高效靶向示蹤鈣鈦礦納米系統(tǒng)光電增效抗腫瘤

摘要：金屬鹵化物鈣鈦礦由于其多維度的晶體結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的熒光成像/示蹤及光電轉(zhuǎn)換性質(zhì)，使其成為一種非常具有前瞻性的光電增效治療腫瘤材料。然而，傳統(tǒng)鹵化物鈣鈦礦納米晶的水穩(wěn)定性問(wèn)題，限制了其應(yīng)用于生物成像和光電增效腫瘤治療的藥物遞送納米系統(tǒng)研究。本文將甲氨蝶呤-殼聚糖-葉酸（MTX-CS-FA）成功與鈣鈦礦納米晶體CsSn0.5Pb0.5Br3（PeNCs）鉚釘連接，制備出了可以在水中穩(wěn)定228 d且發(fā)綠光的PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥體系。在可見(jiàn)光照射下，新型PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥體系增效抗腫瘤治療原理：鈣鈦礦納米晶體產(chǎn)生電子和活性氧（ROS）；鈣鈦礦光生空穴耗竭過(guò)表達(dá)的谷胱甘肽（GSH）；甲氨蝶呤（MTX）抑制二氫葉酸還原酶（DHFR）活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化，上述三點(diǎn)共同作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，采用小鼠移植腫瘤模型，累積用藥量達(dá)2.4mg PeNCs@MTX-CS-FA納米載藥系統(tǒng)時(shí)，腫瘤體積減少了約63.68%和腫瘤重量下降了約63.26%。通過(guò)生物安全性評(píng)估實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在治療劑量下，小鼠肝、腎等器官功能正常，說(shuō)明納米體系具有良好的生物安全性，并且研究發(fā)現(xiàn)鈣鈦礦納米顆粒經(jīng)小鼠腸道排出，小鼠糞便呈現(xiàn)出與原始鈣鈦礦晶體相同的綠色熒光，金屬鹵化物鈣鈦礦納米載藥體系在生物成像和光電催化化療方面呈現(xiàn)優(yōu)異的增效抗腫瘤治療效果。

關(guān)鍵詞：腫瘤治療；生物成像；鈣鈦礦納米顆粒；光電催化化療

中圖分類(lèi)號(hào)：O644

1 引言

光電催化將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。光電催化不僅用于能源催化[1–4]，還通過(guò)利用光誘導(dǎo)電子生成的大量活性氧（ROS） [5，6]，以及在光生空穴氧化作用下消耗谷胱甘肽（GSH） [7]，在疾病治療中發(fā)揮作用。鈣鈦礦材料由于其優(yōu)異光電轉(zhuǎn)換性能，在光伏領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[8–12]。鈣鈦礦材料具有典型的化學(xué)式ABX3，其中A代表陽(yáng)離子，B代表二價(jià)陽(yáng)離子，X代表鹵素離子[13]。鈣鈦礦材料具有較高的電子（2000 cm2?V?1?s?1）和空穴（300 cm2?V?1?s?1）遷移率[14]，以及約175 μm的長(zhǎng)載流子擴(kuò)散距離[15，16]，以上為鈣鈦礦具有優(yōu)異光電催化性能的關(guān)鍵因素。在生物成像和靶向追蹤中，具有高光致發(fā)光量子產(chǎn)率（PLQY gt; 80%） [17，18]的全無(wú)機(jī)銫鉛鹵化鈣鈦礦表現(xiàn)出巨大的前景[19–21]。Gr?tzel等[22–24]對(duì)鈣鈦礦在太陽(yáng)能電池和光催化中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究。Yang等[25，26]深入研究了鈣鈦礦材料在光催化領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，Ryu等[27]、Lian 等[28] 和Patel 等[29] 利用鈣鈦礦材料（CsPbBr3@SiO2）進(jìn)行細(xì)胞成像，發(fā)現(xiàn)了鈣鈦礦具有顯著的細(xì)胞內(nèi)熒光成像特性。在可見(jiàn)光照射下，鈣鈦礦納米顆粒將三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移到有機(jī)分子上，產(chǎn)生大量電子和空穴，進(jìn)而介導(dǎo)單重態(tài)氧（1O2）的生成[30–33]。這一優(yōu)異的光電催化能力具有應(yīng)用于抗腫瘤治療的潛力。然而，鈣鈦礦的晶體結(jié)構(gòu)易受水降解的影響[34–37]。水可引發(fā)鈣鈦礦結(jié)構(gòu)分解[38–40]，導(dǎo)致光電性能退化，最終引發(fā)細(xì)胞損傷[41]。與InP [42]、AgInS [43]、碳[44]、CdSe [45]、ZnSe [46]等光電材料相比，鈣鈦礦表現(xiàn)出更優(yōu)的整體性能，包括光電性能、穩(wěn)定性和易于加工性[47]。設(shè)計(jì)用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的鈣鈦礦納米晶體（PeNCs）面臨重大挑戰(zhàn)；例如，適用于抗腫瘤治療的鈣鈦礦材料需要具有高水穩(wěn)定性和低毒性[48，49]。提高金屬鹵化物PeNCs水抗性的常用方法包括涂覆金屬有機(jī)框架[50]、過(guò)渡金屬氧化物玻璃[51]和聚合物[52]。

在本文中， 我們利用殼聚糖（CS） 修飾CsSn0.5Pb0.5Br3鈣鈦礦納米顆粒提高其親水性，將靶向劑葉酸（FA）和化療藥物甲氨蝶呤（MTX）通過(guò)酰胺鍵與CS共軛。合成了具有水穩(wěn)定的及生物成像和抗腫瘤能力的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，并闡明了其作用機(jī)制。

