飼用燕麥TLP基因家族鑒定及干旱脅迫下表達(dá)模式分析

Abstract：Tubby-like proteins （TLP） are a significant group of proteins discovered acrossanimal and plant species that participate in various biological processes. These proteins play a crucial role in plant growth，development，and the responses to abiotic stresses. This study employed bioinformatics methods to identify 32 TLP family genes from the hexaploid oat （Auena satiua） genome. We conducted an analysis of their physicochemical properties，gene structures， phylogenetic evolution， and expression patterns across diferent tissues under drought stress. The results demonstrated that the amino acid count of the A s T L P genes ranged from 238 to 543 amino acids. The molecular weights of these proteins were found to be between 26.99 and ，and their isoelectric points ranged from 9.OO to 9.58. These genes unevenly distributed across 17 chromosomes and possessed a large number of conserved motifs.The functional elements primarily included those related to internal hormone responses and external environmental reactions.Expresion analysis indicated significant diferences in the expresion levels of nine AsTLP members between roots and leaves of oats.Specifically，four members showed the increased expression in alltissues under drought stress，suggesting a potential significant role in the oat’s response to drought stress. These findings provided a valuable reference for further studies on the oat TLP family and their responses to drought stress. Key words：Avena satiua； Tubby-like proteins；Bioinformatics；Drought stress；Gene expression

在全球氣候變化的背景下，作物面臨的非生物脅迫如高溫、干旱和鹽堿等問題日益嚴(yán)峻，這些因素不僅影響作物的生長發(fā)育，還可能導(dǎo)致產(chǎn)量的大幅下降[1]。因此，增強(qiáng)作物在逆境下的適應(yīng)性，保障全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定與食物安全，成為亟需解決的問題[2]。研究表明Tubby樣蛋白家族（Tubby-likeprotein，TLP）在植物對抗逆境脅迫中扮演著關(guān)鍵角色[3]，TLP最初是在小鼠（Musmusculus）基因組中發(fā)現(xiàn)4，隨后在多種動(dòng)植物基因組中均有發(fā)現(xiàn)。這類蛋白的一個(gè)顯著特征是其C末端具有約270個(gè)氨基酸組成的Tubby結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在不同物種中保持高度保守，表明其在多細(xì)胞生物中承擔(dān)著基本的生物學(xué)功能[5-6]。研究顯示，TLP蛋白對植物和動(dòng)物的生長發(fā)育至關(guān)重要，其家族成員的缺失可能導(dǎo)致動(dòng)物的表型特征改變，甚至引發(fā)嚴(yán)重疾病[7-8]。

隨著對 T L P 基因研究的深入，其在植物中的生物學(xué)功能研究也日益增多9。在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中已鑒定出該家族的11個(gè)成員，其中AtTLP3和 A t T L P 9 可以通過調(diào)控脫落酸信號通路，進(jìn)而影響種子在干旱和鹽脅迫條件下的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育[10]。在水稻（Oryza satiua）中，OsTLP2蛋白能與由病原體誘導(dǎo)的 O s W R K Y 1 3 轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域的PRE4順式元件結(jié)合，調(diào)節(jié)水稻對細(xì)菌和真菌的抗性[1]。在蘋果（Malusdomes-tica）中，多個(gè) T L P 基因在非生物脅迫下的表達(dá)上調(diào)，表明這些基因在應(yīng)對環(huán)境壓力中發(fā)揮重要作用[12]此外，在鷹嘴豆（Cicerarietinum）中，CaTLP1基因的表達(dá)增強(qiáng)了植物對干旱脅迫的抗性[13]

