谷子SiCDPK9基因的克隆、亞細(xì)胞定位與鹽脅迫下表達(dá)分析

摘要：雜種優(yōu)勢是指雜交子1代（F1）在生物量、產(chǎn)量、適應(yīng)性、抗逆性等性狀上優(yōu)于雙親的現(xiàn)象，其廣泛使用使得玉米、高粱、水稻等作物產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)大幅提升。近年來，谷子雜交種選育工作也取得較大進(jìn)展，但關(guān)于雜種優(yōu)勢形成的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尚不多見。SiCDPK9是前期通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)基因，為闡明其功能及其參與產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成的作用機(jī)制，本研究以谷子強(qiáng)優(yōu)勢雜交種56229的幼穗為材料，克隆SiCDPK9基因，采用生物信息學(xué)方法分析其序列特征，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在鹽脅迫處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，SiCDPK9基因的開放閱讀框長度為1 749 bp，編碼582個(gè)氨基酸，具有典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和EF-hand類鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域；SiCDPK9為不穩(wěn)定的親水性蛋白，分子質(zhì)量為64.40 ku，理論等電點(diǎn)為9.08；SiCDPK9蛋白具有48個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)棕櫚酰化修飾位點(diǎn)，不含信號肽序列；SiCDPK9蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，定位于細(xì)胞膜；通過氨基酸序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，SiCDPK9與水稻小穗育性相關(guān)基因OsCPK9的氨基酸序列相似性高、親緣關(guān)系近；外源NaCl處理后，SiCDPK9的表達(dá)水平先升后降。以上結(jié)果暗示SiCDPK9基因可能通過響應(yīng)逆境脅迫而參與對谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：谷子；雜種優(yōu)勢；鈣依賴蛋白激酶；生物信息學(xué)分析；亞細(xì)胞定位

中圖分類號：S188；S515.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0178-08

收稿日期：2022-04-05

基金項(xiàng)目：河北省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號：21326302D）；河北省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金；唐山市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號：20130218b）；唐山師范學(xué)院科學(xué)研究基金（編號：2020A06）。

作者簡介：崔燕嬌（1989—），女，河北灤縣人，博士，講師，主要從事谷子雜種優(yōu)勢利用研究，E-mail：cuiyj189@163.com；共同第一作者，劉 丹（1989—），女，河北滄縣人，博士，副研究員，主要從事谷子雜種優(yōu)勢利用和小麥遺傳育種研究，E-mail：dannieliu89@126.com。

通信作者：劉正理，教授，主要從事谷子雜種優(yōu)勢利用研究。E-mail：liuzhengli65@126.com。

雜種優(yōu)勢是指雜交子一代在生物量、產(chǎn)量、適應(yīng)性、抗逆性等多種性狀上優(yōu)于親本的生物學(xué)現(xiàn)象，在自然界中普遍存在。一個(gè)多世紀(jì)以來，雜種優(yōu)勢已廣泛應(yīng)用于玉米（Zea mays L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、水稻（Oryza sativa L.）等重要農(nóng)作物的生產(chǎn)，促進(jìn)此類農(nóng)作物的產(chǎn)量提升和品質(zhì)改良［1-3］。目前，雜種優(yōu)勢利用在提高谷子［Setaria italica （L.） Beauv.］雜交種增產(chǎn)潛力方面也取得了一定成績，如張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的張雜谷5號于2007年創(chuàng)造了12 150 kg/hm2的春谷高產(chǎn)紀(jì)錄［4］，唐山師范學(xué)院選育的冀雜谷5號于2016年創(chuàng)造了11 400 kg/hm2以上的夏谷高產(chǎn)新紀(jì)錄［5］。關(guān)于雜種優(yōu)勢的遺傳基礎(chǔ)也有了一定研究，但其具體的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不甚清晰，嚴(yán)重限制了谷子雜種優(yōu)勢利用水平的進(jìn)一步提高。