2 方法

2.1 材料

Cs2CO3 （99%），PbBr2 （99%），1-十八烯（OCE）（gt; 90%），環(huán)己烷（C6H12） （99.5%），油酸（OA） （≥99%），油胺（OAm） （80%–90%），葉酸（gt; 97%），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS） （98%），冰醋酸≥ （99.8%），H2O2 （30% （wt.）水溶液），1-乙基-3-（二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） （98%） ， 二甲基亞砜（DMSO） （≥ 99%），2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮鹽酸鹽（TEMP） （98%），5，5-二甲基-1-吡咯烯-N-氧化物（DMPO） （97%）， 二甲苯（99%）， 中性膠和乙醇（99.5%）均購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。SnBr2（99.99%），乙酸甲酯（98%）購(gòu)自上海麥克林生化有限公司。殼聚糖（CS）（分子量100000–300000）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。甲氨蝶呤購(gòu)自廣東嶺南藥業(yè)有限公司。胎牛血清（FBS）生物試劑產(chǎn)自烏拉圭。DMEM不完全培養(yǎng)基生物試劑、抗熒光衰減封片液（含DAPI）生物試劑、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）生物試劑和胰蛋白酶生物試劑購(gòu)自北京索拉比奧科技有限公司。CCK-8試劑盒生物試劑和Calcein-AM/PI活/死細(xì)胞雙染色試劑盒生物試劑購(gòu)自石家莊智寶生物技術(shù)有限公司。4%多聚甲醛購(gòu)自桑根生物科技（上海）有限公司。溶酶體追蹤紅（溶酶體紅熒光探針）生物試劑、二氫乙啶（超氧陰離子熒光探針）生物試劑、單步TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）生物試劑、蘇木精-伊紅染色生物試劑和RIPA裂解緩沖液（ 強(qiáng)） 由貝達(dá)藥業(yè)科技公司（ 上海） 供應(yīng)。C57BL/6JNifdc清潔級(jí)小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司供應(yīng)。5%氯化水合物購(gòu)自上海嚴(yán)恩化學(xué)科技有限公司。四氫葉酸（THFA）檢測(cè)試劑盒生物試劑購(gòu)自云克隆公司（CCC，武漢）。抗谷胱甘肽抗體生物試劑購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。R-藻紅蛋白AffiniPure F（ab'）2片段 驢抗小鼠IgG （H+L）生物試劑購(gòu)自武漢三英生物技術(shù)有限公司。透析袋（分子量：3500）購(gòu)自南通蘇品實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。BD生物科學(xué)公司提供的BD生物科學(xué)公司透過(guò)/清洗緩沖液（BD perm/wash）和BD Cytofix/Cytoperm?細(xì)胞固定/透過(guò)化試劑盒。

2.2 CsSn0.5Pb0.5Br3、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的合成

2.2.1 熱注射法合成三維鈣鈦礦CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體（NCs）

具體步驟如下：

（1） 前驅(qū)體溶液的制備

將0.5 mmol PbBr2和0.5 mmol SnBr2溶解于0.5mL 1-十八烯（ODE）中，在120 °C下攪拌，直至PbBr2和SnBr2完全溶解，得到前驅(qū)體溶液。然后加入1mL油酸（OA）和1.5 mL油胺（OAm）并繼續(xù)攪拌。

（2） 油酸銫（Cs-OL）的制備

將0.16 g Cs2CO3溶解于1 mL油酸和16 mL 1-十八烯中，在120 °C下攪拌，直到Cs2CO3完全溶解，得到油酸銫（Cs-OL）。

（3） 油酸銫的注入

將油酸銫溶液注入前驅(qū)體溶液中。經(jīng)過(guò)5 min反應(yīng)，溶液變?yōu)闇啙岬陌咨珷顟B(tài)。

（4） 離心和沉淀

將白色懸浮液冷卻至室溫， 然后以6000r?min?1的速度離心15 min，獲得白色沉淀。

（5） 超聲分散

向白色沉淀中加入20 mL環(huán)己烷，超聲處理30min。沉淀均勻分散在環(huán)己烷中，得到零維的Cs4Sn0.5Pb0.5Br6納米晶體（NCs）。該溶液存儲(chǔ)在4 °C環(huán)境下以供后續(xù)使用。

（6） CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs的制備

向5 mL NCs-環(huán)己烷溶液中加入1 mL去離子水，攪拌至溶液變?yōu)榫G色。待顏色穩(wěn)定后，超聲混合溶液2–10 min。最后，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾該溶液，得到 CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs溶液。

2.2.2 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒的合成

（1） 按照第2.2.1 節(jié)的描述， 準(zhǔn)備Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液。

（2） 將殼聚糖溶解在1%冰醋酸中，制備濃度為0.001 g?mL?1的殼聚糖溶液。

（3） 攪拌Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液，并緩慢將殼聚糖溶液以體積比5 ： 1加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br6 NCs溶液中。此時(shí)白色溶液會(huì)逐漸變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合溶液進(jìn)行超聲處理2–10 min，然后用直徑為0.22 μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。所得到的濾液即為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3納米顆粒溶液，本文中稱(chēng)其為CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒。接著，使用甲基乙酸乙酯進(jìn)行萃取，甲基乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ： 2。將萃取液進(jìn)行6000 r?min?1的離心15 min，之后將沉淀在真空烘箱中干燥，獲得CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒粉末。

2.2.3 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒的合成

（1） 將葉酸（FA）溶解于DMSO中，制備濃度為1 mg?mL?1的FA溶液。隨后，向溶液中加入濃度為0.066 g?mL?1 的C8H18ClN3 （EDC） 和濃度為0.036g?mL?1的C4H5NO3 （NHS）。在室溫下攪拌混合物，直到EDC和NHS完全溶解，得到FA溶液。

（2） 將殼聚糖（CS）溶解于1%的冰醋酸中，制備濃度為0.001 g?mL?1的CS溶液。

（3） 按體積比1 ： 5將FA溶液與CS溶液混合，在室溫下反應(yīng)，形成CS-FA溶液。

（4） 將CS-FA 溶液按體積比1 ： 5 加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br6溶液中，溶液逐漸由白色變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合液在超聲波清洗器中處理2–10 min，接著用0.22 μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。濾液為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒溶液。使用乙酸乙酯進(jìn)行提取，乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ：2。將提取液以6000 r?min?1的速度離心15 min，隨后將沉淀在真空烘箱中干燥， 得到CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒粉末。

2.2.4 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的合成

（1） 按照第2.2.3節(jié)的方法制備CS-FA溶液。

（2） 將甲氨蝶呤（MTX）溶解于DMSO中，制備濃度為0.001 g?mL?1的MTX溶液。隨后，向溶液中加入濃度為0.013 g?mL?1的C8H18ClN3 （EDC）和濃度為0.007 g?mL?1的C4H5NO3 （NHS）。在室溫下攪拌混合物，得到MTX溶液。

