豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附及致炎作用的影響

摘 要：本文根據(jù)豬源糞腸球菌的分離與鑒定得到豬源糞腸球菌N8與N41菌株，通過(guò)革蘭氏染色、顯微鏡觀察等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，分析不同豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附情況。結(jié)果顯示通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌會(huì)引起IPEC-J2細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的炎癥水平，同時(shí)會(huì)增加陽(yáng)性細(xì)胞因子表達(dá)，通過(guò)該作用可加快上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本文主要分析豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附及致炎作用機(jī)制，為防范與干預(yù)豬源糞腸球菌提供參考。

關(guān)鍵詞：豬源糞腸球菌；豬小腸上皮細(xì)胞；黏附；致炎

豬源糞腸球菌是引起豬腸道感染的常見(jiàn)腸球菌種之一，本身屬于革蘭氏陽(yáng)性球菌，也是一種常見(jiàn)的條件性致病菌[1]。在人體與動(dòng)物的腸道、糞便中均存在糞腸球菌，也是現(xiàn)階段醫(yī)院獲得性感染的主要病原菌之一[2]。隨著臨床抗生素藥物的不合理使用以及違規(guī)使用獸藥等原因，造成糞腸球菌中存在一定的多重耐藥菌株，增加感染后的治療難度，具有潛在的健康威脅[3]。結(jié)合細(xì)菌感染宿主過(guò)程的分析，細(xì)菌需要在前期完成黏附、定植，不同細(xì)菌可通過(guò)不同的黏附機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主的黏附與感染，雖然宿主機(jī)體存在免疫作用機(jī)制也可抑制細(xì)菌，但是不同細(xì)菌存在不同的免疫逃逸機(jī)制，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在機(jī)體中的定植。糞腸球菌對(duì)動(dòng)物、人類(lèi)均有影響，但是關(guān)于糞腸球菌對(duì)腸上皮細(xì)胞黏附、打破屏障機(jī)制以及引發(fā)細(xì)胞炎性應(yīng)答的作用機(jī)制尚不明確，需要繼續(xù)做好研究[4]?；诖耍疚膶?duì)豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附及致炎作用的影響機(jī)制開(kāi)展試驗(yàn)分析研究，以為更多糞腸球菌的研究與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

根據(jù)豬源糞腸球菌的分離與鑒定方法得到豬源糞腸球菌N8與N41菌株，同時(shí)由動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供對(duì)照菌株大腸埃希菌O157：H7、豬小腸上皮細(xì)胞。

試驗(yàn)中使用的試劑主要有羊抗兔二抗，并經(jīng)過(guò)異硫氰酸酯與辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記，胎牛血清、化學(xué)發(fā)光顯色液、營(yíng)養(yǎng)液等。

所使用的儀器主要有酶標(biāo)儀、熒光定量PCT儀器、凝膠成像系統(tǒng)、細(xì)菌濁度計(jì)、電子顯微鏡、熒光顯微鏡、電泳儀等，所有實(shí)驗(yàn)中所用儀器均滿足精度質(zhì)控要求。

1.2 方法

本次實(shí)驗(yàn)主要完成的內(nèi)容包括染色鏡檢觀察、制備糞腸球菌的滅活與抗體、間接免疫熒光顯微鏡下觀察糞腸球菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，在完成間接免疫熒光檢查的基礎(chǔ)上使用電子顯微鏡觀察糞腸球菌黏附豬小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)。在上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物檢測(cè)方面，分析糞腸球菌誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的變化，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，即大腸埃希菌O157：H7，使用多種上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物并完成分析，同時(shí)在ECL顯色后完成具體結(jié)果的觀察。在糞腸球菌黏附在豬小腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)檢測(cè)方面，通過(guò)對(duì)細(xì)胞樣品的處理，然后提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄操作得到所需要的樣品。在測(cè)定細(xì)胞炎性因子過(guò)程中，要按照細(xì)胞因子基因序列完成PCR引物序列的設(shè)計(jì)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均由專(zhuān)業(yè)人士完成，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程、不同試劑盒操作說(shuō)明等完成具體操作以及試驗(yàn)結(jié)果的記錄與分析。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察在實(shí)驗(yàn)操作期間的不同現(xiàn)象以及不同方法檢測(cè)后對(duì)應(yīng)結(jié)果的相同點(diǎn)與不同點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色與吉姆薩染色鏡檢情況

豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附后，分別采取常規(guī)革蘭氏染色鏡檢與吉姆薩染色鏡檢，在顯微鏡下均可見(jiàn)豬小腸上皮細(xì)胞的表面以及細(xì)胞之間連接較緊密的區(qū)域均存在糞腸球菌的黏附。豬小腸上皮細(xì)胞中的糞腸球菌黏附有一定的聚集作用，黏附存在明顯的不均勻特點(diǎn)。不同染色鏡檢下所看到的豬小腸上皮細(xì)胞被糞腸球菌黏附情況存在一致性。

2.2 間接免疫熒光觀察結(jié)果

對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞在糞腸球菌黏附后的表現(xiàn)使用間接免疫熒光法完成檢測(cè)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，同未受到糞腸球菌黏附感染的豬小腸上皮細(xì)胞相比，豬小腸上皮細(xì)胞在被糞腸球菌黏附感染后，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞膜上存在綠色熒光，且整體熒光較明顯。觀察中再次發(fā)現(xiàn)糞腸球菌在豬小腸上皮細(xì)胞的黏附有聚集性，黏附存在不均勻的特點(diǎn)，對(duì)應(yīng)表現(xiàn)與革蘭氏染色與吉姆薩染色鏡檢情況存在一致性。