為了闡明雜種優(yōu)勢形成的分子機(jī)理，近年來國內(nèi)外研究人員通過分子標(biāo)記、基因芯片、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)對雜種優(yōu)勢相關(guān)基因進(jìn)行挖掘和鑒定。對擬南芥F1雜交后代的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，其生物量雜種優(yōu)勢與生物和非生物脅迫響應(yīng)基因表達(dá)水平的下調(diào)有關(guān)，抑制脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)可以顯著提高其生物量雜種優(yōu)勢［6-7］。對2個(gè)玉米雜交種ZD808、ZD909及其親本進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)雜交種的優(yōu)良農(nóng)藝性狀分別與一些脅迫響應(yīng)和代謝功能相關(guān)蛋白、光合作用相關(guān)蛋白的高表達(dá)有關(guān)［8］。Li等對兩系超級雜交稻品種JLYHZ、LLYHZ及其親本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選得到差異表達(dá)基因，功能富集分析表明這些基因主要富集在節(jié)律、對水分和低溫等生物和非生物脅迫的響應(yīng)以及光合作用等途徑，這些基因可能在水稻雜種優(yōu)勢形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。這些研究結(jié)果表明，逆境脅迫響應(yīng)基因可能參與雜種優(yōu)勢的形成和調(diào)控，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，簡稱CDPK）存在于原生生物、綠藻和植物中，作為一種鈣離子傳感蛋白，它能夠與細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使鈣離子結(jié)合，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為動(dòng)植物體內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)。CDPK蛋白由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別是N端的可變結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制連接區(qū)和C端用于結(jié)合鈣離子的類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域［10］。研究表明，CDPK在植物的生長發(fā)育、激素信號通路以及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在植物中，CDPK由多基因家族編碼。目前，在擬南芥［11］、水稻［12-13］、小麥［14］、玉米［15］、大麥［16］等植物中已分別鑒定到34、31、20、40、27個(gè)CDPK基因。項(xiàng)目組在前期研究中鑒定到28個(gè)谷子CDPK基因家族成員［17］，但目前關(guān)于其功能分析和作用機(jī)制的研究十分有限。有報(bào)道表明，多數(shù)谷子CDPK基因的表達(dá)水平都受到干旱、極端溫度、ABA等非生物脅迫的誘導(dǎo)或抑制［18-19］，其中SiCDPK24基因的過表達(dá)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在干旱脅迫下的存活率以及抗旱性［18］；SiCDPK7基因是谷子對極端溫度脅迫的正向調(diào)節(jié)因子，該基因的過表達(dá)能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和谷子植株對熱脅迫的耐受性［19］。除非生物脅迫外，谷子CDPK基因可能在生物脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，如在接種黑粉菌后，SiCDPK基因的轉(zhuǎn)錄水平提高59.8%，說明該基因可能是谷子粒黑穗病的抗性基因［20］。