（3） 將CS-FA溶液按體積比1 ： 1加入MTX溶液中，在室溫下反應(yīng)，得到MTX-CS-FA溶液。

（4） 將MTX-CS-FA溶液按體積比1 ： 1加入Cs4Sn0.5Pb0.5Br?溶液中，溶液逐漸由透明變?yōu)榫G色。待溶液顏色穩(wěn)定后，將混合液在超聲波清洗器中處理2–10 min，接著用0.22 μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。得到的溶液為殼聚糖包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒溶液。使用乙酸乙酯進(jìn)行提取，乙酸乙酯與濾液的體積比為1 ： 2。將提取液以6000 r?min?1的速度離心15 min，隨后將沉淀在真空烘箱中干燥， 得到CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒粉末。

2.3 材料表征

使用FEI Talos F200S 顯微鏡獲取CsSn0.5Pb0.5Br3 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒的TEM圖像。使用UV/Vis 1050 FTIR儀器對(duì)CS、FA、MTX、CsSn0.5Pb0.5Br3和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析。使用Shimadzu AXI Sultra DLD和D8ADVANCE 儀器進(jìn)行CsSn0.5Pb0.5Br3 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的X射線光電子能譜（XPS）和X射線衍射（XRD）分析。使用Thermo Fisher Escalab Xi+、UV/Vis 1050和FS5光譜儀對(duì)CsSn0.5Pb0.5Br3、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的紫外光電子譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜進(jìn)行表征。使用自開(kāi)發(fā)的多功能原子力顯微鏡進(jìn)行開(kāi)爾文探針力顯微鏡（KPFM）測(cè)試，儀器配備N(xiāo)T-MDTSMENA探頭。測(cè)試使用HA-FM/Pt導(dǎo)電探針進(jìn)行，測(cè)試結(jié)果通過(guò)開(kāi)源軟件Gwyddion進(jìn)行分析和繪制。

2.4 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)

為了證明納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用，進(jìn)行細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，使用共聚焦顯微鏡FV1000（奧林巴斯，日本） [53]。

2.4.1 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒的細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)

（1） 將細(xì)胞蓋玻片放置于24孔板每個(gè)孔的底部，接種LLC細(xì)胞，密度約為2 × 104個(gè)細(xì)胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細(xì)胞三次，去除未吸附的量子點(diǎn)。

（5） 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細(xì)胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細(xì)胞蓋玻片，將其（細(xì)胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質(zhì)的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風(fēng)干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細(xì)胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.4.2 CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒的細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)

（1） 將細(xì)胞蓋玻片放置于24孔板每個(gè)孔的底部，接種LLC和C2C12細(xì)胞，密度約為2 × 104個(gè)細(xì)胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細(xì)胞三次，去除未吸附的量子點(diǎn)。

（5） 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細(xì)胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細(xì)胞蓋玻片，將其（細(xì)胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質(zhì)的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風(fēng)干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細(xì)胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.4.3 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)

（1） 將細(xì)胞蓋玻片放置于24孔板每個(gè)孔的底部，接種LLC細(xì)胞，密度約為2 × 104個(gè)細(xì)胞/孔。

（2） 將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（3） 去除培養(yǎng)基，加入濃度為200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

（4） 丟棄培養(yǎng)基，使用PBS沖洗細(xì)胞三次，去除未吸附的量子點(diǎn)。

（5） 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為75 nmol?L?1的Lyso-Tracker Red，37 °C下孵育45 min。

（6） 使用PBS沖洗細(xì)胞三次。

（7） 加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，固定30 min后，用PBS沖洗三次。

（8） 去除細(xì)胞蓋玻片，將其（細(xì)胞面朝下）放置到含有DAPI封片介質(zhì)的玻片上。

（9） 將玻片在黑暗中自然風(fēng)干。

（10） 使用共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，日本）觀察并捕捉圖像。細(xì)胞核用DAPI染色，并在405 nm 激光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。用Lyso-Tracker Red染色的溶酶體在559 nm激光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

2.5 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8 試劑盒評(píng)估細(xì)胞增殖， 分析CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的細(xì)胞毒性，使用全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀[5]。LLC細(xì)胞接種于96孔板（細(xì)胞密度：1 × 105個(gè)細(xì)胞/孔），并在37 °C下培養(yǎng)24 h。隨后，去除培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入不同濃度的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒溶液（0， 25， 50， 75， 100， 125， 150， 175， 200μg?mL?1），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

接下來(lái)，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量每孔的光密度（OD），并記錄結(jié)果。

細(xì)胞存活率（%）計(jì)算公式為[（As ? Ab）/（Ac ?Ab）] × 100，其中As為實(shí)驗(yàn)孔的吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8及測(cè)試化合物），Ab為空白孔的吸光度（含培養(yǎng)基和CCK-8），Ac為對(duì)照孔的吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8）。

2.6 活細(xì)胞與死細(xì)胞染色

活細(xì)胞與死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)用于展示納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)，使用倒置熒光顯微鏡IX71儀器進(jìn)行觀察[54]。

2.6.1 溶液的制備

1×檢測(cè)緩沖液的制備：從低溫冰箱中取出10×檢測(cè)緩沖液，按照無(wú)菌條件取適量，并用去離子水稀釋至10×，得到1×檢測(cè)緩沖液。

1×染色工作溶液的制備：將儲(chǔ)存的Calcein-AM溶液（2 mmol?L?1）和PI溶液（1.5 mmol?L?1）在室溫下平衡20–30 min。取5 μL Calcein-AM溶液（2mmol?L?1）和15 μL PI溶液（1.5 mmol?L?1），將其加入5 mL的1倍檢測(cè)緩沖液中，充分混合，得到濃度為2 μmol?L?1的Calcein-AM和4.5 μmol?L?1的PI的工作溶液。

2.6.2 染色

將對(duì)照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 組（200 μg?mL?1） 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒組（200μg?mL?1）溶液加入到接種適當(dāng)密度的LLC細(xì)胞（50%–60%）的6孔板中，孵育24 h。用胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，并通過(guò)離心（1000 r?min?1，3 min）收集細(xì)胞。去除上清液后，用1× Assay緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的酯酶活性。使用1× Assay緩沖液準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1 × 105–1 × 106個(gè)細(xì)胞/mL。取100 μL染色工作溶液與200 μL細(xì)胞懸液混合，37 °C孵育15 min。使用帶490 ± 10 nm激發(fā)濾光片的熒光顯微鏡同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞（綠色熒光）和死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm發(fā)射濾光片僅觀察死細(xì)胞。