燕麥（Avenasatiua）作為重要的谷類作物，具備耐寒旱、耐鹽堿、營養(yǎng)豐富及飼草產(chǎn)量高的顯著特性，是糧飼兼用的關(guān)鍵作物之一[14]。在畜牧業(yè)不斷發(fā)展的背景下，燕麥逐漸成為我國牛羊養(yǎng)殖中重要的粗飼料來源，尤其是在我國的高寒牧區(qū)，燕麥更是牦牛等牲畜冬春補(bǔ)飼的主要飼草之一[15]。近年來，栽培皮、裸燕麥基因組數(shù)據(jù)的相繼公布有助于深入理解其抗逆性遺傳機(jī)制，并推動(dòng)了燕麥分子輔助育種技術(shù)的發(fā)展[16-17]。本研究利用生物信息學(xué)工具對燕麥中的TLP基因家族進(jìn)行了全面鑒定和表征。通過對系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和染色體分布的深入分析，以及對干旱脅迫條件下不同組織的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行評估，揭示了A s T L P 基因的功能動(dòng)態(tài)。這為進(jìn)一步理解燕麥在應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育過程中分子機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)為飼用燕麥或其他飼草的抗旱品種創(chuàng)制提供了基因素材。

1 材料與方法

1.1燕麥TLP家族成員鑒定與理化性質(zhì)

為識別燕麥基因組中的TLP家族成員（AsTLP），首先從TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中檢索擬南芥的TLP基因家族的參考序列[18]，并從GrainGenes數(shù)據(jù)庫（https：//wheat.pw.usda.gov/GG3/）中下載栽培燕麥OT3098_v2的基因組和gff文件[19]。使用TBtools軟件對這些參考序列進(jìn)行BLAST比對[20]，并從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載TLP結(jié)構(gòu)域（PFO1167）的HMM模型[21]，通過BLASTp（ 0.001）搜索分離燕麥中的所有可能同源物。隨后，利用TBtools篩選非冗余候選基因，并在UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中進(jìn)行比對驗(yàn)證[22]，最終得到AsTLP基因成員。將鑒定的AsTLP基因序列提交至ExPASY（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析網(wǎng)站[23]，預(yù)測其分子量（Molecularweight，MW）、氨基酸數(shù)目（Aminoacid，AA）和理論等電點(diǎn)（Theoreticalisoelectricpoint，pI）。通過WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[24]。

1.2AsTLP結(jié)構(gòu)與染色體定位

使用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）鑒定了 A s T L P 基因氨基酸序列中的保守基序（motif）[25]，參數(shù)設(shè)置為motif數(shù)量10個(gè)，其他為默認(rèn)參數(shù)，同時(shí)在MEGA-X中采用最大似然法（Maximumlikelihood，ML）構(gòu)建物種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。從GFF3文件中提取 A s T L P 基因外顯子和內(nèi)含子位置，并在基因組中提取全部基因的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，使用TBtools對其進(jìn)行了可視化。

1.3AsTLP系統(tǒng)進(jìn)化與共線性分析

在GrainGenes數(shù)據(jù)庫下載燕麥屬二倍體物種Avena longiglumis（ 和四倍體物種Avenainsularis（ ，CCDD）基因組數(shù)據(jù)并分別提取TLP基因成員，結(jié)合擬南芥和水稻TLP序列信息，在MEGA-X中采用臨接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建物種間系統(tǒng)發(fā)育樹。為進(jìn)一步理解 T L P 基因在禾本科植物中的進(jìn)化關(guān)系，對栽培燕麥、二倍體燕麥（A.longiglumis）、四倍體燕麥（A.insularis）、水稻和二穗短柄草（Brachypodiumdis-tachyon）基因組進(jìn)行比對，并在TBtools中對多物種基因?qū)簿€性進(jìn)行可視化分析。

1.4AsTLPs的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測

在PlantCARE （http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站中[27]，基于AsTLPs基因上游20OObp的基因序列進(jìn)行了啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測，整理和簡化后的預(yù)測結(jié)果用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.5植物材料處理與表達(dá)模式分析

本研究以耐旱型燕麥資源‘MortgageLifter'為試驗(yàn)材料，材料來源于青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，并收錄于中國作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)（www.cgris.net，庫編號I1F02715）。挑選飽滿且大小均一的種子，在培養(yǎng)盒中發(fā)芽7天后轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)Hoagland溶液水培系統(tǒng)中，控制生長條件為 晝夜循環(huán)，相對濕度6 5 % ～ 7 5 % ，光照強(qiáng)度 。干旱脅迫處理通過添加 1 5 % PEG-600O的Hoagland溶液進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在脅迫開始（0小時(shí)）和脅迫后的6，12和24小時(shí)，分別采集正常和干旱條件下的幼苗葉片與根系樣品，液氮冷凍后立即保存于 。樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以比較不同脅迫時(shí)間及不同部位間 A s T L P s 的相對表達(dá)量（FragmentsPerkilobaseoftranscriptPerMillionmappedreads，F(xiàn)PKM差異。