綜上，脅迫響應(yīng)基因可能與雜種優(yōu)勢的形成有關(guān)，而CDPK基因又參與植物抗逆過程的調(diào)控，因此，CDPK基因很可能是雜種優(yōu)勢形成的重要調(diào)控因子。筆者所在項(xiàng)目組在前期研究中通過轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到一個(gè)潛在的谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)基因SiCDPK4，通過對其時(shí)空表達(dá)模式的分析，發(fā)現(xiàn)在灌漿期SiCDPK4基因在強(qiáng)優(yōu)勢雜交種葉、穗中的表達(dá)水平顯著高于弱優(yōu)勢、中優(yōu)勢雜交種［17］，進(jìn)一步證明CDPK基因在雜種優(yōu)勢中的關(guān)鍵作用。SiCDPK9是前期轉(zhuǎn)錄組測序中篩選到的另一潛在的產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)基因，該基因在強(qiáng)優(yōu)勢雜交種谷子幼穗中的表達(dá)水平顯著高于弱優(yōu)勢、中優(yōu)勢雜交種和常規(guī)品種。本研究以谷子強(qiáng)優(yōu)勢雜交種56229的幼穗為材料，克隆到SiCDPK9基因，對其序列和進(jìn)化特征進(jìn)行分析，構(gòu)建35S：SiCDPK9-GFP表達(dá)載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化谷子原生質(zhì)體，對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，并通過鹽脅迫下的表達(dá)模式分析，初步探明SiCDPK9基因的功能及其參與谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步提升我國谷子雜種優(yōu)勢利用的研究水平、發(fā)揮谷子雜交種的增產(chǎn)潛力提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子強(qiáng)優(yōu)勢雜交種56229和常規(guī)品種冀谷32由唐山師范學(xué)院谷子研究所保存。2018年6月將56229種植于唐山師范學(xué)院灤南谷子科研試驗(yàn)站，并于8月孕穗期取長1.5～2.0 cm的幼穗為試驗(yàn)材料，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，待提取RNA，用于SiCDPK9基因的克隆。2022年6月將冀谷32種植于唐山師范學(xué)院谷子研究所，并對4～5葉期的幼苗噴施50 mmol/L NaCl，分別取NaCl處理0、1、2、3、4、6 h的葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存，待提取RNA，用于SiCDPK9基因的表達(dá)模式分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SiCDPK9基因的克隆 采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取谷子總RNA，利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116）合成cDNA，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得SiCDPK9基因（SETIT_034847mg）序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物SiCDPK9-F（5′-GCAACAGCAACTCCAGGTA-3′）和SiCDPK9-R（5′-AGACAACCCTATCTCCATTCA-3′）。以谷子cDNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為60 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，與pEASY-Blunt Cloning Vector載體（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)并培養(yǎng)，挑取經(jīng)菌落PCR檢測的陽性克隆送測序。

1.2.2 SiCDPK9基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder軟件查找SiCDPK9基因的開放閱讀框，并在DNAMAN軟件中推導(dǎo)出其氨基酸序列。利用ProtParam網(wǎng)站分析蛋白的理化性質(zhì)，采用在線軟件ProtScale分析親疏水性，通過SignalP 5.0 Server對信號肽進(jìn)行預(yù)測，利用SMART網(wǎng)站預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，采用NetPhos 3.1在線工具預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，利用GPS-Lipid網(wǎng)站對N-豆蒄酰化、棕櫚酰化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，通過SOPMA數(shù)據(jù)庫對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用SWISS-MODEL對蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。采用DNAMAN軟件將谷子SiCDPK9與水稻、高粱、玉米、小麥（Triticum aestivum L.）、二穗短柄草［Brachypodium distachyon （L.） Beauv.］、大麥（Hordeum vulgare L.）的CDPK氨基酸序列進(jìn)行多重比對，利用MEGA 7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap為1 000）。

1.2.3 SiCDPK9基因的表達(dá)分析 提取NaCl處理的谷子樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)克隆的SiCDPK9基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物qRT-SiCDPK9-F（5′-GGCGATGAACAAGCTGAAGAA-3′）和qRT-SiCDPK9-R（5′-CGAACATGTCCCGGATCAC-3′），以谷子Actin（qRT-SiActin-F序列為GGATACTCTTTCACCACCTC；qRT-SiActin-R序列為ACCTCAGGGCACCTAAAC）作為內(nèi)參基因，應(yīng)用QuantStudioTM 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）分析鹽脅迫下SiCDPK9基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系按照天根生化科技（北京）有限公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（FP205）說明設(shè)置。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，按照2-ΔΔCT法計(jì)算SiCDPK9基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 SiCDPK9基因的亞細(xì)胞定位 以SiCDPK9-pEASY-Blunt質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物SiCDPK9-HindⅢ-F（5′-CCCAAGCTTATGGGCAACGTGTGCTTCTG-3′）和SiCDPK9-SpeⅠ-R（5'-GGACTAGTGCGCGCCATGCCGA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去除SiCDPK9基因3′端終止密碼子，分別在上、下游引入HindⅢ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)將pCAMBIA1300-GFP載體質(zhì)粒用HindⅢ和SpeⅠ雙酶切。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體質(zhì)粒目的片段回收，用T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，構(gòu)建C端與GFP融合的35S：SiCDPK9-GFP表達(dá)載體，培養(yǎng)過夜后挑取經(jīng)PCR檢測的陽性菌落送測序。參照Yoo等建立的方法［21］提取谷子原生質(zhì)體，并在PEG介導(dǎo)下將融合載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，經(jīng)暗培養(yǎng)后通過激光共聚焦顯微鏡觀察SiCDPK9的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子SiCDPK9基因的克隆