2.7 體內(nèi)ROS檢測(cè)（DHE共聚焦染色）

使用FV1000共聚焦顯微鏡進(jìn)行ROS檢測(cè)，證明納米顆粒通過(guò)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[54]。將細(xì)胞載玻片放置于24孔板的底部，接種LLC細(xì)胞（約2 × 104個(gè)細(xì)胞/孔）。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基。加入對(duì)照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）至相應(yīng)的培養(yǎng)基中。繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基。隨后，用PBS洗滌細(xì)胞三次，去除培養(yǎng)基中殘留的納米顆粒。加入500 μLDHE （5 μmol?L?1）溶液，置于37 °C培養(yǎng)箱中孵育30min。然后用PBS洗滌細(xì)胞三次。接著，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，并用PBS洗滌三次。取出細(xì)胞載玻片，將其（細(xì)胞面朝下）固定到含有封片液（含DAPI）的玻璃載片上，在黑暗中自然干燥。使用FV1000共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察并拍攝圖像。DAPI染色的細(xì)胞核在405 nm激光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒在488 nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。DHE染色在559 nm激光激發(fā)下顯示紅色熒光。

2.8 腫瘤模型的建立

6–8周齡的雄性C57BL/6JNifdc小鼠購(gòu)自北京維通利華公司。所有小鼠均在控制環(huán)境條件下飼養(yǎng)（室溫：22 ± 1 °C，相對(duì)濕度：40%–70%）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。每只小鼠右前胸皮下注射1 × 106個(gè)LLC細(xì)胞，建立小鼠腫瘤模型。

2.9 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

C57BL/6JNifdc小鼠腫瘤模型按照第2.8節(jié)所述建立。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)，將40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組：a） 對(duì)照組（200 μL生理鹽水）；b） MTX 組（200 μL ， 0.0608 mg?mL?1） ； c）CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組（200 μL ， 4mg?mL?1）；d） CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200 μL，4 mg?mL?1）。四組的給藥途徑為尾靜脈注射。在分組后的第0、5和10 d進(jìn)行重復(fù)的尾靜脈注射，所有小鼠均暴露于24 h的日光下。每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤小鼠模型的腫瘤體積。每隔一天記錄小鼠的一般狀況、腫瘤體積和體重。第12 d，每組隨機(jī)處死5只小鼠，收集腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和TUNEL染色。當(dāng)腫瘤體積增加至1000 mm3時(shí)，認(rèn)為荷瘤小鼠死亡，并記錄日期。

2.10 腫瘤組織的HE染色

使用倒置熒光顯微鏡（型號(hào)IX71）進(jìn)行HE染色，以通過(guò)儀器展示納米顆粒對(duì)腫瘤組織的抗腫瘤效果[55]。將對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的新鮮腫瘤組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中12 h。隨后，使用不同濃度的乙醇（75%、85%、95%、100%）脫水，并通過(guò)組織脫水機(jī)在二甲苯中透明化。將腫瘤組織浸泡在蠟中8 h后，進(jìn)行石蠟包埋。石蠟切片在二甲苯中脫蠟，依次在不同濃度的乙醇（100%、95%、85%、75%）和PBS中清洗。用蘇木精染色2 min，并用自來(lái)水洗滌10 min。將切片在1%鹽酸乙醇溶液中分化約30 s，然后用自來(lái)水沖洗一次。用伊紅溶液染色8 s，并用自來(lái)水沖洗至無(wú)色。使用不同濃度的乙醇（85%、95%、100%）脫水，使其在二甲苯中透明化，封片后用中性樹(shù)膠封固，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.11 腫瘤組織的TUNEL染色

使用TUNEL染色法，通過(guò)FV1000共聚焦顯微鏡展示納米顆粒對(duì)腫瘤組織的細(xì)胞毒性作用[56]。TUNEL檢測(cè)溶液由75 μL TdT酶、675 μL熒光標(biāo)記溶液和750 μL TUNEL檢測(cè)緩沖液組成。將對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的腫瘤組織切片在4%多聚甲醛溶液中固定30 min，并用PBS洗滌兩次，每次10 min。接著，加入0.5% TritonX-100在PBS中的溶液，在室溫下孵育5 min。隨后，使用PBS洗滌兩次，每次10 min。向樣本中加入100μL TUNEL檢測(cè)溶液，在37 °C下孵育60 min （放置于濕潤(rùn)箱中以防水分蒸發(fā)），并避光處理。孵育后，用PBS洗滌三次，每次10 min。最后，使用抗褪色液進(jìn)行封片，并自然干燥。

2.12 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內(nèi)的代謝分布及血清游離鉛的檢測(cè)

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內(nèi)的代謝分布及血清游離鉛的檢測(cè)旨在闡明納米顆粒在小鼠體內(nèi)的分布及安全性。使用小動(dòng)物體內(nèi)成像儀IVIS Lumina III和電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）進(jìn)行檢測(cè)[57]。建立28只C57BL/6JNifdc小鼠的腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)，將CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒（200 μL，4mg?mL?1）通過(guò)尾靜脈注射給藥于7只荷瘤小鼠。通過(guò)隨機(jī)犧牲每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的一只小鼠（0、6、24、48、72、96和120 h），測(cè)量腫瘤、糞便和主要器官的熒光強(qiáng)度。使用小動(dòng)物體內(nèi)成像儀評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在腫瘤、糞便和主要器官中的熒光強(qiáng)度，從而展示納米顆粒的生物分布。此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒（200 μl，4 mg?mL?1）通過(guò)尾靜脈注射于21只荷瘤小鼠，并在不同時(shí)間點(diǎn)（0、6、24、48、72、96和120 h）收集小鼠的血樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從三只小鼠收集血樣，利用ICP-MS測(cè)定血清中游離鉛的濃度。

2.13 體內(nèi)生物安全性實(shí)驗(yàn)

使用全自動(dòng)生化和血細(xì)胞分析儀進(jìn)行安全性實(shí)驗(yàn)，評(píng)估納米顆粒在小鼠體內(nèi)的安全性[58]。選擇健康的C57BL/6JNifdc小鼠進(jìn)行體內(nèi)生物安全性分析。將20只小鼠隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX納米顆粒組。所有組通過(guò)尾靜脈注射給藥，每5 d一次，共注射三次。一個(gè)月后，隨機(jī)從每組的3只小鼠眼球處收集血樣進(jìn)行血常規(guī)、肝腎功能檢測(cè)。此外，每組隨機(jī)處死2只小鼠，收集主要器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）進(jìn)行HE染色。具體的取樣和染色步驟與2.10相同。

