毛竹PeNHX基因家族的鑒定及其對鹽脅迫的響應

摘要：毛竹（Phyllostachys edulis）是我國經(jīng)濟生產(chǎn)應用最多的竹種，研究其對鹽脅迫的耐受機制，能夠促進毛竹經(jīng)濟林種植，同時也能為抗鹽植物培育提供新的種質資源。以毛竹中的Na+/H+反轉運蛋白編碼基因家族為研究對象，對其理化性質、染色體分布、順式作用元件、物種內和物種間的進化關系、鹽脅迫下的轉錄表達特征、PeNHX7基因的共表達網(wǎng)絡及互作蛋白質進行深入分析。結果表明，毛竹基因組中共有16個PeNHX基因家族成員，可劃分為3個亞家族；家族成員的相對分子質量主要為30～60 ku，相差較大；理論等電點pI為5～9，不均等分布在毛竹的11條scaffold上。PeNHX編碼的蛋白質結構中，motif1、motif2、motif9在Class Ⅰ亞家族中保守，而motif5、motif6則在Class Ⅲ亞家族中保守。轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，全部16個PeNHX基因家族成員均不同程度地參與毛竹對長期（24 h）鹽脅迫的應答過程，而只有PeNHX4.3、PeNHX4.4響應短期的鹽脅迫處理（3 h）。通過進化分析發(fā)現(xiàn)，毛竹中的PeNHX7為主系遺傳基因，其編碼產(chǎn)物與擬南芥、水稻、小麥中的SOS1蛋白質高度同源，可能是因為毛竹在應答脅迫中主要將Na+轉運出細胞蛋白質。對毛竹PeNHX7進行共表達分析，篩選到14個與植物生理活動相關的轉錄因子的表達與PeNHX7具有高權重共表達關系。

關鍵詞：毛竹；PeNHX；鹽脅迫；Na+/H+反轉運蛋白；基因家族分析

中圖分類號：S188；S795.701" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0169-09

收稿日期：2024-01-09

基金項目：四川省自然科學基金（編號：2022NSFC1766）；國際竹藤中心項目（編號：2021YFD2200505-2）。

作者簡介：朱 澤（1998—），男，甘肅張掖人，碩士研究生，主要主要從事竹類分子生物學方面的研究。E-mail：2259918044@qq.com。

通信作者：胡尚連，女，博士，主要從事竹類分子生物學方面的研究。E-mail：hushanglian@swust.edu.cn。

土壤鹽漬化是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要制約因素之一，全球約有1.1×109 hm2的土地為鹽堿地，其中有14%完全不能用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［1］。我國有 3.69×107 hm2 的鹽漬化土地，嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［2］。土壤鹽漬化的主要成分是NaCl，過量的Na+被根系吸收后會嚴重破壞植物的各種生理生化進程，進而抑制植物生長。植物受鹽脅迫的早期表現(xiàn)為滲透脅迫，同時存在Na+堆積而引發(fā)的離子脅迫，而離子脅迫則會進一步引起活性氧（ROS）、羥自由基、過氧化氫等有害化合物在植物細胞中的積累，最終導致營養(yǎng)平衡被破壞，植物細胞膜脂被瓦解，代謝酶活性下降［3-5］。

高等植物在進化過程中逐漸發(fā)展出一系列抵抗鹽脅迫的生理生化反應以及分子調控機制。為了應對鹽脅迫造成的細胞中Na+的過度累積，植物可以通過質膜、胞質、液泡膜上的Na+/H+反轉運蛋白（Na+/H+ anti-porter，NHX），將多余的Na+隔離到液泡中，從而避免高鹽脅迫帶來的危害［6］。此外，NHX蛋白質還參與細胞擴增、膜泡運輸、酸堿度穩(wěn)態(tài)等多種植物生理過程。在水稻中，高鹽、滲透脅迫、外源ABA處理都會誘導OsNHX1、OsNHX2、OsNHX3、OsNHX5基因的表達，并且這些基因表達模式的差異可以決定水稻不同品種對鹽脅迫的耐受程度［7］。將OsNHX1基因異源轉化到黑麥草、甘藍中，也能有效提升這些植物對鹽脅迫的耐受程度［8-9］。過表達AtNHX5基因的植物，其地上部分細胞中Na+的濃度顯著上升，也表現(xiàn)出對鹽脅迫耐受程度的提 高［10］。SOS信號通路（salt overly sensitive pathway）是植物鹽脅迫應答中的關鍵信號通路，在擬南芥、楊樹、水稻等多種植物中被發(fā)現(xiàn)并驗證，由編碼Na+/H+反轉運蛋白的SOS1基因、編碼蛋白激酶的SOS2基因、編碼鈣結合蛋白的SOS3基因組成；當植物受到鹽脅迫時，由SOS3、SOS2蛋白質激活位于質膜上的SOS1蛋白質，將胞內多余的Na+排出細胞，發(fā)揮抗鹽功能［11-13］。van Zelm等研究發(fā)現(xiàn)，NHX1、NHX2蛋白質主要作用于K+及酸堿度的穩(wěn)態(tài)，而位于細胞質膜上的AtSOS1/AtNHX7蛋白質對Na+的分泌可能是植物耐鹽的重要決定因素［14］。單雙子葉植物中，SOS1蛋白質功能高度保守，直接影響植物對鹽脅迫的敏感程度［15-18］，調控植物應答鹽脅迫的機制與SOS1蛋白質的空間構象緊密相關［19-20］ 。