2 結(jié)果與分析

2.1AsTLP家族成員鑒定與基本理化性質(zhì)分析

基于Blast和HMMER序列比對，結(jié)合Tubby結(jié)構(gòu)域分析，最終獲得了32個(gè)非冗余燕麥 A s T L P 成員，根據(jù)其在染色體上的分布位置，依次將其命名為 。如表1所示，AsTLPs的氨基酸數(shù)目為 個(gè)；蛋白的分子質(zhì)量為 2 6 . 9 9 ～ ；所有AsTLPs的理論等電點(diǎn)范圍在 9 ～ 9.58，均大于7.0，說明這些成員富含堿性氨基酸；亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示AsTLPs均位于細(xì)胞核中。

2.2AsTLP家族成員結(jié)構(gòu)與染色體定位

A s T L P s 在染色體上呈現(xiàn)不均勻分布（圖1），除1C，2A，2C和2D染色體外，其余17條染色體上均有分布。其中1A和6A染色體上分布最多，均包含4個(gè)成員，其次是4C和5D上，分別包含3個(gè)成員。為進(jìn)一步探索 A s T L P 基因的進(jìn)化關(guān)系和發(fā)掘其潛在功能，對32個(gè)AsTLPs構(gòu)建ML進(jìn)化樹，并分析其保守基序和基因結(jié)構(gòu)（圖2）。由圖2可知，所有AsTLP成員根據(jù)其蛋白質(zhì)序列大致可以分為4組（Group1＼～4），各組中 A s T L P 成員的結(jié)構(gòu)特征與ML系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果高度一致。MEME檢索得到10個(gè)保守基序中，除AsTLP26以外，僅有2個(gè)保守基序呈現(xiàn)出一定的特異性分布。其中motiflO僅分布于Group1和Group2中，Group4中大部分成員不包含motif7，而其余8個(gè)保守motif在所有成員中均有分布。此外， A s T L P 家族的成員的CDS（外顯子）和UTR（非編碼區(qū)）結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜（圖2），大部分成員存在多個(gè)間斷的CDS區(qū)域和UTR區(qū)域，如Group1和Group4中所有成員擁有的外顯子數(shù)量一致，均為4個(gè)，Group2和Group3成員擁有4到5個(gè)外顯子。上述結(jié)果預(yù)示了 A s T L P 成員的基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中的保守性。

2.3多物種TLP家族成員系統(tǒng)進(jìn)化與共線性分析

基于4個(gè)單子葉物種二倍體燕麥、四倍體燕麥、六倍體燕麥（A.satiua）和水稻以及1個(gè)雙子葉物種擬南芥之間TLP的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），分析了TLP在物種間的進(jìn)化關(guān)系。圖3顯示TLP家族成員大致可分為6個(gè)亞組，擬南芥TLP成員在各亞組中的進(jìn)化樹分支相對獨(dú)立，而單子葉物種的TLP成員間的聚類關(guān)系更加密切，這表明TLP家族在單子葉植物進(jìn)化歷史中的保守性。

進(jìn)一步分析單子葉植物中TLP家族成員的共線性，選擇禾本科二倍體燕麥、四倍體燕麥、水稻和二穗短柄草與目標(biāo)物種進(jìn)行比對（圖4）。作為栽培燕麥（AACCDD）的祖先種，二倍體燕麥（AA）和四倍體燕麥（CCDD）的TLP成員具有高度的共線性，且共線網(wǎng)絡(luò)隨著倍性的增加而增加，尤其在六倍體燕麥和四倍體燕麥間，2C與2D染色體上均沒有TLP成員。此外，二穗短柄草和水稻中每個(gè)TLP成員均能關(guān)聯(lián)到2～5個(gè)AsTLPs基因，這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TLP基因在單子葉植物中的高度保守性。