2.14 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電機(jī)制檢測(cè)

將CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆?；旌先芤盒坑贔TO/SnO2基板上，并在100 °C下干燥30 min，得到CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒薄膜。隨后，使用原子力顯微鏡（AFM）檢測(cè)薄膜在暗態(tài)和光照條件下接觸電位差的變化。

2.15 THFA檢測(cè)

將LLC細(xì)胞接種于6孔板中（每孔約1 × 106個(gè)細(xì)胞），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基后，分別加入對(duì)照組（生理鹽水）、MTX組（3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200μg?mL?1）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，2235 r?min?1離心5min后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用PBS洗滌三次，再用新鮮的裂解緩沖液重懸，濃度調(diào)整為1 × 107cells?mL?1，靜置5 min。將樣本以3353 r?min?1離心10 min，溫度為2–8 °C，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。使用四氫葉酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組腫瘤細(xì)胞中的四氫葉酸濃度。

2.16 谷胱甘肽檢測(cè)

谷胱甘肽檢測(cè)用于通過(guò)流式細(xì)胞儀展示納米顆粒通過(guò)降低谷胱甘肽濃度殺死腫瘤細(xì)胞[59]。將LLC細(xì)胞接種于6孔板中（每孔約1 × 106個(gè)細(xì)胞），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基后，分別加入對(duì)照組（ 生理鹽水） 、MTX 組（3.04 μg?mL?1） 、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒組（200 μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（200μg?mL?1）的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，2235 r?min?1離心5min后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用PBS洗滌三次。加入膜破裂劑（500 μL，室溫避光孵育30 min），然后以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。接著加入2 mL BD Perm/Wash，混勻并在室溫下避光孵育10min，再以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。加入GSH抗體（1 ： 250），混勻并在室溫下避光孵育30min。隨后，加入2 mL BD Perm/Wash，洗滌一次，再以1118 r?min?1離心5 min，棄去上清液。加入R-藻紅蛋白AffiniPure F（ab'）2 片段驢抗小鼠IgG（H+L）二抗（1 ： 50），混勻并在室溫下避光孵育20min。最后，加入2 mL BD Perm/Wash，并以1118r?min?1離心5 min，棄去上清液，混勻細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.17 釋藥實(shí)驗(yàn)

釋藥實(shí)驗(yàn)旨在展示CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒中MTX的藥物負(fù)載率，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis）進(jìn)行檢測(cè)[60]。為了評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在不同pH環(huán)境下的釋藥情況，包括酸性環(huán)境（pH 5.0）、中性生理環(huán)境（pH 7.4）和堿性生理環(huán)境（pH 8.4），選擇PBS （pH 5.0、pH 7.4和pH 8.4）作為體外釋藥介質(zhì)。首先，準(zhǔn)確稱(chēng)取40.00 mg CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒粉末，溶解于10 mL的PBS （pH5.0、pH 7.4或pH 8.4）中，并將其置入透析袋（MW：3500），然后將透析袋放入300 mL PBS （pH 5.0、pH7.4或pH 8.4）中，在37 °C下以120 r?min?1攪拌。按照預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、15、30 min、1、1.5、2、4、6、8、10、12和24 h）取樣，每次提取3 mL液體，并加入等體積的新鮮PBS緩沖液（對(duì)應(yīng)的pH值）。使用分光光度計(jì)測(cè)定體外釋藥液中的藥物濃度，并繪制藥物釋放曲線。進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

2.18 電子自旋共振（ESR）檢測(cè)

ESR檢測(cè)[7]用于證明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在405 nm光照射下可以產(chǎn)生ROS。首先，準(zhǔn)備200 μg?mL?1的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒溶液。取45 μL溶液（200 μg?mL?1）并加入5 μL捕獲劑。使用2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮鹽酸鹽（TEMP）作為1O2的捕獲劑，使用5，5-二甲基-1-吡咯烯-N-氧化物（DMPO）作為（O2?和?OH）的捕獲劑。用405 nm LED燈照射樣品10 min，然后進(jìn)行ESR檢測(cè)。

2.19 統(tǒng)計(jì)分析

為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，進(jìn)行至少三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)分析使用Origin 2018和GraphPad Prism 8.0進(jìn)行。多組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)單因素方差分析（onewayANOVA） 和雙因素方差分析（two-wayANOVA）計(jì)算。兩組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)（Student's t-test）進(jìn)行。假設(shè)*P lt; 0.05，**P lt;0.01和***P lt; 0.001表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過(guò)三種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞損傷（圖1）。首先，在可見(jiàn)光照射下，鈣鈦礦納米顆粒生成大量電子，促進(jìn)多種ROS的產(chǎn)生，包括超氧陰離子（O2?）、羥基自由基（?OH）和1O2 [7，54]。其次，光生空穴作為天然氧化劑，消耗細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的GSH，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[54]。最后，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的堿性環(huán)境中鈣鈦礦納米顆粒釋放化療藥物甲氨蝶呤（MTX） [61]，抑制嘌呤合成，并同時(shí)阻斷GCH1/BH4/DHFR系統(tǒng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)[62–64]。

總之，提出了一種使用CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒作為集成治療診斷平臺(tái)的新概念。該平臺(tái)通過(guò)熒光檢測(cè)追蹤腫瘤細(xì)胞、釋放MTX進(jìn)行化療，并在可見(jiàn)光照射下生成ROS （圖1）。在注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒并隨后進(jìn)行可見(jiàn)光照射后，該平臺(tái)成功地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原失衡，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[64]。重要的是，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的安全性和強(qiáng)大的光電催化化療能力。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了其開(kāi)發(fā)的重要性，并促進(jìn)其在腫瘤治療中的潛在應(yīng)用。

CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)X射線衍射（XRD）進(jìn)行表征。XRD圖譜中位于12.8°、21.3°、27.3°、28.5°和42.4°的衍射峰（圖2a）分別對(duì)應(yīng)于Cs4PbBr6的（120）、（113）、（223）、（214）和（314）晶面[65]。由于Cs4PbBr6的含量較低，其存對(duì)納米顆粒的光電性能影響較弱。此外，CsPbBr3的（211）和（220）晶面分別出現(xiàn)在34.3°和38.9°處[65]。由于Sn2+的半徑（0.118 nm） [66，67]小于Pb2+ 的半徑（（0.119 nm） [68，69] ， 在CsSn0.5Pb0.5Br3晶體中[70–72]，XRD圖譜中位于15.0°、19.9°和30.2°的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于（101）、（121）和（202）晶面[73]。此外，位于22.3°、32.5°、37.6°、40.7°和45.6°的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于（110）、（200）、（211）、（220）和（221）晶面[65]。由于Sn2+的半徑小于Pb2+，先前分散在溶劑（環(huán)己烷）中的殘余0D Cs4PbBr6 納米晶體（ 簡(jiǎn)稱(chēng)NCs） 轉(zhuǎn)化為3DCsPbBr3 NCs [74] ， 這表明成功制備了CsSn0.5Pb0.5Br3 NCs [71]。

為了確認(rèn)甲氨蝶呤-殼聚糖-葉酸（MTX-CSFA）成功錨定在CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體上，采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）進(jìn)行表征（圖2b）。1530cm?1處出現(xiàn)的酰胺鍵（N―C＝O）峰確認(rèn)了MTX和FA的羧基與CS的氨基之間形成了酰胺鍵[75]，表明MTX-CS-FA的成功合成。在MTX和FA分子中，C＝C―C＝O官能團(tuán)出現(xiàn)在1637 cm?1處[76，77]，而CS的―OH官能團(tuán)則在3200至3600 cm?1范圍內(nèi)出現(xiàn)[76]。此外，在CsSn0.5Pb0.5Br3合成過(guò)程中，殘余的油酸（OA）和油胺（OAm）引起的―CH3官能團(tuán)在2925 cm?1處出現(xiàn)[78]。這些特征性官能團(tuán)證實(shí)了CsSn0.5Pb0.5Br3成功被MTX-CS-FA外殼包裹。

透射電子顯微鏡（TEM） 用于研究CsSn0.5Pb0.5Br3納米晶體在MTX-CS-FA殼層中的包覆情況。TEM圖像（ 圖2c） 顯示， 所制備的CsSn0.5Pb0.5Br3納米顆粒具有規(guī)則且均勻的矩形形態(tài)，粒徑范圍為5–20 nm。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）分析（圖2d）顯示出清晰的晶格條紋，平均晶面間距為0.60 nm，與XRD圖譜（圖2a）計(jì)算得出的（101）晶面間距一致?？焖俑道锶~變換（FFT）圖像（圖2d插圖）和選區(qū)電子衍射（SAED）圖案（圖2e）證實(shí)了CsSn0.5Pb0.5Br3 的晶體結(jié)構(gòu)。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒粒徑為20–40 nm，呈球形，表面均勻包覆有MTX-CS-FA殼層，形成核殼結(jié)構(gòu)（圖2f，g）。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒的（110）和（200）晶面間距分別為0.38和0.27 nm，F(xiàn)FT和SAED結(jié)果（圖2g，h）均顯示出這一特征。這些結(jié)果表明MTX-CS-FA有機(jī)殼層保護(hù)了鈣鈦礦納米晶體的組成和晶體結(jié)構(gòu)，與XRD（圖2a）和能量色散X射線光譜（EDS）結(jié)果（圖S1，Supporting Information）一致。

通過(guò)X 射線光電子能譜（XPS） 對(duì)CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在模擬腫瘤環(huán)境（H2O2）中的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估（圖2i–k及圖S2） 。在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA（H2O2） [79–81] 樣品中均觀察到特征的N 1s峰（400.4 ± 0.5 eV） （圖2i），而在CsSn0.5Pb0.5Br3樣品中未觀察到，這證實(shí)了在氧化性的H2O2腫瘤環(huán)境中，被MTX-CS-FA包覆的CsSn0.5Pb0.5Br3的穩(wěn)定性和未降解性（圖S3）。這些結(jié)果與FTIR （圖2b）分析一致。此外，Pb 4f峰（138.4± 0.5和143.3 ± 0.5 eV） [82]和Sn2+價(jià)態(tài)峰（486.1 ± 0.5eV） [83] （圖2j，k）顯示了極小的變化，表明Sn取代Pb不會(huì)顯著影響內(nèi)在的鈣鈦礦結(jié)構(gòu)，這與XRD分析（圖2a）和TEM結(jié)果（圖2g）一致。因此，成功合成了具有20–40 nm 粒徑的高度穩(wěn)定的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，適用于后續(xù)的體內(nèi)治療應(yīng)用。

為了研究光電催化機(jī)制，采用光致發(fā)光（PL）和開(kāi)爾文探針力顯微鏡（KPFM） 分析CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電性能和光電催化性能（圖3a及圖S4）。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，PL強(qiáng)度增加，PL峰值從522 nm紅移至527 nm（0到228 d），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在水中具有極佳的穩(wěn)定性。為了與新鮮狀態(tài)進(jìn)行對(duì)比，在405 nm光照射下，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）對(duì)浸泡228 d后的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在水溶液中的圖像進(jìn)行捕捉（圖3b）。水浸納米顆粒顯示出較高的IVIS強(qiáng)度（更多紅色），與PL結(jié)果一致，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒在水中的穩(wěn)定性可達(dá)228 d。由0至228 d期間的數(shù)據(jù)構(gòu)建的直方圖表明產(chǎn)生了光激發(fā)的空穴和電子，這與PL結(jié)果一致。為了進(jìn)一步研究CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光電催化性能，采用KPFM測(cè)量暗態(tài)和405 nm光照射下的接觸電位差（CPD） （圖3c–f，圖S5）。局部表面電勢(shì)由尖端與樣品表面之間的CPD決定，取決于它們各自的功函數(shù)[84，85]。CPD的計(jì)算公式為CPD =（?_tip ? ?_sample）/（?e），其中?_tip和?_sample分別代表尖端和樣品的功函數(shù)，e是電子電荷。光激發(fā)產(chǎn)生的空穴和電子的增加導(dǎo)致CPD增加[86]。在暗態(tài)下，三維拓?fù)鋱D像中的原位CPD為0.28 V （圖3c），而在光照條件下（405 nm，lx = 491 W?m?2），CPD增加至0.44 V，表明光誘導(dǎo)的CPD增加了約0.16 eV，如圖3f 所示。CPD 的光誘導(dǎo)增加表明光照下CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒發(fā)生了電子-空穴對(duì)的分離[87]。在光照條件下，CPD比暗態(tài)下條件下增加了57%，證實(shí)了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒具有良好的光電催化特性。在光照后，這種電勢(shì)的增加可以歸因于電子和空穴的分離[88]，產(chǎn)生的電勢(shì)可作用于腫瘤細(xì)胞。生成的電子可以產(chǎn)生反應(yīng)性ROS，而空穴可以氧化GSH，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[53，89]。這些結(jié)果驗(yàn)證了圖1中所示的機(jī)制， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效殺傷作用。

