不同秋眠級紫花首蓿響應低溫脅迫的轉錄組學分析

Abstract：Thecultivationand production of Medicago satiua L.are affected byabrupt cold and extreme low temperature，which seriously afect the healthy development offorage industry in China.Inthis study，two cultivars of alfalfa with diferent fall dormancy，‘Xinjiang Daye’ and‘Zhaodong'，were treated with low temperature for （2號 and ， and cold response genes were screened by transcriptome sequencing technology. After of low temperature treatment，the cold resistanceof‘Zhaodong’was significantly higher than that of‘Xinjiang Daye’at 192 h. Through transcriptome sequencing analysis at and ， 13 differentially expressed genes related to cold resistance were further screened. After qRT-PCR fluorescence quantification was verified，7 genes with expression patterns consistent with the transcriptome data were identified： 2 genes with opposite expression trends in the two varieties of alfalfa，and 5 genes with the same expresion trend in the two varieties ofalfalfa. Inaddition，KEGG pathway enrichment analysis was performed on all diferentially expressed genes，and11 metabolic pathways related to cold resistance including starch and sucrose metabolism，MAPK signaling pathway and galactose metabolism were identified.The diferential genes and metabolic pathways screened in this study would provide references for subsequent studies on cold resistance mechanism and molecular breeding of alfalfa.

Key words：Alfalfa；Low temperature；Cold hardiness； Gene response； Metabolism response

紫花苜蓿（MedicagosatiuaL.）是一種優(yōu)質的多年生豆科牧草，具有蛋白質含量高、消化率高、生長快、環(huán)境適應性強等優(yōu)良特性，且能夠再生并多年利用，在我國畜牧產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著不可或缺的作用。然而，我國紫花苜蓿集中種植的內蒙古、新疆、甘肅和東北等地區(qū)[2]頻繁遭遇極端天氣[3-4]，這不僅給紫花苜蓿自身的生理生長帶來極大的阻礙，也對經(jīng)濟造成極大的損失[5]。紫花苜蓿在遭受低溫時，其表面發(fā)生病變、變色、組織破壞、加速衰老甚至腐爛，還會破壞其細胞膜系統(tǒng)，改變質膜特性及滲透平衡，降低光合和呼吸效率，促進蛋白質變性和活性氧、脫落酸的累積[6]

在面對低溫脅迫時，植物自身的保護機制便開始響應。研究指出，當植物暴露在非冰凍的低溫環(huán)境中時，會經(jīng)歷抗凍能力增強的過程，這一過程被稱為冷馴化。在冷馴化過程中，數(shù)以千計的基因在表達情況上發(fā)生了改變，其中一些基因編碼了參與抗氧化防御和滲透物（如可溶性糖和脯氨酸）生物合成的關鍵酶8]。可溶性糖除了可以作為滲透保護劑、營養(yǎng)物質外，還能通過與脂質雙分子層相互作用等多種途徑發(fā)揮保護植物細胞免受冷脅迫傷害的作用9。抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化酶以及非酶抗氧化劑通過清除植物體內活性氧，來調節(jié)植物非生物脅迫耐受性。此外，在紫花苜蓿應對低溫響應方面，DREB/CBF，CAMTA，MYB-like和AP2/ERF轉錄因子[10-12]、WOX家族成員[13]，以及CML8，ATGs14，eEF-2[15，RLKs等蛋白/酶被人們發(fā)現(xiàn)它們通過調控眾多基因的表達或調節(jié)代謝物的水平進而調節(jié)了紫花苜蓿的耐寒性。

