22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料染色體數(shù)目及遺傳多樣性分析

Abstract： Pennisetum and Arundo are important species of Juncao，and some of them have the problems in name confusion and inaccurate chromosome number. In this study，chromosome sectioning technology，SRAP and SSR molecular markers were used to identify the number of chromosomes and analyze the genetic diversity of 22 materials of Penmisetum and 1 species of Arundo （Arundo donax ‘Lyuzhou No.1'）. The results of chro mosome counting showed that the chromosome number of Penmisetum was 28，allof them were tetraploid， while the chromosome number of Arundo donax‘Lyuzhou No. was 110. A total of 296 bands were amplified by twelve pairs of SRAP primers and six pairs of SSR primers，including 277 polymorphic bands. The polymorphic rate was 9 5 . 5 % . The genetic distance ranged from O.O6l to O.9O5. The cluster analysis showed that 23 materials were classified into 7 groups with a genetic similarity coeffcient of O.77. The first category included 13 materials，including（P. glaucum × P . purpureum） × P purpureum‘Guimu No.1’，P. purpureum × P tyhoideum‘RY No. ，P. glaucum × P ：purpureum- FD and so on. P. purpureum‘Mott’，P.

purpureum‘Purple’ and P ：purpureum- JC-ZJ were clustered into the second，third and sixth categories， respectively. P ：purpureum‘Guiminyin’and P ：purpureum from Xichang were clustered into the fourth category. The remaining four P . purpureum were clustered into fifth category. Arundo donax‘Lyuzhou No.1' was clustered into the seventh category at the bottom，which had the farthest relationship with other Penisetum materials.Through chromosome number identification and molecular markers，the 22 materials of Penmisetum andl material of Arundo were accurately identified and the genetic relationship between them was analyzed， which provided some reference for standardizing the names of market materials and variety breeding. Key words： Pennisetum；Arundo； Chromosome number；SRAP ；SSR； Genetic diversity

菌草是指所含營養(yǎng)適用食用菌、藥用菌等微生物生長需要，且具有綜合開發(fā)利用價(jià)值的草本植物，包括蘆葦屬（Phragmites）、狼尾草屬（Pennis-etum）蘆竹屬（Arundo）芒屬（Miscanthus）等20多個(gè)屬，不僅可作為食（藥）用菌培養(yǎng)基，還在生態(tài)環(huán)境建設(shè)、畜牧業(yè)發(fā)展以及能源開發(fā)利用等方面發(fā)揮著重要作用1。狼尾草屬隸屬禾本科（Poaceae），是一年生或多年生的草本植物，全世界約有140種，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，少數(shù)種類可達(dá)溫寒地帶，非洲為其分布中心，我國大部分地區(qū)也有狼尾草屬植物的分布[2]。象草（Pennisetum purpureum）為狼尾草屬植物中一種利用廣泛的多年生優(yōu)質(zhì)牧草，具有生長速度快、生物量大、營養(yǎng)豐富以及耐旱等優(yōu)點(diǎn)[3]。狼尾草屬育種受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，培育出不少新的狼尾草品種。截止2023年，我國共審定登記23個(gè)狼尾草屬品種，其中引進(jìn)品種6個(gè)，育成品種13個(gè)，例如‘摩特'矮象草（P.purpureum‘Mott'）、‘德宏’象草（P.purpureum‘Dehong'）、‘熱研4號’雜交狼尾草（P.purpureum × P tyhoi-deum‘ReyanNo.4’）以及‘長穗'狼尾草（ ？ P alopecuroides‘Changsui'）等[3]。綠洲1號'菌草（Arundodonax‘LyuzhouNo.1'）屬于禾本科蘆竹屬植物，由國家菌草工程技術(shù)研究中心選育，其株形高大、枝葉繁茂且適口性好，是良好的牲畜飼料；根系發(fā)達(dá)，抗逆性較強(qiáng)，具有潛在的生態(tài)價(jià)值[4]。

國內(nèi)使用的狼尾草品種較多，有些品種形態(tài)極為相似，且通過種莖進(jìn)行無性繁殖，在人工和環(huán)境等多因素的影響下，導(dǎo)致材料混亂，出現(xiàn)同名異物或同物異名的現(xiàn)象，致使育種工作者無法準(zhǔn)確鑒定種質(zhì)信息，不利于育種進(jìn)程[3.5]。近年來，已有部分學(xué)者利用細(xì)胞學(xué)對狼尾草屬牧草進(jìn)行鑒定分析，如朱丹丹5對24種常用菌草進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析，結(jié)果表明巨菌草與象草的染色體數(shù)目相同，核型均屬2A型；馮喜6對收集到的三倍體狼尾草屬材料‘熱研4號’雜交狼尾草進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其染色體為28條，與四倍體象草的染色體數(shù)目相同。