毛竹是我國竹類中分布和運用最廣泛、經(jīng)濟價值最高的一個經(jīng)濟型竹種。已有研究表明，毛竹幼苗具有一定程度的耐鹽能力［21］；而當鹽濃度升高后，毛竹幼苗的生長也會受到抑制［22-23］。毛竹中的PheNAC1轉錄因子與毛竹對鹽脅迫的耐受程度負相關，但與耐鹽相關的SOS1基因未見報道［24］ 。在本研究中，通過對毛竹進行全基因組鑒定，采用生物信息學方法，分析鑒定出16個編碼NHX蛋白質的基因。通過同源比對、亞細胞定位預測、基因結構及順式作用元件分析，初步確定PeNHX7蛋白質是毛竹參與鹽脅迫應答通路的重要因子，通過加權基因共表達分析，找出其潛在的調節(jié)因子，期待可為后續(xù)揭示毛竹耐鹽機制及抗鹽植物種質資源研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 毛竹PeNHX基因家族鑒定

基于毛竹全基因組數(shù)據(jù)和PFAM數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.janelia.org/），對毛竹中PeNHX基因家族成員進行篩選。根據(jù)NHX結構域的HMM文件（PF00999）在毛竹基因組數(shù)據(jù)中查詢，并對查找出的NHX蛋白質的保守結構域進行驗證。將篩選到的NHX蛋白質與已知功能的其他物種（擬南芥、水稻、小麥）的NHX蛋白質進行同源比對。

1.2 毛竹PeNHX基因的亞細胞定位與理化性質分析

利用在線網(wǎng)站Expasy-ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/），對毛竹PeNHX基因家族蛋白的氨基酸大小、分子量、等電點、疏水性等基本理化性質進行預測。利用在線網(wǎng)站TMHMM Server v2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.phpTMHMM-2.0），對毛竹PeNHX基因家族蛋白跨膜螺旋數(shù)量進行預測。利用在線網(wǎng)站CELLO（http：//cello.life.nctu.edu），對毛竹PeNHX基因家族成員編碼的蛋白質進行亞細胞定位預測。

1.3 進化樹構建

用Muscle將毛竹和擬南芥中的NHX家族成員氨基酸序列進行比對后，利用iqtree篩選到最佳匹配模型，將比對結果建立進化樹，其中Bootstrap設置為1 000，其他參數(shù)為默認值。

1.4 染色體定位分析

使用TBtools軟件中染色體定位功能（gene location visualize from GTF/GFF），將毛竹PeNHX基因家族的gff文件以及毛竹PeNHX基因家族的基因名稱導入，最終得到毛竹PeNHX基因家族在染色體上的分布。

1.5 保守基序與基因結構分析

利用毛竹基因組注釋文件，使用TBtools軟件構建毛竹PeNHX基因家族的結構圖。利用在線網(wǎng)站MEME在線工具（citation，http：//meme.sdsc.edu/meme/），對毛竹PeNHX基因家族進行保守基序的預測分析，其中motif數(shù)量設置為10，其他參數(shù)為默認值。

1.6 共線性分析

使用MCScanX軟件對毛竹以及擬南芥NHX基因家族進行共線性分析，并使用TBtools軟件繪制物種間共線性關系圖。使用MCScanX軟件對毛竹PeNHX基因家族內部進行共線性分析，并使用TBtools軟件繪制物種間共線性關系圖。

1.7 基因轉錄組表達量分析

從GEO DataSets（gene expression omnibus data base）數(shù)據(jù)庫中下載毛竹在NaCl脅迫后3、24 h后的RNA-Seq數(shù)據(jù)（GSE169067），進行歸一化處理后，使用TBtools軟件制作熱圖。