此外，紫花苜蓿還有一個重要的自我保護機制，即在秋季由生長狀態(tài)過渡到休眠狀態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為秋眠[17]。夏末秋初收獲后，不同紫花苜蓿品種因秋眠引起的生長速度不同，導致秋季株高差異顯著，因此，紫花苜蓿被劃分了不同的秋眠型。秋眠程度不同的紫花苜蓿其耐寒性也有所不同。為了更深層次地了解紫花首蓿的抗寒機制，本研究對兩個秋眠性不同的紫花苜蓿品種進行低溫處理，利用轉錄組測序技術研究其抗寒過程中的關鍵基因，并嘗試從中找出造成不同秋眠級紫花苜?？购圆町惖年P鍵基因。從而為紫花苜蓿的抗寒性研究提供新的參考思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇‘新疆大葉’（半秋眠型）、‘肇東’（秋眠型）2個品種紫花苜蓿作為試驗材料[18]，進一步開展低溫處理試驗。首先，在試驗田里選擇2個品種大小接近一致的一年生苗分別移栽到直徑 的PVC管內進行恢復生長。待恢復生長一個月后，將PVC管移到培養(yǎng)箱（LRG-LED-35O-D，杭州綠博，中國）內進行一周的適應性生長（常溫），隨后進行低溫處理。其中，適應性生長的溫度條件為 （光/暗），光照條件為時長 （光/暗）光照強度 O

1. 2 試驗設計

低溫處理時，將培養(yǎng)箱的溫度設置從 （光/暗）降低到 光/暗），光照條件的設置不變?？紤]基因變化的時間20和抗寒性變化的時間，本研究分別在低溫處理開始后的 和 三個時間點進行同一批次處理的不同樣品取樣，取樣部位為紫花苜蓿的根頸，每個品種3次生物學重復。其中， 和 的樣品用于基因變化的分析， 和 三個時間點的樣品用于低溫半致死溫度的分析。

1.3低溫半致死溫度的測定

本研究依據(jù)徐洪雨21所描述的方法，采用低溫半致死溫度 來表征試驗樣品的抗寒性。先將紫花苜蓿根頸樣品在恒溫循環(huán)儀（ZX-5C，上海知信）中進行梯度冷凍，然后采用電導率法測定并計算細胞液的相對滲透率，最后根據(jù)梯度冷凍溫度和細胞液相對滲透率進行Logistic方程模擬，計算細胞液相對滲透率為 50 % 時所對應的冷凍溫度，即為 。在梯度冷凍的過程中， 取樣點樣品冷凍溫度的具體設置為 - 1 2 和 取樣點樣品冷凍溫度的具體設置為 - 2 ， - 5 ， - 7 ， - 9 ， - 1 0 ， - 1 2 ， - 1 4 ， - 1 6 和 ： 取樣點樣品冷凍溫度的具體設置為- 2 ， - 4 ， - 6 ， - 8 ， - 1 0 ， - 1 2 ， - 1 4 ， - 1 6 和 。

使用SPSSV.19對 數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，分析方法為LSD法，差異顯著水平為 O

1.4轉錄組測序及新基因分析

從樣品中提取總RNA，為每個樣品構建信使RNA（mRNA）文庫，并使用Illumina平臺進行測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、測序錯誤率檢測、GC含量檢查后得到CleanReads。利用HISAT2軟件將CleanReads與紫花苜蓿全基因組數(shù)據(jù)（https：//figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assem-bly_of_Medicago_sativa/6638O）進行比對注釋。根據(jù)比對上基因組Reads的位置信息，使用StringTie軟件將Reads組裝成轉錄本，從拼接的轉錄本與基因注釋的比較結果中提取新轉錄本信息，從基因組中提取新基因的序列，使用diamond軟件將新基因與KEGG，NR等數(shù)據(jù)庫序列比對得到注釋結果。使用FeatureCountsv1.6.2軟件對基因比對情況進行計算，并采用每百萬映射片段的轉錄本每千堿基的片段數(shù)（FragmentsPerKilobaseoftranscriptperMillionfragmentsmapped，F(xiàn)PKM）值作為衡量轉錄本表達的水平。FPKM值的計算公式如下：

轉錄本的映射片段FPKM = 映射片段總數(shù)（百萬 ） × 轉錄本長度（kb）

注：其中，轉錄本的映射片段數(shù)表示比對到某一轉錄本上的片段數(shù)，即雙端Reads數(shù)目；映射片段總數(shù)表示比對到轉錄本上的片段總數(shù)，以 為單位；轉錄本長度，以 個堿基為單位。