光電催化在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA 納米顆粒的腫瘤治療中起著至關(guān)重要的作用，因此深入探討其機(jī)制極其重要。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒通過(guò)三條主要途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。腫瘤細(xì)胞通常具有較高水平的抗氧化系統(tǒng)成分，以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。GSH作為細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[90]。已有研究表明，GSH的耗竭會(huì)破壞氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞凋亡[91] 。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在可見(jiàn)光激發(fā)下生成電子（e?）和空穴（h+） （圖4a）。腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的GSH可以與空穴結(jié)合，導(dǎo)致GSH的持續(xù)消耗[54，92，93]。為了驗(yàn)證這一機(jī)制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了四個(gè)組：對(duì)照組（I）、MTX組（II） （3.04 μg?mL?1）、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA （III） 納米顆粒組（200μg?mL?1）和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA （IV）納米顆粒組（200 μg?mL?1），并分別用于處理小鼠肺癌細(xì)胞（LLC細(xì)胞）。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定處理后的細(xì)胞內(nèi)GSH濃度[6，94]。結(jié)果顯示，對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強(qiáng)度分別為92.4%、87.7%、85.4%和59.2%。與對(duì)照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強(qiáng)度顯著降低了36% （圖4b，c），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過(guò)產(chǎn)生的空穴氧化GSH，發(fā)揮抗腫瘤作用[95，96]。

ROS，包括超氧陰離子（O2?）、?OH和1O2，在富氧環(huán)境中依賴(lài)于電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生。ROS水平的增加可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7，97，98]。為了驗(yàn)證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒是否能夠生成ROS，使用二氫乙錠（DHE）共聚焦染色法檢測(cè)LLC細(xì)胞在不同處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS水平[99]。結(jié)果顯示，對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（圖4d，e）的熒光強(qiáng)度分別為0、0、6.40和56.28。與對(duì)照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的熒光強(qiáng)度顯著升高（P lt; 0.001） ， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠生成大量的O2?。此外，采用電子自旋共振（ESR）光譜法定量分析主要類(lèi)型的ROS，以檢測(cè)1O2。在405 nm可見(jiàn)光照射下，觀察到O2?、?OH和1O2的強(qiáng)烈特征信號(hào)，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒生成O2?、?OH和1O2 （圖4f–h）。四氫葉酸（THFA）是嘌呤核苷酸和嘧啶脫氧核苷酸合成過(guò)程中的必需輔酶。甲氨蝶呤（MTX） 作為二氫葉酸還原酶（DHFR）的抑制劑，阻止二氫葉酸（DHFA）轉(zhuǎn)化為T(mén)HFA [64，100]。嘌呤合成的阻斷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在S期[62，63]。此外，MTX抑制DHFR活性，從而阻斷GCH1/BH4/DHFR途徑，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化并誘導(dǎo)凋亡[62–64]。為了研究CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對(duì)THFA濃度的影響，采用ELISA法對(duì)LLC細(xì)胞進(jìn)行處理后檢測(cè)THFA濃度。結(jié)果顯示，對(duì)照組、MTX組、CsSn0.5Pb0.5Br3@CSFA納米顆粒組和CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組（圖4i）的THFA濃度分別為1.56、0.95、1.02和0.29 ng?mL?1 。與對(duì)照組和MTX 組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的THFA濃度分別顯著下降了81.41% 和42.31% （P lt;0.001），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒顯著增強(qiáng)了MTX化療的抗腫瘤效果[61，101]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化和凋亡。

與對(duì)照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒顯著提高了LLC細(xì)胞死亡率，達(dá)到83%（P lt; 0.001） （圖5a，b），證明這些納米顆粒引起LLC細(xì)胞的碎片化死亡（ 圖5a） 。為了評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對(duì)LLC細(xì)胞活性的影響，進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)。LLC細(xì)胞在不同濃度的納米顆粒（0–200 μg?mL?1）處理下[102]，200 μg?mL?1 CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒處理后的LLC細(xì)胞活性顯著下降，僅為37% （圖5c）。這表明細(xì)胞活性（100%對(duì)比37%）下降了2.7倍，突出顯示了在這種濃度的納米顆粒下LLC細(xì)胞活性的顯著減少。

為了探討MTX在CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒中的負(fù)載情況，采用UV-Vis分光光度法，結(jié)果表明藥物負(fù)載率為1.52 ± 0.03% （圖5d） [103]，證實(shí)MTX成功加載到納米顆粒中。為了評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在不同pH值下的MTX釋放情況[104]，進(jìn)行了體外釋放實(shí)驗(yàn)。在pH = 8.4條件下，1.5 h后的累積MTX釋放量為51.17 ± 3.84% （圖5e），表明在腫瘤細(xì)胞典型的弱堿性環(huán)境中，MTX釋放顯著[61]。

為了評(píng)估FA介導(dǎo)的靶向效能，使用共聚焦顯微鏡[105] 觀察了LLC 細(xì)胞和小鼠肌母細(xì)胞（C2C12）在與CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA孵育6 h后的熒光強(qiáng)度。LLC細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度是C2C12細(xì)胞的2.9倍（圖5f），證實(shí)了FA具有顯著的腫瘤細(xì)胞靶向效應(yīng)[106] 。進(jìn)一步通過(guò)共聚焦顯微鏡測(cè)量CsSn0.5Pb0.5Br3@CS和CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA納米顆粒在LLC細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度， 結(jié)果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@CS-FA 組的熒光強(qiáng)度是CsSn0.5Pb0.5Br3@CS組的2.8倍（圖5f，g），進(jìn)一步證明了FA的腫瘤細(xì)胞靶向效應(yīng)[106，107]。