2.4 順式作用元件分析

順式元件對于植物響應(yīng)環(huán)境變化和調(diào)節(jié)生長發(fā)育至關(guān)重要。在所有 A s T L P s 上游 序列的順式作用元件中，共檢測到920個(gè)功能元件，可劃分為11種類型（圖5）。其中與特定的激素反應(yīng)相關(guān)元件包括脫落酸（Abscisicacid）、生長素（Auxin）赤霉素（Gibberellin）、水楊酸（Salicylicacid）和茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)，這些激素在植物的生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境壓力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)元件包括低溫（Lowtemperature）低氧（Anaerobic）光（Light）和干旱（Drought）響應(yīng)，這些元件在植物細(xì)胞中識別特定的應(yīng)激信號，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來幫助植物適應(yīng)不利條件。此外，還包括發(fā)育特異性表達(dá)的分生組織表達(dá)（Meristemexpression）和參與代謝調(diào)控的醇溶蛋白響應(yīng)（Zeinmetabolismregulation）。這1l類元件覆蓋了植物對各種內(nèi)部激素和外部環(huán)境因素的反應(yīng)方式，以及在特定生長階段和組織中的表達(dá)調(diào)控，反映了A s T L P s 參與了多種生物學(xué)過程

2.5AsTLP在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

基于鑒定到的 A s T L P s 基因ID，在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中提取不同脅迫時(shí)間及不同部位間 A s T L P s 的相對表達(dá)量，并繪制對應(yīng)熱圖（圖6）。由圖可知，部分 A s T L P s 成員在不同組織中具有明顯的表達(dá)差異，如 A s T L P 9 ， A s T L P 1 2 ， A s T L P 1 7 ， A s T L P 2 4 ，AsTLP28和 A s T L P 2 9 在燕麥根系的表達(dá)量顯著高于葉片（ ，而AsTLP23（ 、AsTLP26（ 和 在燕麥葉片組織中的表達(dá)量顯著高于根系。

基于干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)4個(gè) A s T L P s 在干旱脅迫下的表達(dá)量上升（圖7）。其中 A s T L P 2 與 A s T L P 4 的表達(dá)模式相似，即不同處理時(shí)間下 A s T L P 2 與 A s T L P 4 在受脅迫葉片中的表達(dá)量顯著高于正常葉片，而僅在 時(shí)在受脅迫根系中表達(dá)量顯著高于正常根系（ ，且AsTLP4在受脅迫葉片中的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。而在不同組織和不同處理時(shí)間下，AsTLP14與 A s T L P 3 2 的表達(dá)量均在受脅迫材料中顯著高于正常材料（ 。因此，A s T L P 2 ， A s T L P 4 ， A s T L P 1 4 和AsTLP32可能是燕麥響應(yīng)干旱脅迫的潛在基因，其具體功能有待深入研究。

處理 正常葉片 干旱葉片 正常根系 干旱根系 Treatments Normal leaves Leavesunderdrought stress Normal roots Rootsunderdroughtstress at 0'0 a a aa a aT a bt b bT b b s s 1 00 00 ） aT a at b Jii a at bT b bb bt bT C 1C C C CT 1 1 5 1 00 0 6h 12h 24h 6h 12h 24h 處理時(shí)間Time 處理時(shí)間Time

Note：Lowercase letters indicate significantdiferences between organizations at theO.O5 level