1.5差異基因篩選及KEGG富集分析

輸人基因的未經(jīng)過標準化的reads計數(shù)數(shù)據(jù)，使用DEseq2軟件進行樣品間的差異表達分析獲得兩個生物學條件之間的差異表達基因集。差異分析之后，用Benjamini-Hochberg方法對假設檢驗概率 P value）進行多重假設檢驗矯正，得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（Falsediscoveryrate，F(xiàn)DR）。差異基因篩選條件為llog2FoldChange ，且FDR lt; 0 . 0 5 。對兩品種紫花苜蓿所有差異基因分別開展KEGG通路分析，篩選相關代謝通路。結合FPKM表達數(shù)據(jù)以及差異基因篩選數(shù)據(jù)，進一步篩選出可能影響紫花首蓿耐寒性的關鍵基因。為了更直觀的展示基因表達量變化，本研究使用Excel繪制基因相對表達量熱圖，并將這些基因與NR數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行對比，進一步預測其功能。

1. 6 基因表達驗證

篩選出關鍵基因后，再次利用這2個品種紫花苜蓿開展相同的低溫處理試驗，并分別在0h和24h時間點取樣，每個品種取5次生物學重復。樣品提取RNA后采用實時熒光定量法（qRT-PCR）檢測篩選基因在紫花苜蓿中的表達情況，檢測基因、內參基因（Actin2）及其引物信息見表1。qRT-PCR檢測使用的試劑盒包括RNA提取試劑盒[TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，（Takara，日本）]、反轉錄試劑盒［PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime），（Takara，日本）]和熒光定量試劑盒［Green？Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），（Takara，日本）]。

2 結果與分析

2.1低溫半致死溫度

圖1為紫花苜蓿根頸樣品 在3次取樣點的大小。從圖中可以看出，與0h時相比，兩品種紫花苜蓿在冷處理 后的 并無顯著性變化，但在冷處理192h后它們的 均發(fā)生顯著降低（ P lt; 0.05），即抗寒性均有顯著性提高。另外，在冷處理前期，‘肇東'與‘新疆大葉'品種間的抗寒性無顯著性差異，但在 時，‘肇東'的 顯著低于‘新疆大葉 ，即‘肇東'的抗寒性顯著高于‘新疆大葉’。

2.2轉錄組測序及新基因分析

本研究針對 樣點和 樣點的樣品進行了轉錄組測序分析。經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢查和GC含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的cleanreads。結果顯示，12個樣本測序所得原始序列介于 之間，過濾后序列介于 p之間，錯誤率為0 . 0 3 % ，Q30（質量值 ？ 3 0 堿基百分比）介于

9 3 . 3 5 % ～ 9 4 . 1 6 % 之間，GC含量在 4 0 . 5 2 % ～ 41. 7 5 % 之間，測序結果準確可靠（表2）?！陆笕~'中共有64405個基因被注釋，其中，9109個為新基因（novel基因）；‘肇東'中共有63279個基因被注釋，其中8599個為新基因。

2.3差異基因及抗寒相關關鍵基因的篩選

根據(jù)差異基因的篩選條件，在 樣點和 樣點之間，‘新疆大葉'紫花苜蓿中共篩選到3725個差異基因，包括1581個下調基因和2144個上調基因；‘肇東'紫花苜蓿中共篩選到3040個差異基因，包括1478個上調基因和666個下調基因（圖2）。差異基因的表達情況見圖3。

本研究中篩選到較多試驗處理前后差異表達的基因，這些基因可能都與紫花苜蓿的冷響應有關。但是，為進一步縮小研究范圍，找出與紫花苜?？购韵嚓P性最強的關鍵基因，根據(jù)差異基因表達量最大和表達差異倍數(shù)最大兩個原則做進一步篩選，最終從眾多差異基因中篩選出13個重要基因作為進一步分析和深入研究的目標對象。其中，5個基因在‘新疆大葉'和‘肇東'中呈現(xiàn)了截然不同的表達變化趨勢；有6個基因在兩品種呈現(xiàn)了相同的表達變化趨勢。此外，本研究篩選到1個僅在‘肇東'中差異表達基因和一個僅在‘新疆大葉'中差異表達的基因（見圖4）?；蚬δ茏⑨尳Y果見表3。

