圖中未列出）在處理后不表達。另外，接種炭疽菌后柱花草的生長變化為：第3d柱花草葉尖稍顯發(fā)黃，第4d僅有少量葉片出現(xiàn)病斑，第7d時，病斑擴散，逐漸出現(xiàn)掉葉癥狀。

綜上所述，在幾丁質和兩種炭疽菌的處理中，表達量均上調(diào)的基因有5個： S g L Y K 1 ， S g L Y K 4 a S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 。表明這5個基因在柱花草抗病中可能起到重要作用。

2.8SgLysM-RLKs家族成員響應低磷脅迫的表達模式分析

柱花草根部和葉片SgLysM-RLKs響應低磷脅迫表達模式分析結果如圖10所示，進行低磷處理10d后，根部組織只有 S g L Y K 1 ， S g L Y K 3 a 和 S g L Y K 5 的表達量顯著上調(diào)，其他家族成員的表達量無顯著變化甚至不表達；葉片組織中 S g L Y K 2 a 和S g L Y K 3 a 的表達量顯著上調(diào)， S g L Y K I 和 S g L Y K 4 a 的表達量顯著下調(diào)，其他家族成員的表達量無明顯變化甚至不表達。因此，只有 S g L Y K 3 a 基因在低磷處理1Od后的根和葉組織中顯著上調(diào)表達，表明其可能在低磷脅迫中起到重要作用。另外，低磷處理后柱花草的生長變化為：與正常供磷處理相比，低磷處理的柱花草地上部矮小、葉片數(shù)減少、分枝發(fā)育受阻，根系則表現(xiàn)為側根更長、密度更大。

Fig.5Transcriptome analysisof SgLysM-RLKs family in response to C gloeosporioidesand lowphosphorusstress 注：柱花草接種炭疽菌的轉錄組分析（A）；柱花草根部在低磷脅迫下的轉錄組分析（B）；柱花草葉片在低磷脅迫下的轉錄組分析（C）。High-Pi為 高磷 處理下的樣品；Low-Pi為低磷 處理下的樣品。橫坐標的數(shù)字1，2，3代表每個生物學重復標記 Note：Transcriptome analysis of S. guianensis in response to ：gloeosporioides（A）；Transcriptome analysis of stylo’sroots under low phosphorus stress（B）；Transcriptome analysis ofstylo’sleavesunderlowphosphorus stress（C）.High-Pirefers tosampleunderHP treatment；Low-Pi refers to sample under LP treatment. The numbers 1，2 and 3 in the absciss represent each biological replicate

3 討論與結論

3.1SgLysM-RLKs家族鑒定及生物信息學分析

由于尚無柱花草的基因組發(fā)表，因此本研究利用柱花草轉錄組數(shù)據(jù)鑒定其LysM-RLKs家族成員，首次得到11個成員，并進行了命名。雖然可能未得到完整的LysM-RLKs家族成員，但鑒定到的成員數(shù)量多于擬南芥（5個）]，說明LysM-RLKs家族在柱花草中發(fā)生了明顯擴增，且這些成員可能增加了新的功能。已有研究報道，亞組I中的AtLYK1/AtCERK1，LjCERK6和亞組V中的

AtLYK5具有識別幾丁質功能[4.25-26]，參與植物免疫反應；亞組I中的LjNFR1，GmNFRlα， 和亞組ⅢI中的LjNFR5具有識別Nod因子（NFs）功能[27-28]，參與根瘤或叢枝菌根共生。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹上，柱花草、百脈根和大豆的成員均能聚類到同一小分支下，說明同為豆科植物的它們親緣關系相近，在進化過程中相對保守，功能類似的可能性也更大。據(jù)此推測，亞組I中的SgLYK1可能具有識別幾丁質和Nod因子的功能，亞組V中的SgLYK5可能具有識別幾丁質功能，亞組Ⅲ中的SgNFR5可能具有識別Nod因子功能。

注：結果代表3次實驗的平均值，誤差線表示3次生物學重復表達值的標準誤差。使用 T -test方差分析比較不同組織之間的差異顯著性， 0.05， 和

Note：Theulsteexptssatedrfpefhlepl cates.Significantdifference between different tissues were compared using T -test analysis of variance， ， and