蘆竹屬植物的染色體數(shù)目多、長度較小，有84，108，110，112條等不同的報(bào)道[7-11]。因此，對狼尾草屬和蘆竹屬材料進(jìn)行精準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)鑒定，明確其染色體數(shù)目，有助于它們的高效利用。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記，具有高度多態(tài)性、分布均勻、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可從DNA水平揭示不同材料間的遺傳差異[12]，是用于居群遺傳多樣性分析的有力工具[13-14]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism，SRAP）分子標(biāo)記是一種基于PCR的新型標(biāo)記，因其便捷、高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[15-16]。采用兩種或兩種以上的分子標(biāo)記結(jié)合使用可以提高多態(tài)性位點(diǎn)的覆蓋率和均勻度，彌補(bǔ)單一種類分子標(biāo)記帶來的局限性和弊端，從而提供更加準(zhǔn)確、全面的遺傳信息[17]。目前，在兜蘭[18]、黃精[19]和薄荷[20]等的材料中均有采用多種分子標(biāo)記結(jié)合進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究。Kandel等21研究珍珠粟與象草間的SSR分子標(biāo)記的跨種可轉(zhuǎn)移性，成功提供了一套可用于評價(jià)象草資源的遺傳多樣性標(biāo)記。L6pez等22從16份象草種質(zhì)的3536個(gè)DNA序列中開發(fā)SSR分子標(biāo)記，為象草及其近緣種的深入遺傳研究提供支持。Wang等[23]利用篩選出來的20對高多態(tài)性SSR引物，對24個(gè)狼尾草品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。石秀蘭等24采用SRAP技術(shù)對13份狼尾草屬材料進(jìn)行有效區(qū)分；姚運(yùn)法等25利用SRAP技術(shù)分析了19份狼尾草屬材料的遺傳關(guān)系；Gunguniya等[26]將SSR與SRAP兩種分子標(biāo)記結(jié)合對珍珠粟進(jìn)行聚類分析，更加準(zhǔn)確的揭示遺傳多樣性。

狼尾草屬牧草品種存在同名異物和同物異名的混亂現(xiàn)象，染色體數(shù)目存在爭議，而蘆竹屬植物染色體多且形態(tài)小，難以準(zhǔn)確鑒定其數(shù)目。本文對22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定及遺傳多樣性分析，研究結(jié)果為規(guī)范市場材料名稱以及品種選育提供一定參考。

1 材料與方法

1 供試材料

供試材料共包括22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料。狼尾草屬材料包括雜交狼尾草、摩特矮象草、‘桂牧1號’雜交象草［（P.glaucum × P purpureum） × P ：purpureum‘GuimuNo.1']、‘德宏'象草、‘桂閩引'象草 （ P . purpureum‘Guiminyin'）、RYNo.4以及‘紫色’象草 （ P . purpureum‘Purple'）等，其采集地包括四川、廣西以及海南等地；蘆竹屬材料為‘綠洲1號'菌草。材料詳細(xì)信息見表1。

2 根尖染色體制片

參考Komuro等2滴片法制備根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體，其中本試驗(yàn)根尖酶解時(shí)間為 左右，每份材料統(tǒng)計(jì)5個(gè)以上完整細(xì)胞。待載玻片自然干燥后滴加 DAPI，蓋上蓋玻片于熒光顯微鏡BX63（Olympus，Japan）下觀察并拍照。

3 分子標(biāo)記

3.1DNA提取采用改良CTAB法對植物新鮮嫩葉進(jìn)行總DNA提取[28]。每份材料隨機(jī)選取10個(gè)單株葉片等量混合提取DNA。用 1 . 5 % 瓊脂糖凝膠（加核酸染料）電泳檢測DNA質(zhì)量，然后在NanoDropone分光光度計(jì)測定所提取DNA樣品的濃度，最后將合格的DNA樣品作為備用母液保存于一 冰箱。將DNA母液取出一部分稀釋至 ，放于 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2引物合成及PCR擴(kuò)增本研究選取石秀蘭等[24]針對狼尾草從72對SRAP引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的16對引物（表2）和王成然[29]以象草為試驗(yàn)材料從70對SSR引物中篩選的7對多態(tài)性最高的引物（表3），對供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