注：圖（A）為‘新疆大葉'基因表達火山圖，圖（B）為‘肇東'基因表達火山圖。橫坐標表示基因表達的差異倍數(shù)，縱坐標表示基 因表達差異性的顯著水平。紅點代表上調差異表達基因，綠點代表下調差異表達基因，藍點代表非差異表達基因 Note：The Fig.（A）isthe geneexpresson volcano mapof‘Xinjiang Daye’，and theFig.（B）is the gene expresion volcano map of‘Zhaodong’.Thehorizontalcoordinateshowsthediferentmultiplesofgeneexpressionbeforeandaftertreatment，thedinate indicates thesignificantlevelofdiferenceingeneexpresionbeforeandaftertreatment.Reddotsrepresentup-regulateddifren tiall expresedgnes，greendotsrepresentdow-regulateddiferentiallyexpressedgenes，andbluedotsrepresentnondiferen tially expressed genes

2.4差異基因KEGG通路富集分析

將兩個品種紫花苜蓿中篩選到的所有差異基因分別進行KEGG富集分析，圖5展示了其中被富集到的前20條通路。在富集到的前20條通路中，主要包括4大類，包括環(huán)境信息處理、新陳代謝、生物系統(tǒng)和細胞過程。其中，植物晝夜節(jié)律、淀粉和蔗糖代謝、代謝途徑、植物MAPK信號途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、植物激素信號轉導、多種N-聚糖的生物合成、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、半乳糖代謝、肌醇磷酸代謝以及次級代謝物的生物合成等11條代謝通路在兩個品種紫花苜蓿中均被顯著富集到。這些代謝通路在紫花苜?？购^程中可能均發(fā)揮著重要作用。

2.5 基因表達驗證

為保證轉錄組數(shù)據(jù)的準確性，本研究對這13個基因進行了qRT-PCR基因表達量驗證。結果表明，有7個基因符合轉錄組數(shù)據(jù)：低溫脅迫時，基因nouel.12052和MS.gene065152在‘肇東'紫花苜蓿中上調，而在‘新疆大葉’中下調；基因MS.gene42333和MS.gene064674在2個品種紫花苜蓿中均下調，MS.gene008206，MS.gene41026和MS.gene40758均上調（圖6）。

3討論

3.1基因與紫花苜?？购缘年P系

3.1.1在兩品種紫花苜蓿中表達趨勢相反的5個基因在本研究中篩選到的13個基因，通過與NR數(shù)據(jù)庫進行比對，最終有9個基因被注釋到。轉錄組數(shù)據(jù)中在兩種紫花苜蓿中表達趨勢相反的5個基因中，在后續(xù)qRT-PCR試驗中僅novel.12052和MS.gene065152這2個基因符合轉錄組數(shù)據(jù)?；騨ovel.12052被注釋為跨膜蛋白?？缒さ鞍讌⑴c植物的多種生理活動，包括信號轉導、物質轉運和能量轉化[22]。一些跨膜蛋白感知并響應各種環(huán)境脅迫，這些跨膜蛋白在遇到冷脅迫時表達上調。一些跨膜蛋白調控基因在低溫脅迫下的下調可能促進氣孔關閉，延緩細胞脫水，從而幫助植物耐受低溫脅迫[23]?；騇S.gene065152被注釋為谷氨酰胺—tRNA合成酶（GlnRS）[24]，是氨基?；鵷RNA合成酶（ARSs）的一種，其是蛋白質合成的必需酶，具有進化保守的酶促機制[25]。正確的氨基酸首先被ATP激活，形成氨酰腺苷酸，然后轉移到tRNA的 端核苷酸上[26]。MS.gene065152表達量的差異，可能會導致可溶性蛋白合成量的差異，進而導致兩品種紫花苜?？购猿霈F(xiàn)差異。