以谷子強(qiáng)優(yōu)勢雜交種56229的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SiCDPK9基因序列全長，測序結(jié)果表明，該基因開放閱讀框長度為1 749 bp，編碼582個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 SiCDPK9序列分析

2.2.1 SiCDPK9蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 SMART在線程序分析結(jié)果顯示，SiCDPK9蛋白含有典型的CDPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域，N端具有絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（位置109～367），C端具有4個(gè) EF-hand 類鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（位置414～550）（圖2）。

2.2.2 SiCDPK9蛋白理化性質(zhì)分析 ProtParam在線工具分析表明，SiCDPK9蛋白的分子式為C2 821H4 517N843O839S23，分子質(zhì)量為64.40 ku，理論等電點(diǎn)為9.08，屬于堿性蛋白。該蛋白由20種氨基酸組成，其中色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）占比最低（1.0%），丙氨酸（Ala）占比最高（11.9%）。SiCDPK9蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.61，親水性平均值（GRAVY）為-0.473；ProtScale分析結(jié)果表明多肽鏈第56位的賴氨酸親水性最強(qiáng)，得分為-2.944，第300～302位的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸疏水性最強(qiáng)，得分為2.822，且整體親水性位點(diǎn)多于疏水性位點(diǎn)，推測該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白（圖3）。

2.2.3 SiCDPK9蛋白信號肽和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 SignalP 5.0 Server軟件分析結(jié)果顯示，SiCDPK9蛋白不含信號肽序列和信號肽切割位點(diǎn)。NetPhos 3.1軟件預(yù)測結(jié)果表明，SiCDPK9蛋白有24個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，19個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，共計(jì)48個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖4）。

2.2.4 SiCDPK9蛋白脂質(zhì)修飾位點(diǎn)預(yù)測 采用GPS-Lipid在線工具對SiCDPK9蛋白的脂質(zhì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其N末端第5位和第7位的Cys（MGNVCFCGTTST）為潛在的棕櫚酰化修飾位點(diǎn)。

2.2.5 SiCDPK9蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 SOPMA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，SiCDPK9蛋白包含244個(gè)α螺旋、55個(gè)β轉(zhuǎn)角、59條延伸鏈、224個(gè)無規(guī)則卷曲，分別占總氨基酸的41.92%、9.45%、10.14%、38.49%（圖5-A），因此α螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。 通過SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)

行同源建模，選取與SiCDPK9蛋白相似度最高的4ieb.1.A為模板，對其103～550位氨基酸進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測（圖5-B），總體來看，SiCDPK9蛋白三維結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，均以α螺旋和

無規(guī)則卷曲為主。

2.2.6 SiCDPK9編碼的氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將谷子SiCDPK9與NCBI網(wǎng)站上下載的其他6種禾本科植物CDPK的氨基酸序列進(jìn)行比對（圖6-A），發(fā)現(xiàn)其與玉米ZmCPK9（XP_008644596.1）、高粱SbCDPK30（XP_002466648.1）的序列相似性最高，分別為90.97%、90.60%，與水稻OsCPK9（XP_015631324.1）、小麥TaCPK19-4B（ABY59015.1）、大麥HvCPK9（ASL69961.1）、二穗短柄草BdCDPK4（XP_003559564.1）的序列相似性均較高，分別為81.71%、81.26%、80.92%、80.03%，且都具有典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和EF-hand類鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，表明其具備高度保守性。為了進(jìn)一步研究這7個(gè)物種CDPK之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用其氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6-B），結(jié)果顯示這些CDPK被分為2組，SiCDPK9與同屬黍亞科的ZmCPK9、SbCDPK30以及稻亞科的OsCPK9聚為一組，同屬早熟禾亞科的TaCPK19、HvCPK9、BdCDPK4聚為一組，其中SiCDPK9與ZmCPK9、SbCDPK30親緣關(guān)系最近，這與多序列比對的結(jié)果以及物種的實(shí)際進(jìn)化歷程一致。