SRAP-PCR反應(yīng)采用 體系：PCR-Mix10 ，模板DNA ，正、反向引物各 ，TaqDNA 聚合酶 ）， 補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 6 變性 退火 、 延伸 個(gè)循環(huán)； 變性 退火 延伸 ，35個(gè)循環(huán)； 延伸 保存。

SSR-PCR反應(yīng)采用 體系：PCR-Mix7.5 ，模板DNA ，正、反向引物各 ，TaqDNA聚合酶 。 補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 變性 退火 延伸 ，共35個(gè)循環(huán)； 延伸 ，于 保存。

兩種PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

表216對SRAP引物序列信息

4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與聚類分析

參照程少波等[30]和石秀蘭等[31]的方法對毛細(xì)管電泳得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與聚類分析。在PROSize3.O軟件上統(tǒng)計(jì)同一引物目標(biāo)片段± 5 0 bp范圍內(nèi)的條帶，在相同位點(diǎn)有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為\"O”，利用Excel表格將兩種分子標(biāo)記的原始數(shù)據(jù)一同轉(zhuǎn)化為 矩陣，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增總條帶數(shù)（Totalnumberofbands，TNB）多態(tài)性條帶數(shù)（Number of polymorphic bands，NPB）、多態(tài)性百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB）。采用Popgene32軟件計(jì)算基因多樣性指數(shù)（Genediversityindex，H）、多態(tài)性信息量（Ploymorphisminformationcontent，PIC）和香農(nóng)信息指數(shù)（Shannon's information index，I）。通過NTSYS-pc10e軟件計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA（Unweighted pair group method using arithmeticaverages，非加權(quán)成對算術(shù)平均法）做出聚類圖。

2 結(jié)果與分析

1染色體數(shù)目鑒定

對22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料，利用根尖染色體制片法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。結(jié)果顯示：22份狼尾草屬材料染色體數(shù)目均為 2 n = 2 8 條（圖1A-V），染色體基數(shù) x = 7 ，為四倍體。其中，雜交狼尾草、‘桂牧1號‘雜交象草和RYNo.4這三種材料在前人報(bào)道中為三倍體，本試驗(yàn)結(jié)果顯示為四倍體， 2 n = 2 8 （ 圖1）。

‘綠洲1號'菌草為蘆竹屬植物，其染色體數(shù)目有報(bào)道為48，96，108，110條等。本試驗(yàn)通過染色體滴片法，發(fā)現(xiàn)‘綠洲1號'菌草的染色體數(shù)目為110條（圖 ， 。

注：（A）雜交狼尾草-FD；（B）‘摩特’矮象草；（C）RYNo.4-1；（D）RYNo.4-2；（E）‘桂牧1號'雜交象草；（F）‘桂牧1號'雜交象草-LZ；（G） ‘桂牧1號'雜交象草-CD；（H）‘德宏’象草；（I）‘桂閩引'象草；（J）‘紫色'象草；（K）臺畜2號象草；（L）象草-XC；（M）象草-LP；（N）象草 -YNA；（O）象草-YNB；（P）JMLC-DY；（Q）LBLC；（R）蘆干草-XJ；（S）巨菌草-J2；（T）巨菌草-2008；（U）巨菌草-ZJ；（V）菌草-ZJ； （20號 ‘綠洲1號'菌草， 中的紅色數(shù)字是對 中染色體數(shù)目的標(biāo)記；刻度尺： （20號

Note：（A）P.glaucum × P . purpureum-FD；（B） P. purpureum‘Mott’；（C）P. purpureum × P tyhoideum‘RY No.4’-1；（D） P. purpureum × P . tyhoideum‘RY No.4'-2；（E） （P. glaucum × P . purpureum） purpureum‘Guimu No.1'；（F） （P. glaucum × P . purpureum） × P. purpureum ‘Guimu No.1' -LZ； （G） （P. glaucum × P purpureum） × P purpureum ‘Guimu No.1'-CD；（H） P. purpureum‘Dehong' ； （I）.P.purpureum‘Guiminyin’；（J）P.purpureum‘Purple'；（K） P purpureum-TXNo.2；（L）P.purpureum-XC；（M）P.purpureum-LP； （N）P. purpureum-YNA；（O）P. purpureum-YNB；（P） P. purpureum-JMLC-DY；（Q）P. purpureum-LBLC； （R）P. purpureum-LGCXJ；（S）P. purpureum-JJC-J2；（T）P.purpureum-JJC-2008；（U）P. purpureum-JJC-ZJ；（V）P. purpureum-JC-ZJ； Arundo donax ‘Lyuzhou No.1'，the red number in indicates a marker of chromosome number in ； Scalebar， （204