表3基因功能注釋表

qRT-PCR驗證試驗中，novel.19075，MS.gene061814，n0vel.211663個基因在兩個品種紫花苜蓿中表現(xiàn)出了相同的趨勢。novel.19075被注釋為含DEK結構域的染色質相關蛋白，DEK最初出現(xiàn)在對人類髓性白血病患者中，并以患者的首字母縮寫命名[27]。在哺乳動物中，DEK在體外被證明具有組蛋白伴侶活性，對異染色質完整性很重要。此外，DEK還與DNA復制、DNA雙鏈斷裂修復、mRNA剪接和轉錄調控有關[28]。在最近的一項關于植物的研究中發(fā)現(xiàn)，DEK很可能是擬南芥逆境耐受性的調節(jié)因子，在擬南芥受到鹽脅迫時，DEK顯著下調[29]。在本研究的qRT-PCR試驗中，兩個品種紫花苜蓿在遭受低溫脅迫時，基因novel.19075呈現(xiàn)下調趨勢，與前人的研究結果一致，這表明該基因很有可能也在紫花苜蓿抗寒中發(fā)揮重要作用。MS.gene061814被注釋為跨膜Emp24結構域蛋白（TMED）[30]，TMED家族蛋白是分泌途徑運輸?shù)鞍踪|的關鍵調節(jié)因子，但其在植物中的功能尚未被充分研究31。在后續(xù)驗證中，基因MS.gene061814在兩個品種紫花苜蓿中同樣呈現(xiàn)下調趨勢，表明該基因也有可能在紫花苜蓿抗寒中發(fā)揮重要作用。

植物晝夜節(jié)律Circadianrhythm-plant .淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism代謝途徑Metabolic pathways-丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alaninespatatendgutamatemetm q value植物MAPK信號途徑MAPK signaling pathway-plant 1.00磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)Phosphatidylinositol signalingsystem植物激素信號轉導Plant hormone signal ransduction . 0.75糖酵解/糖異生Glycolysis Gluconeogenesis . 0.50多種N-聚糖的生物合成Various types ofN-glycan biosynthesis0.25Tropanepiped .Valine酸亮氨亮氨解 ： 0.00氨基酸糖和核苷酸糖代謝Aminosugar andnucleotidesugar metabolism .類黃酮的生物合成Flavonoid biosynthesis- . 數(shù)目Number半乳糖代謝Galactosemetabolism- ·. 200核苷酸糖的生物合成Biosynthesis of nucleotide sugars . . 400肌醇磷酸代謝Inositol phosphate metabolism ·600N-聚糖的生物合成N-Glycan biosynthesis- ·次級代謝物的生物合成Biosynthesis of secondary metabolites-氨基酸的生物合成Biosynthesisof amino acids ·自噬-其他 Autophagy-other ·0.04 0.06 0.08 0.10Rich factorKEGG富集統(tǒng)計分析StatisticsofKEGG enrichmient（B）植物晝夜節(jié)律Circadian rhythm-plant .植物MAPK信號途徑MAPK signaling pathway-plant植物與病原體的相互作用Plant-pathogeninteraction氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解 q valueValine，leucineandisoleucinedegradation 1.00植物激素信號轉導Plant hormone signal transduction0.75淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism .代謝途徑Metabolic pathways- 0.50甘油磷脂代謝Glycerophospholipid metabolism . 0.25半乳糖代謝Galactose metabolism- .0.00肌醇磷酸代謝Inositolphosphate metabolism .·數(shù)目Number·Glycosphigolip和系 . 100甘油磷脂代謝Glycerophospholipid metabolism ·200葡萄糖苷酸的生物合成Glucosinolate biosynthesis- 300果糖和甘露糖代謝Fructoseandmannosemetabolism ·400半胱氨酸和蛋氨酸代謝Cysteine and methioninemetabolism- ·500氰基氨基酸代謝Cyanoamino acid metabolism ·類胡蘿卜素的生物合成Carotenoid biosynthesis .次級代謝物的生物合成Biosynthesis of secondary metabolites0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07Rich factor所有差異基因KEGG通路富集分析