2 結果與分析

2.1 基因家族成員鑒定及染色體位置分析

利用PFAM的NHX結構域HMM文件（PF00999），在毛竹基因組數(shù)據(jù)中查詢PeNHX基因及蛋白質和核苷酸序列。在PFAM數(shù)據(jù)庫中對NHX蛋白的保守結構域進行查找后，鑒定出54個含有NHX結構域的蛋白質，再通過與已知功能的NHX蛋白質進行同源比對后，最終鑒定出16個毛竹中編碼NHX蛋白質的基因（表1）。

其中，氨基酸序列最短的為PeNHX5.3蛋白質（PH02Gene30966.t1），共134個氨基酸，分子量為16.01 ku；氨基酸序列最長的是PeNHX4.3蛋白質（PH02Gene47256.t1），由1 189個氨基酸組成，分子量為132.42 ku，所有PeNHX蛋白質的平均分子量大小為54.27 ku。PeNHX蛋白質的等電點均在 5～9之間，最小為5.10（PeNHX5.2蛋白質，PH02Gene40685.t1）， 最大的為8.95（PeNHX4.1蛋

白質，PH02Gene33022.t1），平均等電點為6.75。除了PeNHX3蛋白質（PH02Gene 42263.t1），這16個蛋白質都定位在內膜系統(tǒng)上（Inner Membrne），而PeNHX3蛋白質定位在細胞質（Cytoplasmic）中。并且，除了PeNHX3、PeNHX5.3蛋白質外，PeNHX基因家族其他成員編碼的蛋白質結構中均具有5個以上的跨膜結構域。

染色體定位分析結果顯示，16個PeNHX基因分布不均勻，主要集中在11條scaffold上（圖1）。其中，大部分PeNHX基因位于獨立的scaffold上，而PeNHX6.1、PeNHX5.2基因共同存在于3號染色體（scafflod_3）上，PeNHX5.1、PhNHX1.2基因共同分布在19號染色體（scaffold_19）上，在染色體上的位置距離較遠；PeNHX2.2、PeNHX4.1、PeNHX5.3基因則共同分布在18號染色體上；PeNHX6.3基因分布在染色體碎片9648號上。

2.2 系統(tǒng)進化樹構建與保守結構和基因結構分析

為了進一步研究PeNHX基因家族成員間的進化關系，將鑒定出的16個PeNHX蛋白質的氨基酸序列與擬南芥中的NHX成員進行Muscle比對后，利用iqtree建立進化樹。根據(jù)擬南芥中NHX蛋白質的亞細胞定位分為3個亞組，分別位于質膜上的Ⅰ區(qū)（紅色）、位于胞質中的Ⅱ區(qū)（紫色）、位于液泡膜上的Ⅲ區(qū)（藍色）（圖2）。Class Ⅰ中包含7條PeNHX序列，分別與AtNHX7、AtNHX6、AtNHX5同源；Class Ⅲ中包含8條PeNHX序列，與擬南芥中AtNHX1、AtNHX2、AtNHX4同源；Class Ⅱ中僅包含PH02Gene 42263.t1/PeNHX3，與AtNHX3同樣定位在胞內體上。

將鑒定出的16個PeNHX家族成員的氨基酸序列提交至SMART（http：//smart.embl.de/）在線網(wǎng)站進行保守結構域分析，結果表明其均包含Na_H_Exchanger結構域，且多數(shù)分布在蛋白質的N端（圖3）。

使用MEME在線工具對該基因家族的保守基序進行預測，結果顯示，ClassⅠ與ClassⅡ亞家族內部成員之間的保守基序更相近。其中，motif1、motif2、motif9為Class Ⅰ中的成員中的高度保守基序，motif3、motif5、motif6為Class Ⅱ成員中的高度保守基序，其他基序在家族成員中出現(xiàn)的頻率及位置具有較大差異（圖4）。而基因結構在亞家族之間也有差異，Class Ⅰ與Class Ⅱ家族成員的內含子總數(shù)量相近，而Class Ⅲ中的PeNHX3明顯具有更多的內含子（圖4）。這些保守基序和基因結構的差異都可能會導致編碼產(chǎn)物功能的多樣化。