2 遺傳多樣性分析

1 SRAP與SSR標(biāo)記多態(tài)性分析 利用前人篩選出的狼尾草高多態(tài)性16對SRAP和7對

SSR標(biāo)記引物對22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探究品種間親緣關(guān)系及遺傳多樣性[24.29]。結(jié)果表明：12對（占比 7 5 . 0 % ）

SRAP和6對（占比 8 5 . 7 % ）SSR引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶。綜合SRAP和SSR兩種分子標(biāo)記，共擴(kuò)增出296條帶，其中多態(tài)性條帶277條，多態(tài)性比率為 9 5 . 5 % ，平均每條引物擴(kuò)增出15.4條；PIC變化幅度為 ，引物SSR9的PIC最低為0.375，引物F1R1的PIC最高為0.643，平均多態(tài)性信息含量為0.543；18對引物1變化范圍為 ，平均為094；H變幅為 0 . 5 0 0 ～ 0.699，平均基因多樣性指數(shù)為0.619（表4，圖2-3）。

注：1～23為材料序號，同表1

Note：Representedmaterials1＼～23are listed in Table1

2遺傳距離分析遺傳距離是衡量群體之間遺傳分化的指標(biāo)，遺傳距離數(shù)值越低說明親緣關(guān)系越近。23份材料的遺傳距離變化范圍為 0 . 0 6 1 ～ 0.905，‘綠洲1號'菌草與22份狼尾草屬材料的遺傳距離較大，其中‘綠洲1號'菌草和象草-XC的遺傳距離為最大值0.905，說明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；巨菌草-ZJ和巨菌草-J2的遺傳距離為最小值0.061，說明兩個(gè)材料間的親緣關(guān)系最近（表5）。

3聚類分析遺傳相似系數(shù)可以反映不同品種間的親緣關(guān)系，遺傳相似系數(shù)越大，表明遺傳關(guān)系越接近。聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.77處，將23份材料分為七大類：第I類包括‘桂牧1號'雜交象草、RYNo.4、臺畜2號象草、巨菌草、雜交狼尾草等13份材料，其中巨菌草-ZJ和巨菌草-J2聚為一小支，遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.95，親緣關(guān)系極近，而臺畜2號象草與三種‘桂牧1號'雜交象草單獨(dú)為一小支；‘摩特'矮象草、紫色'象草及菌草-ZJ三者分別單獨(dú)聚為第Ⅱ、ⅢI、V類；‘桂閩引'象草與來自西昌的象草聚為第Ⅳ類；‘德宏'象草與象草-YNA、象草-YNB及象草-LP聚為第V類；‘綠洲1號'菌草最早與22份狼尾草屬材料分開，在最底部聚為第VII類（圖4）。

3討論

國內(nèi)廣泛利用的狼尾草屬牧草主要為多年生的象草以及象草與美洲狼尾草（P.glaucum）的雜交種，具有生長速度快、產(chǎn)量大、營養(yǎng)物質(zhì)豐富等特點(diǎn)，是高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、安全的動(dòng)物飼料和菌草材料，在我國畜牧業(yè)中發(fā)揮著重要的作用[2]。

染色體數(shù)目是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一。關(guān)于狼尾草屬品種的染色體數(shù)目有不同的報(bào)道，Yan等[32采用根尖制片法統(tǒng)計(jì)‘紫色'象草染色體數(shù)目為28條；羅宗志等[33-34]以‘熱研4號'雜交狼尾草、雜交狼尾草和‘桂牧1號‘雜交象草為試驗(yàn)材料，通過常規(guī)壓片法制備染色體發(fā)現(xiàn)三者染色體數(shù)目21條，為三倍體；然而，馮喜對收集到的‘熱研4號'雜交狼尾草通過制片發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目28條，為四倍體。

