西瓜ClKUP6基因克隆及低鉀脅迫響應(yīng)表達(dá)分析

摘要：鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可或缺的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)提升植物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用。KUP/HAK/KT家族作為關(guān)鍵的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與植物對(duì)K+的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。基于西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出對(duì)K+強(qiáng)烈響應(yīng)的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白ClKUP6，為了進(jìn)一步探究其功能特征，以西瓜蘇夢(mèng)6號(hào)為試材，克隆獲得ClKUP6的編碼區(qū)序列全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因的序列特性、低鉀脅迫響應(yīng)表達(dá)、生物學(xué)功能進(jìn)行分析和驗(yàn)證。結(jié)果表明，ClKUP6基因的編碼序列全長(zhǎng)為2 418 bp，共編碼805個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為89.045 ku，脂肪指數(shù)為107.11，理論等電點(diǎn)為9.11，不穩(wěn)定系數(shù)為33.29，總平均親水性為0.363，屬于疏水性蛋白且不存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其位于液泡膜上。ClKUP6含有KUP/HAK/KT家族的典型保守結(jié)構(gòu)域“K-trans”及跨膜結(jié)構(gòu)特征（有11個(gè)跨膜區(qū)），與擬南芥AtHAK5的同源性較高；通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證其在根系中對(duì)缺鉀脅迫顯著響應(yīng)，可能是西瓜根系在低鉀環(huán)境下吸收轉(zhuǎn)運(yùn)K+的關(guān)鍵基因，通過(guò)酵母異源回補(bǔ)試驗(yàn)初步驗(yàn)證了其功能。期待本研究結(jié)果可為深入揭示KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員ClKUP6的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西瓜；ClKUP6；KUP/HAK/KT家族；低鉀脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S188；S651.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0120-06

收稿日期：2024-03-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-25）；淮安市自然科學(xué)研究計(jì)劃（聯(lián)合專項(xiàng)）（編號(hào)：HABL202228）；淮陰工學(xué)院校企合作項(xiàng)目（編號(hào)：Z421A23393）；淮陰工學(xué)院研究生創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：HGYK202404）；淮陰工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（編號(hào)：202411049297XJ）；淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院科研發(fā)展基金（編號(hào)：0012023038G、001HNY202222）；淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：0012023011B）。

作者簡(jiǎn)介：唐 彥（1999—），女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲鞴线z傳育種，E-mail：1935400366@qq.com；共同第一作者：程 瑞（1991—），男，安徽潛山人，碩士，助理研究員，主要從事園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用與遺傳育種研究，E-mail：chengrui@jaas.ac.cn。

通信作者：任旭琴，博士，教授，主要從事園藝植物環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)生理研究，E-mail：824332973@qq.com；孫玉東，研究員，主要從事西甜瓜育種及栽培技術(shù)研究，E-mail：sunyudong@jaas.ac.cn。

鉀是植物生長(zhǎng)代謝所必需的一種營(yíng)養(yǎng)元素，也是細(xì)胞質(zhì)中含量最豐富的無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成、滲透調(diào)節(jié)以及光合作用等一系列重要的生理生化過(guò)程［1-3］。缺鉀會(huì)直接影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，表現(xiàn)為葉緣黃化、莖稈軟弱、根系發(fā)育不良、抗逆性減弱等癥狀［4-5］。為滿足自身對(duì)鉀元素的需求，植物分化出2種主要的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)：鉀離子通道和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體［6-7］。鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含Trk/HKT、KEA、CHX、KUP/HAK/KT等4個(gè)家族，其中，KUP/HAK/KT家族是功能最全面、成員最豐富的一個(gè)分支，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)及離子穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-9］。目前，已在多種植物中證實(shí)了該家族的存在，包括水稻、擬南芥、大豆、煙草、葡萄、辣椒等［10-15］。KUP/HAK/KT家族主要分為Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ、Cluster Ⅲ、Cluster Ⅳ等4個(gè)基因簇，其中擬南芥AtHAK5，水稻OsHAK1、OsHAK5、OsHAK21，大麥HvHAK1屬于Cluster Ⅰ，主要在根中介導(dǎo)高親和的K+吸收［16-19］。Cluster Ⅱ成員在序列結(jié)構(gòu)和生理功能上展現(xiàn)出較大差異，能同時(shí)介導(dǎo)高親和、低親和K+的吸收，部分成員參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫調(diào)控的過(guò)程，如擬南芥AtKUP2、AtKUP4，大麥HvHAK2，陸地棉GhKT2［20-22］。Cluster Ⅲ的成員表達(dá)不具有組織特異性，但可能參與高親和性K+吸收及響應(yīng)高鹽脅迫，主要包括擬南芥AtHAK11、AtKUP12和水稻OsHAK11、OsHAK12［23］。Cluster Ⅳ不僅具有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)功能，還參與介導(dǎo)低親和性Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，并在水稻和蘆葦中得到驗(yàn)證［24］。目前關(guān)于Cluster Ⅲ及Cluster Ⅳ中KUP/HAK/KT基因生理功能研究的報(bào)道仍相對(duì)較少［25］。