3討論

燕麥作為全球農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中重要的糧食及飼料作物，因其優(yōu)良的營養(yǎng)價(jià)值與廣泛的氣候適應(yīng)性而備受重視[28]。因此，探索燕麥在干旱脅迫下的分子響應(yīng)機(jī)制具有重要的科學(xué)與實(shí)用價(jià)值。TLP是一類在動(dòng)植物中廣泛參與多種生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)，盡管這一蛋白家族的成員數(shù)量較少，它們卻是植物應(yīng)對非生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分[9-12]。Zeng等人在多個(gè)物種完成TLP基因家族的鑒定[29]，包括小麥（Triticumaestivum）大麥（Hordeum vulgare）高粱（Sorghumbicolor）、水稻、玉米（Zeamays）等，其家族成員數(shù)量從9到35個(gè)不等，其TLP蛋白的分子質(zhì)量通常在33.1至 之間，理論pI在9.01至10.15之間。本研究從六倍體栽培燕麥基因組中鑒定出32個(gè) A s T L P s ，數(shù)量與六倍體小麥中鑒定到的35個(gè)成員相當(dāng)[29]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)燕麥的AsTLP蛋白的分子質(zhì)量范圍為26.99至60.69 ，理論等電點(diǎn)（pI）為9至9.58，這與大部分植物TLP蛋白家族成員均屬于堿性蛋白的情況一致，說明 T L P 在進(jìn)化上的保守性?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，僅motif7和motif10在不同組間存在明顯差異，推測這兩個(gè)motif是影響 A s T L P 成員種內(nèi)變異的主要因素。而至少有5個(gè)保守motif在所有 A s T L P s 中檢測到，這與Zeng等人在多物種TLP家族的對比研究結(jié)果一致[29]，且AsTLPs的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量與擬南芥中的TLP相似1°，這進(jìn)一步證明了燕麥TLP在進(jìn)化上具有高度保守性。

以往有關(guān)TLP的研究集中在植物發(fā)育和植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[29]，在各類非生物脅迫中，干旱是影響牧草質(zhì)量和產(chǎn)量的主要因素之一[30]，此前的報(bào)道也已證實(shí) T L P 在提高植物的抗旱性中的重要作用，例如在大豆中， G m T L P 8 的過表達(dá)能顯著提高大豆對干旱和鹽脅迫的耐受性[31]；蘋果MdTLP7基因可以提高植物對干旱的耐受性，而MdTLP7的定點(diǎn)誘變則降低了其耐旱性12；番茄中STLFP8可以通過改變表皮細(xì)胞大小并降低氣孔密度來調(diào)節(jié)葉片的蒸騰作用，進(jìn)一步提高植物水分利用效率[32]。

啟動(dòng)子是基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程中的重要調(diào)控元件，本研究通過對AsTLP啟動(dòng)子中順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)AsTLP基因啟動(dòng)子區(qū)包含的作用元件包含了大量的非生物脅迫響應(yīng)元件，除了常規(guī)的光、低溫和干旱脅迫響應(yīng)元件外，還擁有大量的萊莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、生長素等重要的響應(yīng)元件。通過對4個(gè)可能調(diào)控燕麥干旱耐受性的基因（ A s T L P 2 ， A s T L P 4 ， A s T L P 1 4 和AsTLP32）研究發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)間內(nèi)均擁有兩個(gè)及以上的干旱響應(yīng)元件，此外，大量的非生物響應(yīng)元件也暗示了A s T L P s 基因復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，可能廣泛地參與了燕麥的生長發(fā)育過程。通過對比AsTLPs在植株的根部和葉片中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)共有9個(gè) A s T L P s 在不同組織間表達(dá)呈現(xiàn)出特異性表達(dá)，其中6個(gè)表明A s T L P s 基因在燕麥中存在一定的功能分化，具備多樣的生物學(xué)功能。因此，后續(xù)通過針對不同的AsTLP成員在多種環(huán)境壓力下的表達(dá)模式進(jìn)行探索，有望深入理解這些基因在燕麥適應(yīng)環(huán)境壓力與植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)理。

4結(jié)論

本研究通過對六倍體燕麥全基因組中的TLP基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定，鑒定出了32個(gè)AsTLP成員，揭示了 A s T L P 基因在進(jìn)化歷史中的高度保守性。此外，干旱脅迫下的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)其在不同組織和應(yīng)對環(huán)境脅迫中的表達(dá)差異，例如葉片中AsTLP14與AsTLP32的表達(dá)量在干旱脅迫下顯著提高。這為進(jìn)一步探索燕麥在逆境響應(yīng)中的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，并為燕麥這一重要的糧飼兼用作物的遺傳改良研究提供了方向。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）