最后， 使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在LLC細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，以證明其細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在24 h孵育后，LLC細(xì)胞的溶酶體幾乎沒(méi)有熒光，表明溶酶體破裂[108]。溶酶體破裂不僅促進(jìn)了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒從溶酶體的釋放，還促使MTX的釋放，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡（圖5f，g）。

總之，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在200 μg?mL?1濃度下表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性和精確的LLC細(xì)胞靶向效果。

為了進(jìn)一步評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的抗腫瘤效果，通過(guò)將LLC細(xì)胞注射到C57BL/6JNifdc小鼠皮下，構(gòu)建了小鼠腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50 mm3，通過(guò)尾靜脈向荷瘤小鼠靜脈注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒，每5 d給藥一次，共計(jì)給藥3次。在第12 d，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理（圖6a）。

為了驗(yàn)證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的體內(nèi)靶向效應(yīng)，使用小動(dòng)物IVIS系統(tǒng)評(píng)估了該納米顆粒在荷瘤小鼠中納米顆粒的熒光強(qiáng)度（圖6b，c） [94]。在注射前，皮下腫瘤區(qū)域幾乎無(wú)熒光信號(hào)。然而，注射24 h后，熒光強(qiáng)度較注射前增加了108%，充分證明了這些納米顆粒的精確靶向性[109]。

為了評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒對(duì)皮下腫瘤的抗腫瘤效果，每隔2 d測(cè)量了荷瘤小鼠的腫瘤體積、重量和生存時(shí)間（以天為單位）（圖6d–f） [110]。結(jié)果顯示：第12 d，對(duì)照組的小鼠平均腫瘤體積為1785.44 mm3 ， 而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均腫瘤體積僅為396.11 mm3，體積縮小了約4.51倍。同樣，對(duì)照組的小鼠平均腫瘤重量為2.31 g，而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均腫瘤重量?jī)H為0.52 g，減輕了約4.44倍。此外，接受CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒靜脈注射的小鼠生存時(shí)間可達(dá)27 d （圖S6、S7）。這些結(jié)果證實(shí)了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠顯著抑制LLC皮下腫瘤的生長(zhǎng)。

為了評(píng)估急性毒性[56，111]，測(cè)量了每組小鼠的體重（圖6g），結(jié)果顯示各組小鼠的體重沒(méi)有顯著變化。第12 d，對(duì)照組小鼠的平均體重為24.11 g，而注射CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的小鼠平均體重為22.50 g，表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒對(duì)小鼠的體重影響不大，提示其具有較低的急性毒性。

為了驗(yàn)證CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒的光催化治療和化療效果，進(jìn)行了蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色和末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記（TUNEL）染色（圖6h，i） [55]。Hamp;E染色圖像顯示，與對(duì)照組相比，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒組的腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，TUNEL染色結(jié)果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒組的凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的3.61%（P lt; 0.001） （圖6h）。

綜上所述， 體內(nèi)腫瘤結(jié)果證實(shí)，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在可見(jiàn)光照射下表現(xiàn)出顯著的光電催化增強(qiáng)效應(yīng)，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的有效靶向抑制。

為了評(píng)估CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內(nèi)的生物安全性和代謝分布，進(jìn)行了組織病理學(xué)評(píng)估、常規(guī)血液檢查、肝腎功能檢測(cè)以及體重測(cè)量（圖7a）。通過(guò)對(duì)小鼠主要器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）進(jìn)行組織學(xué)分析，評(píng)估了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組的非炎癥和非損傷特性[112，113]。

此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒組與對(duì)照組在常規(guī)血液參數(shù)、肝腎功能或體重方面無(wú)顯著差異（圖7b），表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTXCS-FA納米顆粒具有良好的體內(nèi)生物相容性。

為了進(jìn)一步評(píng)估這些納米顆粒的安全性，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）檢測(cè)小鼠血清中的游離鉛濃度（圖7c） [5，56]。結(jié)果表明，在第5 d腫瘤負(fù)荷小鼠的血清游離鉛濃度為7.60 μg?L?1，處于正常安全范圍內(nèi)。對(duì)照組的游離鉛血清濃度為3.62 μg?L?1，兩組之間無(wú)顯著差異（P gt; 0.05）。這些濃度明顯低于美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）規(guī)定的參考血鉛水平（50 μg?L?1） [114] ， 表明CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內(nèi)具有良好的生物安全性。

隨后，采用IVIS系統(tǒng)探測(cè)CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在腫瘤負(fù)荷小鼠組織和糞便中的熒光強(qiáng)度，進(jìn)一步分析其體內(nèi)代謝分布（圖7d） [115]。注射后24 h，腫瘤和肝臟的熒光強(qiáng)度分別為26.6 × 106和413 × 106，而48 h時(shí)腎臟的熒光強(qiáng)度為28.9 × 106。值得注意的是，120 h后，糞便中的熒光強(qiáng)度達(dá)到了81.4 × 106 （圖7e），而其他器官的熒光信號(hào)則完全消失。這證明了CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒能夠選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞，在肝臟和腎臟代謝后最終通過(guò)糞便排出小鼠體外。

這些結(jié)果表明，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在小鼠體內(nèi)具有良好的生物安全性，并能以熒光鈣鈦礦的形式從小鼠體內(nèi)排出。MTXCS-FA外殼有效地防止了PeNCs在水中的降解，并防止了金屬離子向血液中的釋放。

4 結(jié)論

我們成功地將CsSn0.5Pb0.5Br3與MTX-CS-FA復(fù)合物結(jié)合， 形成了具有高度水穩(wěn)定性的CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒。這些創(chuàng)新性納米顆粒在腫瘤治療中表現(xiàn)出卓越的光電催化活性，主要?dú)w功于其對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)靶向作用、生物成像能力以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。在可見(jiàn)光照射下，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒通過(guò)電子激發(fā)產(chǎn)生ROS，通過(guò)生成的空穴氧化作用消除過(guò)表達(dá)的GSH，并通過(guò)MTX抑制DHFR的活性。這些機(jī)制的協(xié)同作用促進(jìn)了脂質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒在細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。此外，CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CSFA納米顆粒在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物安全性，并且可以在不降解的情況下從小鼠體內(nèi)完整排出，保持其鈣鈦礦量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)的完整性。CsSn0.5Pb0.5Br3@MTX-CS-FA納米顆粒具備光電催化與化療的雙重特性，有望成為腫瘤治療領(lǐng)域的一種創(chuàng)新方法。

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