2.3 毛竹PeNHX基因啟動子的順式作用元件

通過對毛竹PeNHX基因家族成員啟動子上順式作用元件的預測發(fā)現(xiàn)，該基因家族成員的轉錄主要受到生長發(fā)育（development）、脅迫（stress）、激素信號（hormone）的影響（圖5）。其中，PeNHX3、PeNHX4.4、PeNHX6.3的啟動子上均具有10個以上的ABA響應元件，同時具有轉錄因子識別的應答元件序列，可能參與植物響應ABA信號通路的應答過程；PeNHX4.3、PeNHX5.1、PeNHX7則具有多個與生長發(fā)育轉錄因子結合相關的元件，可能在不同的發(fā)育階段受到多重調控作用；PeNHX2.2、PeNHX4.2有較多與干旱脅迫響應的相關元件，可能與植物的滲透調節(jié)功能相關。

2.4 毛竹PeNHX基因家族中的重復事件與物種間的共線性分析

在鑒定出的16個毛竹PeNHX家族成員間進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)在PeNHX基因中共有4對基因間存在共線性：PeNHX1.1與PeNHX1.2、PeNHX6.1與PeNHX6.2、PeNHX5.1與PeNHX5.2、PeNHX4.3與PeNHX4.4之間都發(fā)生了復制事件。" 除了PeNHX7

外，毛竹其他基因不存在復制關系。PeNHX7與非本基因家族間具有共線性，可能指示了其基因編碼產(chǎn)物與其他基因家族成員編碼產(chǎn)物在功能上存在差異性（圖6-A）。而在水稻和毛竹之間共鑒定出10組具有共線性的基因對，其中，屬于Class Ⅰ亞家族的PeNHX5.1、PeNHX5.2中都含有與水稻9號染色體上的OsNHX5（Os09g0286400.01）同樣的片段；PeNHX7則與水稻12號染色體上的SOS1（Os12g0641100.04）具有共線性。屬于Class Ⅲ的PeNHX1.1、PeNHX1.2、PeNHX4.3、PeNHX4.4、PeNHX4.1則分別與水稻的OsNHX1（Os07g0666900.02）、OsNHX2（Os11g0648000.01）、OsNHX3（Os05g0148600.01）存在共線性（圖6-B）。

2.5 毛竹PeNHX在鹽脅迫下的表達分析

本研究從GEO DataSets（gene expression omnibus data base）數(shù)據(jù)庫中獲得RNS-Seq數(shù)據(jù)（3、24 h鹽脅迫處理：GSE169067），根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)分析，得出所篩選出的16個PeNHX基因的表達量（圖7）。在短期鹽處理（鹽脅迫，3 h）下，PeNHX基因家族成員的表達量與對照（對照，3 h）相比，只有PeNHX4.3、PeNHX4.4這對共線基因在短期鹽脅迫后出現(xiàn)表達水平明顯下調，表明其功能可能與毛竹對低鹽脅迫的耐受相關。而在鹽脅迫持續(xù)到24 h（鹽脅迫，24 h），相較于對照，PeNHX4.3、PeNHX4.4的表達量持續(xù)降低，PeNHX7、PeNHX3、PeNHX6.2、PeNHX5.1、PeNHX5.2、PeNHX1.1、PeNHX1.2的表達量則出現(xiàn)明顯上升，可能與毛竹應對此時細胞質中Na+濃度上升、細胞出現(xiàn)滲透失水的趨勢有關。

PeNHX3的表達量在短期鹽脅迫后幾乎沒有變化，但長時間的鹽脅迫后則出現(xiàn)快速上調表達。

2.6 毛竹中PeNHX7基因的共表達分析

SOS1蛋白質在多種植物中保守性較高，在植物

受到鹽脅迫時能夠通過將胞質內多余的鈉離子轉運到細胞外，從而提高植物對鹽脅迫的耐受性。前期研究發(fā)現(xiàn)，PeNHX7蛋白質的氨基酸序列與擬南芥和水稻中的SOS1蛋白質均有較高的同源性，說明PeNHX7基因的表達對毛竹的抗鹽能力有重要影響。通過對毛竹所有發(fā)育階段及脅迫處理后的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行共表達網(wǎng)絡構建與加權網(wǎng)絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），發(fā)現(xiàn)多個與PeNHX7基因存在高權重（0.07）共表達關系的轉錄因子（圖8）。

這14個轉錄因子中，擬南芥中TRF1A、MED14的同源物主要參與基因的表達調控過程；LUH、FBL15

分別參與細胞壁中幾丁質的合成和花粉管的伸長過程；水稻中的RGA5R與抗病機制相關；QCR7、FTSH5、NDA8B、ALA1在其他植物中的同源蛋白質功能都與能量（ATP）的形成相關；而C3H19、C3H18、

BSL1、LDL3在水稻和擬南芥中的同源蛋白質則主要參與轉錄后的修飾過程。說明毛竹中PeNHX7蛋白質可能受到多條通路的協(xié)同調控，進而影響毛竹的耐鹽性質。