注：圖（A）為‘新疆大葉’，圖（B）為‘肇東’?？v坐標表示KEGG通路，橫坐標表示富集因子（注釋到該條目下的差異基因的數(shù)量與注釋到該條目下基因總數(shù)的比值）。富集因子越大，表示富集的程度越大。點的大小代表該通路富集的基因的數(shù)量，數(shù)量越多點越大。點的顏色代表該通路富集的顯著性，用校正后的PH值 value）進行評估。 q value值越接近0，顏色越紅，代表富集越顯著。圖中只展示了富集程度最顯著的20條通路

Note：TheFig.（A）is‘XinjiangDaye’，theFig.（B）rightis‘Zhaodong’.Theverticalcoordinaterepresents theKEGG path way，andthehorzontaloordinaterepresentstheRichfactor（theatiooftheumbrofdiferetialgenesanotatedtothetryto thetotalnumberofgenesannotatedtotheentry.）ThelargertheRichfactor，thegreatertheenrichment.Thesizeofthedotsrepresents thenumberof genes enrichedinthepathway，thelargerdotsthe more number.Thecolourofthedots represents the sig nificance of the pathway's enrichment，as assessed by the corrected $＼boldsymbol { ＼mathscr { P } }$ value （ q value）. q values closer to O，and reddish colours， represent more significant enrichment.Only the 2O most significantly enriched pathways are shown

3.1.2在兩品種紫花首蓿中表達趨勢相同的6個基因在兩品種紫花苜蓿表達趨勢相同的6個基因中，經(jīng)qPT-PCR驗證后，有MS.gene008206，MS.gene41026，MS. gene40758，MS. gene42333，MS.gene0646745個基因的表達水平與轉錄組數(shù)據(jù)一致。MS.gene008206注釋為冷調節(jié)蛋白（COR）。其編碼的是在低溫下表達的親水性多肽，通過形成α -螺旋的二級結構對產(chǎn)生脫水的細胞脂膜起到穩(wěn)定作用，從而使植物獲得抗寒性[32-33]。在過去的研究中，科學家們發(fā)現(xiàn)許多轉錄因子，如DREB1/CBF，CCA1/LHY，RVE4/RVE8，HD2C，HOS15，PWR和 C U L 4 等，它們能夠在寒冷的條件下直接或間接調控 C O R 基因的表達，從而調節(jié)植物的抗寒性[10]

基因MS.gene41026在NR數(shù)據(jù)庫中注釋為O-糖基水解酶家族蛋白。在O-糖基水解酶家族蛋白中，糖基水解酶是一類廣泛存在的酶，可水解兩個或多個碳水化合物之間或碳水化合物與非碳水化合物部分之間的糖苷鍵。該家族蛋白參與許多重要的生物學過程，包括水解結構或儲存多糖，防御病原體，細胞表面碳水化合物的轉換等[34]。此外，還有研究表明，高脯氨酸含量的O-糖蛋白在細胞膜系統(tǒng)中進行組裝和修飾，在植物遭受逆境時發(fā)揮作用[35]。但到目前為止，O-糖蛋白在植物中的功能尚未被充分研究。

基因MS.gene40758被注釋為半乳糖醇合酶，它是合成棉子糖和水蘇糖的關鍵酶之一[21]?？扇苄蕴窃谧匣ㄜ俎？购邪l(fā)揮了極大的作用：營養(yǎng)物質[36]、信號傳導[37]、滲透保護劑[38]、活性氧清除劑[39]等。目前已有眾多研究表明棉子糖合成酶步驟中的半乳糖醇合酶、棉子糖合成酶以及水蘇糖合成酶在紫花苜蓿遭受低溫脅迫時表達量顯著上調4，進而影響紫花苜?？购浴?/p>

此外，MS.gene42333，MS.gene0646742個基因在兩個品種紫花苜蓿遭受低溫脅迫時表現(xiàn)出下調的趨勢并且得到驗證。雖然本研究并未注釋到這2個基因的功能，但其仍然可能是紫花苜?？购年P鍵基因。