2.3 SiCDPK9基因表達(dá)分析

為了研究SiCDPK9基因的功能和作用機(jī)制，對50 mmol/L NaCl處理后不同時(shí)間點(diǎn)的谷子葉片中SiCDPK9基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在NaCl處理后，SiCDPK9基因的表達(dá)水平出現(xiàn)了先升后降的趨勢，約在處理后3 h達(dá)到峰值（圖7），說明其在植物對鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮作用。

2.4 SiCDPK9亞細(xì)胞定位分析

利用基因重組技術(shù)，將去掉終止密碼子的SiCDPK9基因片段插入到pCAMBIA1300-GFP載體中，構(gòu)建35S：SiCDPK9-GFP表達(dá)載體（圖8-A），并將其轉(zhuǎn)入谷子原生質(zhì)體，通過激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的位置，發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體細(xì)胞膜上能夠觀察到明亮的綠色熒光信號，表明SiCDPK9蛋白定位于細(xì)胞膜（圖8-B）。

3 討論與結(jié)論

谷子作為一種重要的雜糧和飼料作物，在我國已有7 000多年的栽培歷史。但是，由于谷子主要分布在中國、印度等發(fā)展中國家，科研相對滯后，雜種優(yōu)勢利用研究比較薄弱，在雜種優(yōu)勢相關(guān)基因的挖掘和雜種優(yōu)勢分子機(jī)理方面的研究更是缺乏。為了剖析谷子雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制，筆者所在項(xiàng)目組在前期研究中篩選到一個(gè)潛在的產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢相關(guān)基因SiCDPK9，本研究在谷子幼穗中克隆了SiCDPK9基因，對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，SiCDPK9具有CDPK蛋白的基本特征，N端含有絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，C端具有EF-hand類鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于典型的CDPK家族蛋白，期待可為闡明SiCDPK9的功能及其在谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

為了解析SiCDPK9的功能，本研究將谷子SiCDPK9與6種其他禾本科植物的CDPK蛋白進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在序列和結(jié)構(gòu)上非常保守，親緣關(guān)系較近，因而可能具有相似的生物學(xué)功能。研究表明，水稻OsCPK9基因的轉(zhuǎn)錄受到外源ABA、PEG-6000和鹽處理的誘導(dǎo)，OsCPK9可以通過促進(jìn)氣孔關(guān)閉、提高植株的滲透調(diào)節(jié)能力，而促進(jìn)植株抗旱性的提高［22］；小麥

TaCPK19基因響應(yīng)高鹽和小麥白粉病菌侵染而上調(diào)表達(dá)［14］；在低溫、H2O2等脅迫條件下，二穗短柄草BdCDPK4基因的表達(dá)水平受到顯著的誘導(dǎo)或抑制［23］。由此推斷，谷子SiCDPK9可能也在對生物和非生物脅迫以及激素信號的響應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，進(jìn)而提高谷子對逆境條件的耐受性和抗旱耐瘠能力，提高谷子在逆境條件和干旱、瘠薄條件下的產(chǎn)量。本研究對NaCl處理后谷子中SiCDPK9基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果也進(jìn)一步支持了這一猜測，暗示對高鹽等環(huán)境脅迫應(yīng)答的調(diào)控可能是SiCDPK9參與谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢形成的關(guān)鍵機(jī)制。

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與其功能和作用機(jī)制密切相關(guān)，因此，為進(jìn)一步明確SiCDPK9的功能，本研究利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法分析了SiCDPK9的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，SiCDPK9屬于膜