Fig.7Analysis of the expresson pattern ofSgLysM-RLKs in response to chitin treatment in stylo’s leaves注：結果代表3次實驗的平均值，誤差線表示3次生物學重復表達值的標準誤差。使用 T -test方差分析比較0h和其他處理時間之間的差異顯著性， 5 和 ，下同

Note：TheresultsepreentteragefromtheexpemetsErrorbarsidicatestadardoofthexpressoaluesfromthological replicates. Significant difference between Oh and other times were compared using T -test analysis of variance， ， and 0.001，similarlyhereinafter

Fig.8AnalysisofteexpressonpatteofSgLysM-RLKsinesponsetoinoculationwithColetotrichumgloeosporiodesstrair DZ-19 in stylo'sleaves

發(fā)揮模式識別受體功能的LysM-RLKs蛋白絕大部分定位在質膜上，例如蘋果（Malusdomestica）MdCERK1[22]、葡萄（Vitis vinifera）VvLYK5-1[29]和煙草（NicotianatabacumL.）NbLYK4.2[30]等植物的LysM-RLKs成員均已證實定位在質膜上。本研究亞細胞定位預測分析表明，柱花草大多數(shù)LysM-

RLKs蛋白定位在質膜上，說明LysM-RLKs蛋白主要在質膜上發(fā)揮功能，這與葡萄、蘋果、梨（Pyrusbretschneideri）和獼猴桃（Actinidiachinensis）的亞細胞定位預測結果類似[31-33]。本研究表明，SgLysM-RLKs家族成員的多個保守基序和結構域的排序相似，且都含有典型的胞外LysM結構域、跨膜結構域和胞內(nèi)激酶結構域（圖2，圖3），數(shù)量和分布也高度相似，因此，推測LysM-RLKs家族成員在柱花草響應炭疽菌侵染和磷脅迫的過程中發(fā)揮重要的激發(fā)、轉導和調(diào)控作用。

SgLYK1 SgLYK2a SgLYK2b SgLYK3a 皖 主 * 十 3 華 1.0- 5 工 工 2↓ 王 0.5 士 不表達不表達不表達 05 王 0 不表達 0 expesedpsee HP-R LP-R HP-R LP-L HP-R LP-R HP-R LP-L HP-R LP-R HP-R LP-L HP-RLP-RHP-RLP-L SgLYK3b SgLYK4a SgLYK4b SgLYK5 1.5- T Barsgeseeeneree 1.5 1.0 王 華 1.0- 工 士 “ 1.0 士 擊 No不表達 Note 不表達 5 不表達 □ HP-RLP-RHP-RLP-L HP-RLP-R HP-R LP-L HP-RLP-RHP-RLP-L HP-RLP-RHP-RLP-L SgLYK7 SgLYK8 SgNFR5 出 1.0 0.5- 0.5 0.5 No不表達 ot不表達 0 0 0 HP-RLP-RHP-RLP-L HP-RLP-RHP-R LP-L HP-RLP-RHP-R LP-L

stressinstylo’srootsand leaves 注： 為高磷 處理下的根部/葉片樣品； 為低磷 處理下的根部/葉片樣品。結果 代表3次實驗的平均值，誤差線表示3次生物學重復表達值的標準誤差。使用 T -test方差分析比較高磷和低磷處理之間的差異顯著性， 0.05， 和 （204 Note： refers to roots/leaves under HP treatment；LP-R/L refers to roots/leaves under LP （204 ）treatment.Theresultsrepresent theaveragefromthreexperimentsErrorbarsindicatestandarderoroftheexpressionvaluesfrom three biological replicates.Significant diference between highand low P treatment were compared using T -test analysis of variance， ， and （20