3.1.3在兩紫花苜蓿品種中特異表達的2個基因本研究中，在兩品種紫花苜蓿中特異表達的基因的驗證結果均與轉錄組數(shù)據(jù)不符。驗證結果表明，這2個基因在2種紫花苜蓿中均呈現(xiàn)下調趨勢。基因MS.gene058382在NR數(shù)據(jù)庫中被注釋為致病相關蛋白BETVI家族蛋白。BET（BromoandExtra-Terminal，溴域和外端）蛋白在人體中對正常的細胞過程至關重要，因為它們控制細胞周期進程、神經(jīng)發(fā)生、分化、紅細胞成熟和精子的發(fā)生等。它還與許多病理疾病有關，包括癌癥、炎癥、感染、腎臟疾病和心臟病[41]。在本研究中，基因MS.gene058382編碼BETVI家族蛋白，其為存在于花粉和植物性食物中的一大群過敏原[42]。目前為止，在植物中對該基因的研究較少?；騇S.gene29584為糖磷酸鹽/磷酸鹽易位器。糖磷酸化是碳水化合物分解代謝驅動ATP生成和生物量積累的第一步。磷酸化本身是一種能量消耗行為[43]，當紫花苜蓿遭受低溫時，能量消耗會隨之減少，基因MS.gene29584在2個品種紫花苜蓿中的下調也印證了這一點。

3.2代謝通路與紫花苜?？购缘年P系

在本研究中，圖5展示了兩種紫花苜蓿中差異基因KEGG富集分析的前2O條代謝通路。其中，有11條代謝通路在兩品種紫花苜蓿中均被顯著富集。研究表明，這些代謝通路在植物抗寒過程中發(fā)揮著重要作用，包括淀粉和蔗糖代謝[44]、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)[45]、植物激素信號轉導[46]、各種類型的N-糖的生物合成[47]、氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解[48]、半乳糖代謝[49]、肌醇磷酸鹽代謝[50]以及次級代謝物的生物合成[51]等。

在篩選到的代謝通路中，晝夜節(jié)律通過調控冷響應基因，廣泛影響植物的低溫適應過程。在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，大約三分之一的基因受晝夜節(jié)律所調控[52]。CBF是 C O R 基因下游靶標的轉錄激活因子，通過對 C O R 基因啟動子區(qū)域的擴展分析顯示，晚間元件 （ E E ） 、核心時鐘成分（CCA1）和 L H Y 識別的順式元件在植物中普遍存在。而CBF轉錄本的穩(wěn)態(tài)水平和其冷誘導由晝夜控制，許多CORs基因的穩(wěn)態(tài)轉錄水平也受晝夜節(jié)律所影響[53]CBF啟動子中的 E E 元件通常與ABA響應順式元件偶聯(lián)，而這兩個元件都是 C O R s 基因冷誘導所必需的，這也就說明晝夜節(jié)律是植物冷響應機制中不可或缺的部分[54]。另外， I C E 1 是CBF的主要調控因子，部分MPK會影響ICE1的穩(wěn)定性進而調控植物的抗寒性。其中，MPK是MAPK級聯(lián)反應的三種蛋白激酶之一[55]，在本研究中，植物MAPK信號途徑在兩種紫花苜蓿中均被顯著富集到。通過對這些代謝通路所涉及到的基因、蛋白、代謝物本身及上下游調控的研究，可更加深入地解析紫花苜蓿的抗寒機制，并為分子育種工作奠定基礎。

4結論

本研究通過對兩種紫花苜蓿冷處理前后轉錄組測序分析，分別篩選到3000余個差異表達基因。通過差異基因表達量最大和表達差異倍數(shù)最大兩個原則做進一步篩選后，最終篩選到13個與紫花首?？购溥m應相關的關鍵基因。經(jīng)qPT-PCR試驗驗證，有7個基因符合轉錄組數(shù)據(jù)。后通過對差異基因的KEGG富集分析，篩選到11條在兩種紫花苜蓿中均被顯著富集的代謝通路。本研究所篩選出來的關鍵基因和代謝通路，將為紫花苜?？购畽C制的深入研究以及分子育種設計提供參考。

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（責任編輯 閔芝智）