定位蛋白。當(dāng)植株受到外界逆境脅迫時(shí)，CDPK蛋白作為一種鈣離子傳感器，可以將細(xì)胞中的鈣信號向下游組分傳遞，引起相關(guān)基因的表達(dá)，從而對環(huán)境脅迫作出響應(yīng)。而外界刺激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，主要依賴于鈣離子經(jīng)質(zhì)膜上的離子通道內(nèi)流。因此，SiCDPK9在細(xì)胞膜的定位可能與其接收鈣信號，進(jìn)而調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)的功能密切相關(guān)。研究表明，植物中CDPK蛋白的亞細(xì)胞定位具有多樣性，包括定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂質(zhì)體、過氧化物酶體等［24-25］，其N端的可變結(jié)構(gòu)域在蛋白的定位方面起重要作用。如擬南芥AtCPK2、水稻OsCPK2、番茄LeCPK1等多個(gè)膜定位的CDPK蛋白N末端均含有一段保守的MGXXXSXX序列（X代表任意氨基酸），使其被豆蒄?；?，促進(jìn)蛋白的膜定位；此外，在豆蒄?；揎椢稽c(diǎn)Gly殘基附近的Cys殘基可以被棕櫚?；M(jìn)而增強(qiáng)蛋白的膜結(jié)合能力，使其穩(wěn)定地錨定在脂雙層中［26-29］。因此，N末端的豆蒄?；妥貦磅；揎棇τ诤芏嗟鞍椎哪ざㄎ皇侵陵P(guān)重要的。本研究利用GPS-Lipid在線工具對SiCDPK9的脂質(zhì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，SiCDPK9蛋白N末端第5位和第7位的Cys為潛在的棕櫚酰化修飾位點(diǎn)，據(jù)此推測N末端的棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)可能在其與細(xì)胞膜的結(jié)合中發(fā)揮著重要功能。

有研究發(fā)現(xiàn)，CDPK蛋白不僅在調(diào)控植物對逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮功能，而且參與對作物產(chǎn)量性狀的調(diào)控。TaCPK34是小麥CDPK家族成員，其不僅參與對干旱脅迫響應(yīng)的正向調(diào)控，而且其沉默植株的成熟籽粒在千粒質(zhì)量、粒長、粒寬、淀粉含量等與產(chǎn)量密切相關(guān)的籽粒性狀方面均表現(xiàn)出了顯著的下降［30］。OsCPK18/OsCPK4是水稻免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子［31-32］，同時(shí)也是干旱和高鹽脅迫響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子［33］。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，OsCPK18的敲減株系對稻瘟病的抗性增強(qiáng)，并且表現(xiàn)出株高、分蘗數(shù)和千粒質(zhì)量等產(chǎn)量相關(guān)性狀的顯著下降，而過表達(dá)植株則表現(xiàn)出相反的表型［34］，說明OsCPK18正向調(diào)控水稻植株高度和產(chǎn)量。另一水稻CDPK蛋白OsCPK9不僅能提高植株對干旱脅迫的耐受性，而且可以提高花粉活力，進(jìn)而增加小穗育性，而小穗育性是水稻產(chǎn)量的重要組成部分［22］。同時(shí)，育性也是作物雜種優(yōu)勢的重要性狀，本研究通過多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)SiCDPK9與OsCPK9序列相似性高，親緣關(guān)系近，這也進(jìn)一步支持了SiCDPK9在谷子產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢調(diào)控中的潛在作用。

綜上，SiCDPK9可能在逆境脅迫響應(yīng)和產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢中均起著重要調(diào)控作用，而抗逆基因又與雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生有關(guān)，因此，推測SiCDPK9基因很可能是通過調(diào)控谷子對環(huán)境脅迫的響應(yīng)而在產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢的形成和調(diào)控中發(fā)揮功能的，但其具體的功能和分子機(jī)制仍有待深入探究。

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