圖4顯示，SgLysM-RLKs家族成員的蛋白三級結構存在差異，特別是SgLYK7與其他成員表現(xiàn)出了明顯差異。據(jù)報道，植物LysM-RLKs家族成員除參與免疫和共生外，還參與細胞死亡、耐鹽性、脫落酸信號傳導等[31.34]，而SgLYK7只在低磷處理的轉錄組中被鑒定到，因此推測SgLysM-RLKs家族成員在長期進化的過程中產(chǎn)生了明顯的功能分化。另外，SgLYK1和AtLYK1/AtCERK1的三級結構類似，因而可能具有AtLYK1/AtCERK1的類似功能，這進一步加大了SgLYK1具有識別幾丁質功能的可能性。

3.2SgLysM-RLKs家族參與調(diào)控抗病功能

LysM-RLKs是一類在植物抗病中發(fā)揮重要作用的基因家族，在很多植物中已得到證實，例如擬南芥[35]、水稻[36]、番茄（Solanum lycopersicum）[37]和蘋果[22]等，同時，基因的表達情況與其功能密切相關。本研究表明，在SgLysM-RLKs家族響應幾丁質和炭疽菌的過程中，RT-qPCR結果與轉錄組數(shù)據(jù)存在一定差異：在接種炭疽菌的轉錄組數(shù)據(jù)中，S g L Y K I 基因在 時表達量顯著下調(diào)，而RT-qPCR結果則在 或 時表達量已經(jīng)顯著上調(diào)， 后表達量已無顯著差異。這可能是由于LysM-RLKs家族成員響應病原體侵染主要在前期，后期停止過度表達以避免過度的免疫反應而損傷植物本身。由于轉錄組數(shù)據(jù)取樣時間在 后，此時已處于響應后期，因此可能在轉錄組的時段內(nèi)基因表達無顯著差異。同理，這也可能是 S g L Y K 4 a 和 S g L Y K 8 基因轉錄組數(shù)據(jù)與RT-qPCR結果存在差異的主要原因。

綜上所述，在幾丁質和炭疽菌處理中均上調(diào)的基因SgLYK1， S g L Y K 4 a ，SgLYK5， S g L Y K 7 和S g L Y K 8 在柱花草抗病中可能起到重要作用。

3.3SgLysM-RLKs家族參與調(diào)控低磷脅迫功能

本研究表明，在低磷脅迫處理的轉錄組數(shù)據(jù)中，SgLysM-RLKs家族成員在根中的表達量均無顯著差異， S g L Y K 4 a 和 S g L Y K 4 b 在葉片中的表達量分別顯著下調(diào)和上調(diào)。RT-qPCR結果顯示S g L Y K I ， S g L Y K 3 a 和 S g L Y K 5 在根中的表達量顯著上調(diào)；葉片組織中 S g L Y K 2 a 和 S g L Y K 3 a 的表達量顯著上調(diào)， S g L Y K I 和 S g L Y K 4 a 的表達量顯著下調(diào)，即只有 S g L Y K 4 a 符合轉錄組的表達趨勢，其他基因存在差異，這可能是處理時間點的不同所致?？傮w上，SgLysM-RLKs家族成員在磷脅迫中也存在差異表達基因，因此部分SgLysM-RLKs家族成員可能在低磷脅迫中起到作用，且可能參與調(diào)控柱花草響應低磷脅迫，但其具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究利用轉錄組數(shù)據(jù)和生物信息學方法共鑒定到11個LysM-RLKs家族成員 （ S g L Y K I S g L Y K 2 a ， S g L Y K 2 b ， S g L Y K 3 a ， S g L Y K 3 b ， S g L Y K 4 a ， S g L Y K 4 b ， S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 ， S g L Y K 8 和 S g N F R 5 ），其蛋白大多數(shù)定位于質膜上，含有典型的胞外LysM結構域、跨膜結構域和胞內(nèi)激酶結構域，蛋白二級結構以 α 螺旋和無規(guī)卷曲為主，蛋白三維結構方面存在差異。表達模式分析表明，該家族成員均存在組織表達特異性，其中 S g L Y K I ， S g L Y K 4 a S g L Y K 5 ， S g L Y K 7 和 S g L Y K 8 可能在響應炭疽菌侵染和幾丁質誘導的免疫反應中發(fā)揮重要功能，S g L Y K 3 a 則可能參與調(diào)控柱花草響應低磷脅迫。

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（責任編輯閔芝智）