3 討論

為了探尋毛竹對鹽脅迫耐受性的分子機制，本研究通過生物信息學方法對毛竹中的Na+/H+逆轉運蛋白家族成員PeNHX進行全基因組的分析鑒定，通過結構域篩選與同源比對，共獲得16個PeNHX基因家族成員，并可劃分為3個亞家族（圖2）。與擬南芥（Arabidopssis thaliana，7）、小麥（Triticum aestivum L.，119）、藜麥（Chenopo-dium quinoa，56）、葡萄（Vitis vinifera，9）、水稻（Oryza sativa，10）等物種中NHX基因家族成員數(shù)目所存在的差異，可能來源于進化過程中毛竹對環(huán)境的適應［1，25-29］ 。通過種內、種間的共線性分析，發(fā)現(xiàn)PeNHX1.1/PeNHX1.2與PeNHX4.3/PeNHX4.4可能直接來源于進化前水稻的OsNHX1、OsNHX2，PeNHX7可能直接來源于OsNHX7，為主系遺傳基因，在鹽脅迫應答中的功能相對保守。而PeNHX5.1/PeNHX5.2與PeNHX6.1/PeNHX6.2這2對具有共線性的基因則與水稻中已知的NHX基因沒有直接進化關系，說明在進化過程里出現(xiàn)了較大的分化，屬于旁系遺傳基因（圖6）。同時，OsNHX4、OsNHX5、OsNHX6在毛竹基因組中不存在同源基因，表明在毛竹的基因組復制事件中出現(xiàn)了基因丟失，這與植物進化中頻繁發(fā)生基因丟失的現(xiàn)象［30］一致 ?；虻谋磉_模式大多與功能的分化相關，在3、24 h的鹽脅迫后，3個亞家族的成員表達模式相近，這與系統(tǒng)發(fā)育分析的結果一致，而具有共同片段的基因則具有更類似的表達模式。經(jīng)過24 h的鹽處理后，大部分PeNHX基因的表達水平被明顯誘導（圖7），這與水稻、小麥、楊樹中NHX基因家族成員的表現(xiàn)類似，也表明PeNHX基因在調控植物對鹽脅迫的應答過程中的功能是較為保守的［12，31］。

基因家族的主要進化機制以基因復制為特征，在植物中，基因組復制已被用于測試它們耐受多種環(huán)境的能力，如干旱、鹽、極端溫度等［32-34］。在毛竹中共鑒定出16個PeNHX基因家族成員，這些基因所在的染色體位置、基因結構、保守結構域的測定結果，為毛竹PeNHX基因家族提供了詳細的家族特征。本研究鑒定出的PeNHX7在基因結構上與水稻、小麥中的NHX7基因具有差異，但與水稻OsNHX7具有共同的基因片段，也與擬南芥中的AtNHX7/AtSOS1的編碼產(chǎn)物高度同源，意味著在進化上毛竹與水稻具有更近的關系，這與植物進化史一致。PeNHX7與AtSOS1、OsNHX7在基因結構上的差異，說明PeNHX7在毛竹與擬南芥、水稻分化后具有了不同的進化模式。擴展到PeNHX基因家族成員，不同亞組成員間的motif數(shù)量以及基因結構相似性更高，說明在分化后不同亞家族成員也傾向于執(zhí)行相似的功能（圖4、圖5）。

由于PeNHX7與水稻OsNHX7、擬南芥AtSOS1在氨基酸序列上的同源及功能上的保守性，PeNHX7的表達很可能在毛竹對鹽脅迫的應答過程里有重要作用，探尋調控PeNHX7基因的表達對揭示毛竹鹽脅迫應答的分子機制有重要作用。加權基因共表達網(wǎng)絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）可以通過建立高度協(xié)同變化的基因集，并根據(jù)基因集內部的關聯(lián)性來確定靶標基因。對PeNHX7進行WGCNA分析后，共找到了14個分別參與細胞分化、抗病、轉錄后修飾以及轉錄調控的相關基因，可為下一步對PeNHX7進行功能分析與機制解析提供參考。

綜上所述，本研究通過對毛竹全基因組進行鑒定、生物信息學分析、進化分析、表達量分析以及共表達分析，鑒定出16個參與Na+轉運的PeNHX基因家族成員，同時也通過同源比對和進化分析，揭示了PeNHX7可能作為保守的主系遺傳基因，在毛竹的鹽脅迫應答中具有重要意義，并進一步通過WGCNA分析，揭示了其潛在的調控因子，期待可為進一步研究PeNHX7在毛竹鹽脅迫適應中的功能與機制提供參考。

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