動物源性食品氯霉素類殘留檢測方法研究

摘 要：氯霉素類藥物在獸醫(yī)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但其在動物體內(nèi)的殘留可能對人體健康產(chǎn)生潛在威脅。為了確保食品安全，本文對動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測方法進行了深入探討，首先概述了氯霉素類藥物的基本特性及其對人體健康的潛在危害，隨后詳細(xì)介紹了色譜法、免疫分析法和微生物法等三種主要的檢測方法，以期為動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的準(zhǔn)確、快速檢測提供有力支持。

關(guān)鍵詞：動物源性食品；氯霉素類殘留；檢測

隨著人們生活水平的提高，對動物源性食品的需求日益增長，其質(zhì)量與安全也愈發(fā)受到關(guān)注。氯霉素類藥物在獸醫(yī)領(lǐng)域被廣泛用于治療動物肺炎、敗血癥、腸道感染等疾病，能有效控制動物疾病的傳播。然而，氯霉素類藥物的殘留問題以及對人類健康的風(fēng)險，逐漸引起了社會的高度重視。為了確保食品安全和公眾健康，研究人員和監(jiān)管機構(gòu)一直在努力提高氯霉素類藥物殘留檢測技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性，可見對該項檢測方法的研究具有重要的現(xiàn)實意義，因此本文將對此領(lǐng)域展開深入研究。

1 氯霉素類藥物概述

氯霉素類藥物（Chloramphenicols，CAPs）是一類具有廣譜抗菌活性的抗生素，在獸醫(yī)臨床中該藥物被廣泛用于治療沙門氏菌病、大腸埃希菌感染、牛巴氏桿菌病等各種動物的細(xì)菌感染性疾病[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，氟甲砜霉素常被用于防治魚類、蝦類等水生動物的細(xì)菌性疾病，如魚類的爛鰓病、腸炎病等。而氯霉素類藥物殘留會對人體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險，對人體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，損害骨髓造血功能，長期攝入含有氯霉素類藥物殘留的食品可能引發(fā)再生障礙性貧血[2]。對于兒童來說，氯霉素類藥物殘留可能影響其神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致智力發(fā)育遲緩、運動協(xié)調(diào)能力下降等問題。

2 動物源性食品氯霉素類殘留的檢測方法

2.1 色譜法

色譜法主要是利用混合物中各組分在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異，當(dāng)流動相攜帶樣品通過固定相時，各組分在兩相間進行反復(fù)多次的分配，從而使不同組分在固定相中的滯留時間不同，進而實現(xiàn)分離[3]。在動物源性食品氯霉素類殘留檢測中，常用的色譜法包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），下文將重點介紹液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）是將液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性和結(jié)構(gòu)鑒定能力相結(jié)合的一種分析技術(shù)。在動物源性食品氯霉素類殘留檢測中，首先進行樣品前處理與萃取，可稱取5.0 g粉碎好的樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，在均質(zhì)器中以14 000 rpm均質(zhì)30 s，以3 000 rpm離心5 min，定量濾紙漏斗加約25 g無水硫酸鈉于濃縮瓶口，將離心過的上層乙酸乙酯提取液由濾紙漏斗過濾至濃縮瓶中，重復(fù)兩次。合并濾液于50 ℃以下減壓濃縮至近干，用4 mL正己烷和4 mL水依次將殘渣轉(zhuǎn)移至10 mL玻璃離心管中，2 000 rpm渦旋混合1 min，2 000 rpm離心3 min，棄去上層正己烷溶液，再加入4 mL正己烷，重復(fù)上述操作，下層水層做待凈化液。先將Cleanert?C18（500 mg/3 mL）小柱分別用5 mL甲醇和5 mL水平衡，然后將待凈化液過柱（流速控制在2～3 mL/min），10 mL水兩次洗滌離心瓶，棄去濾液；再用5 mL甲醇：水（2：8，v/v）溶液淋洗，棄去淋洗液，將小柱負(fù)壓抽干；最后用6 mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40 ℃氮氣吹近干，5 mL水復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后待測。采用Venusil?MPC18色譜柱，以水和乙腈為流動相進行梯度洗脫，離子源為電噴霧離子源，掃描方式為負(fù)離子掃描，電噴霧電壓為5 500 V，霧化氣壓力為60 psi，氣簾氣壓力為12 psi，輔助氣壓力為50 psi，離子源溫度為600 ℃，采集方式為多反應(yīng)檢測（MRM）。該方法加標(biāo)量為1.0 μg/kg、10 μg/kg加標(biāo)回收率在70%～120%，RSD值小于10%，能夠滿足檢測要求。

2.2 免疫分析法

免疫分析法是基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，利用免疫學(xué)原理進行分析檢測的一種方法，當(dāng)樣品中存在目標(biāo)物質(zhì)（抗原）時，會與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物[4]。在動物源性食品氯霉素類殘留檢測中，常用的免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和免疫傳感器法，下文主要介紹酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。