‘熱研4號'雜交狼尾草、雜交狼尾草和‘桂牧1號’雜交象草為國家審定品種，均為三倍體[2]。本研究利用染色體制片方法，對來自四川、廣西以及海南等地區(qū)的狼尾草材料進(jìn)行直接的染色體數(shù)目觀察，結(jié)果表明：‘紫色'象草、‘桂閩引'象草、巨菌草、雜交狼尾草、RYNo.4、‘桂牧1號'雜交象草、‘德宏象草等22份狼尾草屬材料均為28條染色體，為四倍體。其中，‘桂牧1號'雜交象草和雜交狼尾草的染色體數(shù)目與前人的結(jié)果不一致[33]，‘熱研4號'雜交狼尾草則與部分學(xué)者相同[6。造成這種現(xiàn)象的原因，可能是材料混淆導(dǎo)致。這些狼尾草屬材料形態(tài)相似、難以區(qū)分，且主要通過種莖進(jìn)行無性繁殖擴(kuò)繁，因此，可能存在同名異物或同物異名的現(xiàn)象。因此，開發(fā)每一個(gè)品種的DNA指紋圖譜，對其進(jìn)行“身份”認(rèn)證，有助于品種的真實(shí)性身份鑒定。

蘆竹屬植物的染色體數(shù)目多，且染色體小，鑒定難度較大。目前，其染色體數(shù)目已有84條[10]、108條[11]、110條[8-9]和112條[7]等不同的報(bào)道?！G洲1號'菌草為蘆竹屬植物，本研究通過染色體制片計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)：‘綠洲1號'菌草的染色體數(shù)目為110條，與前人結(jié)果一致[8-9]。

分子標(biāo)記應(yīng)用于狼尾草研究起步較晚但發(fā)展很快，已在狼尾草屬種質(zhì)資源的品種鑒定、系統(tǒng)分類、遺傳多樣性檢測和遺傳圖譜構(gòu)建等方面發(fā)揮了重要作用[35-36]。陳碧成等[37]利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行狼尾草遺傳多樣性分析，結(jié)果表明巨菌草、‘熱研4號雜交狼尾草和‘桂牧1號'雜交象草聚在同一小支，表明三者的親緣關(guān)系較近。姚運(yùn)法等25采用SRAP分子標(biāo)記將19份狼尾草屬材料分為三類，雜交狼尾草單獨(dú)為一支；巨菌草、‘紫色'象草、桂牧1號'雜交象草等聚為一支；象草、摩特'矮象草和閩牧1號等聚為一支。Gunguniya等[26]利用SSR與SRAP兩種分子標(biāo)記綜合進(jìn)行聚類分析，對48份美洲狼尾草材料進(jìn)行聚類分析，更加準(zhǔn)確的揭示了其遺傳多樣性。本研究采用SRAP和SSR兩種分子標(biāo)記綜合進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)0.77處將23份材料分為七類，其中，巨菌草、‘熱研4號‘雜交狼尾草和‘桂牧1號'雜交象草聚為一類，與前人結(jié)果[37]-致，說明這三類材料的親緣關(guān)系較近；‘摩特'矮象草、紫色'象草及菌草-ZJ各自單獨(dú)聚為一類，表明它們與其他狼尾草屬材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而‘綠洲1號'菌草聚在最底部，與22份狼尾草屬材料親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果一致，綠洲1號'菌草染色體數(shù)目為110，而22份狼尾草屬材料都為2 n = 2 8 。

綜上，本研究通過對22份狼尾草和1份蘆竹屬材料進(jìn)行染色體數(shù)目和遺傳多樣性分析可知，國內(nèi)狼尾草屬牧草的使用存在一定的混亂問題，市面上流通的部分三倍體狼尾草品種，如RYNo.4和‘桂牧1號'雜交象草，可能為四倍體，而不是三倍體。

4結(jié)論

本研究利用染色體制片技術(shù)對22份狼尾草屬材料和1份蘆竹屬材料進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定，結(jié)果表明巨菌草、‘桂牧1號'雜交象草、RYNo.4、‘紫色'象草和‘摩特'矮象草等22份狼尾草屬材料的染色體數(shù)目均為28條，為四倍體；‘綠洲1號’菌草的染色體數(shù)目為110條。SRAP和SSR分子標(biāo)記綜合聚類分析將23份材料劃分為七大類：第1類包括‘桂牧1號'雜交象草、RYNo.4、臺畜2號象草、雜交狼尾草-FD等13份材料；‘摩特'矮象草、‘紫色’象草及菌草-ZJ三者分別聚為第Ⅱ、ⅢI、V類；‘桂閩引'象草與來自西昌的象草聚為第Ⅳ類；‘德宏'象草與象草-YNA、象草-YNB及象草-LP聚為第V類；‘綠洲1號菌草'在最底部聚為第V類，與其他狼尾草屬材料關(guān)系最遠(yuǎn)。

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（責(zé)任編輯付宸）