2.3 電子顯微鏡觀察結(jié)果

通過(guò)掃描電子顯微鏡圖片，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌黏附在豬小腸上皮細(xì)胞體內(nèi)的形態(tài)與體外模擬實(shí)驗(yàn)基本一致，有微絨毛存在頂端。豬小腸上皮細(xì)胞受到糞腸球菌黏附后，主要集中在頂端微絨位置，同樣能看到糞腸球菌在黏附過(guò)程中存在的聚集性。電子顯微鏡下可見(jiàn)糞腸球菌在侵入細(xì)胞過(guò)程中可借助自身絨毛屏障與細(xì)胞壁結(jié)合，并伴有內(nèi)陷，此階段為糞腸球菌侵入細(xì)胞的初始階段。

2.4 糞腸球菌侵入對(duì)細(xì)胞炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

在分析糞腸球菌侵入對(duì)細(xì)胞炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響方面，使用熒光定量PCR技術(shù)，并設(shè)置空白對(duì)照組，然后與感染組完成對(duì)比分析。與對(duì)照組相比，糞腸球菌侵入細(xì)胞后對(duì)常見(jiàn)的白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-１β的表達(dá)規(guī)律存在相似性。糞腸球菌對(duì)侵入細(xì)胞后的前

4 h，炎癥反應(yīng)整體呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但是在感染4～6 h，此時(shí)的炎癥反應(yīng)則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，不過(guò)整體炎癥因子表達(dá)水平較對(duì)照組更高。根據(jù)對(duì)不同糞腸球菌侵入細(xì)胞后所產(chǎn)生炎癥因子表達(dá)的情況，不同糞腸球菌侵入對(duì)炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響存在差異，說(shuō)明不同糞腸球菌在侵入豬小腸上皮細(xì)胞后對(duì)炎性因子的作用機(jī)制有所不同。

2.5 細(xì)菌感染對(duì)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的影響

對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞采取糞腸球菌感染以及大腸埃希菌感染部位，在感染12 h后分析，了解豬小腸上皮細(xì)胞中標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄水平。從波形蛋白、蝸形蛋白、β-連環(huán)蛋白、Ｅ-鈣黏蛋白等方面進(jìn)行分析，大腸埃希菌在感染豬小腸上皮細(xì)胞后，上述標(biāo)志物的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，但是糞腸球菌對(duì)上述標(biāo)志物中的Ｅ-鈣黏蛋白的表達(dá)部分產(chǎn)生抑制，對(duì)其他mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響較小，糞腸球菌在感染后，不同標(biāo)志物蛋白的表達(dá)量同mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化存在一致性。

3 討論

在豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞黏附及致炎作用影響研究過(guò)程中，設(shè)置了不同豬源糞腸球菌對(duì)照以及大腸埃希菌感染對(duì)照，在了解具體豬源糞腸球菌感染豬小腸上皮細(xì)胞黏附機(jī)制方面，采取了多種實(shí)驗(yàn)室檢查方法，不同實(shí)驗(yàn)方法對(duì)應(yīng)的結(jié)果一致。豬源糞腸球菌在感染豬小腸上皮細(xì)胞后在體外可產(chǎn)生黏附，而且呈現(xiàn)出聚集性黏附現(xiàn)象。通過(guò)電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)糞腸球菌在侵入細(xì)胞過(guò)程中可借助自身絨毛屏障與細(xì)胞壁結(jié)合，并伴有內(nèi)陷，分析可能是因糞腸球菌在感染細(xì)胞過(guò)程中會(huì)釋放溶細(xì)胞素等毒力因子，造成細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷。其他報(bào)道中也證實(shí)了溶細(xì)胞素的表達(dá)同糞腸球菌感染性密切相關(guān)，通過(guò)溶細(xì)胞素的作用讓細(xì)菌能更好地侵入細(xì)胞中[5]。

細(xì)菌感染后可伴有明顯的炎癥因子水平升高，這一結(jié)論在臨床醫(yī)學(xué)已經(jīng)得到證實(shí)，早期炎癥因子是機(jī)體免疫應(yīng)答的表現(xiàn)，但是在炎癥因子水平過(guò)高的情況下同樣也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，換言之，細(xì)菌感染后機(jī)體炎癥因子變化受到多種作用機(jī)制的調(diào)控，使其保持在相對(duì)合理的范圍內(nèi)，同時(shí)體現(xiàn)出機(jī)體的免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)狀況[6]。不同糞腸球菌因?yàn)樵诙玖Ψ矫娲嬖诓煌?，所以在感染?xì)胞后所引起的炎癥反應(yīng)變化、炎癥反應(yīng)強(qiáng)度均有不同，不過(guò)具體的作用機(jī)制依然需要加大研究。糞腸球菌感染豬小腸上皮細(xì)胞后對(duì)常見(jiàn)的上皮細(xì)胞中標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平影響較小，說(shuō)明糞腸球菌作為一種條件性致病菌，不會(huì)促進(jìn)病理性的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，也不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞骨架遷移，而且不同標(biāo)志物蛋白的表達(dá)量同mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化均保持一致[7]。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，豬源糞腸球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞有黏附作用，同時(shí)會(huì)增加陽(yáng)性細(xì)胞因子表達(dá)，通過(guò)該作用可以致炎并加快上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

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2023，56（16）：3213-3225.

收稿時(shí)間：2025-03-12

作者簡(jiǎn)介：李躍強(qiáng)（1976—），男，本科，獸醫(yī)師。研究方向：畜牧獸醫(yī)。