在動物源性食品中氯霉素殘留檢測實踐中，首先進行包被，將氯霉素特異性抗體（或抗原）用包被緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，加入到酶標(biāo)板的微孔中，每孔加入一定量的抗體（或抗原）溶液，一般為50～100 μL，4 ℃孵育過夜，使抗體（或抗原）牢固地吸附在微孔表面。然后進行封閉，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌微孔3～5次，每次洗滌后將微孔中的液體甩干，加入封閉液，每孔加入100～200 μL，37 ℃孵育1～2 min，封閉微孔表面未被抗體（或抗原）占據(jù)的位點，減少非特異性吸附。接著進行加樣，將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，加入到已封閉的酶標(biāo)板微孔中，每孔加入50～100 μL，同時設(shè)置空白對照孔（只加樣品稀釋液）、陰性對照孔（加入已知不含氯霉素的樣品）和陽性對照孔（加入已知含有一定濃度氯霉素的樣品）。

37 ℃孵育30～60 min，使樣品中的氯霉素與固相載體上的抗體（或抗原）充分結(jié)合，之后進行洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔3～5次，每次洗滌后將微孔中的液體甩干，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。再加入酶標(biāo)抗體，將酶標(biāo)記的氯霉素特異性抗體用抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，每孔加入50～100 μL，37 ℃孵育30～60 min，使酶標(biāo)抗體與抗原-抗體復(fù)合物中的抗原結(jié)合。再次洗滌，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔3～5次，每次洗滌后將微孔中的液體甩干，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。然后進行顯色，加入酶的底物溶液，如四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等，每孔加入50～100 μL，37 ℃避光孵育15～30 min，酶催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。最后加入終止液，如硫酸溶液等，每孔加入50～100 μL，終止酶促反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在特定波長下（如450 nm）測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中氯霉素的含量。

2.3 微生物法

微生物法是測定抗生素類藥物常用的方法之一，主要是利用樣品中的抗生素殘留能對培養(yǎng)基中的細(xì)菌產(chǎn)生抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的有無及大小來判定結(jié)果。不同的抗生素對不同的細(xì)菌具有特異性的抑制作用，選擇合適的試驗菌，可檢測不同的抗生素殘留。在氯霉素類殘留檢測中，常用的微生物檢測方法有紙片法和杯碟法等。

以紙片法為例，首先制備含有特定試驗菌（如藤黃微球菌等對氯霉素敏感的菌株）的培養(yǎng)基平板，將培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻至適當(dāng)溫度，加入適量的試驗菌懸液，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成含有試驗菌的培養(yǎng)基平板。然后將待測樣品提取液滴加到無菌濾紙片上，或?qū)⒑袠悠返募埰苯臃胖迷谝阎苽浜玫呐囵B(yǎng)基平板上，將平板置于適宜的溫度（一般為37 ℃）下培養(yǎng)一定時間（通常為18～24 h）。在培養(yǎng)過程中，如果樣品中含有氯霉素類藥物殘留，藥物會向培養(yǎng)基中擴散，抑制周圍細(xì)菌的生長，從而在紙片周圍形成抑菌圈。測量抑菌圈的直徑大小且與標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈直徑進行比較，可半定量地判斷樣品中氯霉素類藥物的殘留情況。如果抑菌圈直徑大于或等于標(biāo)準(zhǔn)品在一定濃度下的抑菌圈直徑，則說明樣品中氯霉素類藥物殘留量可能較高；如果沒有出現(xiàn)抑菌圈，則說明樣品中可能不含氯霉素類藥物殘留或殘留量低于檢測限。

杯碟法的操作原理與紙片法類似，只是將樣品放置在不銹鋼小管（即牛津杯）中，放置在含有試驗菌的培養(yǎng)基平板上，經(jīng)過培養(yǎng)后，觀察牛津杯周圍抑菌圈的形成情況。在使用杯碟法時，先將牛津杯滅菌后，放置在已制備好的含有試驗菌的培養(yǎng)基平板上，然后將樣品提取液加入牛津杯中，每個平板可放置多個牛津杯，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。培養(yǎng)后，測量抑菌圈直徑，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中氯霉素類藥物的殘留量。

結(jié)語

綜上所述，文章對動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測方法進行全面深入的探討，介紹了色譜法、免疫分析法和微生物法等多種檢測技術(shù)，各種方法在靈敏度、準(zhǔn)確性、操作簡便性等方面各有優(yōu)勢，為實際檢測工作提供了多種選擇。然而，隨著科技的進步和食品安全要求的不斷提高，技術(shù)工作者仍需繼續(xù)探索更加高效、準(zhǔn)確的檢測方法，力求滿足日益嚴(yán)格的食品安全監(jiān)管需求。同時，也應(yīng)加強相關(guān)法規(guī)的制定和執(zhí)行，確保動物源性食品中氯霉素類藥物殘留得到有效控制，保障公眾健康。

參考文獻：

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[2]劉楚楚，賀麗蘋.動物源性食品中激素類、喹諾酮類、氯霉素類獸藥殘留同時檢測方法研究[J].廣東化工，2022，49（21）： 199-202.

[3]宋心怡，韓中惠，趙曉磊，等.分子印跡電化學(xué)傳感器對動物源性食品中氯霉素殘留檢測方法的建立與應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2024，45（14）：204-214.

[4]伍濤，金志浩，孫潔.HPLC-MS/MS法檢測動物源性食品中氯霉素類藥物殘留研究[J].質(zhì)量與認(rèn)證，2020，（11）：77-79.

收稿時間：2025-03-04

作者簡介：王琦（1982—），男，本科，工程師。研究方向：獸藥殘留。