西瓜（Citrullus lanatus）為典型的喜鉀植物，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)對(duì)鉀的需求尤為明顯［26-27］。缺鉀會(huì)導(dǎo)致西瓜出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、莖蔓纖弱、葉片皺縮卷曲、坐果率低等問(wèn)題［28-29］。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)KUP/HAK/KT家族成員ClKUP6基因及其功能研究的相關(guān)報(bào)道。本研究在深入分析西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上篩選出ClKUP6基因，以西瓜品種蘇夢(mèng)6號(hào)為試材，通過(guò)克隆和分析ClKUP6基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因的序列特性、低鉀脅迫響應(yīng)表達(dá)模式及生物學(xué)功能進(jìn)行分析和驗(yàn)證，以期深入揭示KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員ClKUP6的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制，并為耐低鉀型西瓜種質(zhì)的創(chuàng)制與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植株處理與取樣于2021—2022年在江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)科研創(chuàng)新基地玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，分子試驗(yàn)在淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心實(shí)驗(yàn)室（淮安市設(shè)施蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）完成。供試材料為淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自主選育的早熟小果型西瓜雜交1代種蘇夢(mèng)6號(hào)，該品種植株生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)適中，在春季保護(hù)地栽培條件下，果實(shí)發(fā)育期為30 d左右，全生育期為102 d左右［30］。

1.2 試驗(yàn)處理

取適量西瓜種子進(jìn)行催芽播種，出芽后使用72孔穴盤進(jìn)行育苗。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至2葉1心階段時(shí)，選取生長(zhǎng)狀況相近的健康植株，用清水清洗根部基質(zhì)，改用Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液改良配方進(jìn)行水培，每 5 d 更換1次營(yíng)養(yǎng)液［31］。以不含K+的營(yíng)養(yǎng)液作為缺鉀處理，以標(biāo)準(zhǔn)的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照；除鉀元素外，其他營(yíng)養(yǎng)元素含量均保持一致，具體參照Wang等的研究方法［32］。處理組和對(duì)照組各10株植株，設(shè)3次重復(fù)，共60株。處理2周后，分別采集西瓜的葉片、根部樣本，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ClKUP6基因的克隆

使用RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒［全式金生物技術(shù)（北京）有限公司］提取西瓜葉片的總RNA，從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//cucurbitgenomics.org/v2/）對(duì)該基因進(jìn)行搜索，獲取ClKUP6基因的全長(zhǎng)序列，基于該序列信息設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒［GodenstarTM RT6 cDNA Synthesis Mix，全式金生物技術(shù)（北京）有限公司］合成cDNA。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)膠回收目標(biāo)基因片段，連接至pEASY載體［全式金生物技術(shù)（北京）有限公司］，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.4 ClKUP6序列特性分析

將克隆獲得的ClKUP6基因在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得與其同源的擬南芥基因；利用Expasy在線翻譯工具（https：//web.expasy.org/translate/），將ClKUP6基因的克隆序列翻譯為相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；通過(guò)Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)ClKUP6蛋白序列的理化性質(zhì)進(jìn)行深入分析（分子量、脂肪指數(shù)、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸組成等）；利用NCBI中CD-search功能對(duì)該蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行系統(tǒng)分析；使用SignalP 5.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預(yù)測(cè)ClKUP6蛋白的信號(hào)肽；使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）對(duì)ClKUP6蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）對(duì)ClKUP6蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）平臺(tái)對(duì)ClKUP6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，包括其螺旋、折疊等結(jié)構(gòu)單元；利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）工具對(duì)ClKUP6蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并構(gòu)建模型。

1.5 ClKUP6在西瓜根部的表達(dá)特征

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性熒光引物（表1），以西瓜ClActin（Cla97C02G026960）作內(nèi)參基因，通過(guò)RT-PCR分析不同鉀處理下（K+缺失、K+供應(yīng)）ClKUP6在植物根部的表達(dá)特征。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，61 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)量［33］。

1.6 ClKUP6基因酵母異源回補(bǔ)試驗(yàn)

為進(jìn)一步研究ClKUP6基因的生物學(xué)功能，利用基因克隆引物（表1）擴(kuò)增編碼區(qū)全長(zhǎng)，利用同源重組技術(shù)將ClKUP6基因連接至含有BamHⅠ、XbaⅠ 雙酶切位點(diǎn)的表達(dá)載體pYES2上，將構(gòu)建成功的ClKUP6表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至K+吸收缺陷型酵母突變體菌株R5421中（北京酷來(lái)搏科技有限公司）。將含有ClKUP6轉(zhuǎn)化子和空載的酵母菌株的菌液分別稀釋1、10、100、1 000倍，并接種至不同K+濃度（0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50 mmol/L）的AP酵母培養(yǎng)基上，于28 ℃暗培養(yǎng)3～5 d后拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClKUP6基因克隆

以西瓜葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在2 000 bp上方區(qū)域出現(xiàn)單一清晰條帶（圖1），與目標(biāo)片段大小一致。經(jīng)膠回收送測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為2 418 bp的ClKUP6基因序列，該序列共編碼805個(gè)氨基酸。

2.2 ClKUP6蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)ClKUP6蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ClKUP6蛋白的分子式為C4 100H6 435N1 035O1 116S30，共包含12 716個(gè)原子，其相對(duì)分子質(zhì)量為89.045 ku，Gravy值為0.363，脂肪指數(shù)為107.11，理論等電點(diǎn)為9.1，不穩(wěn)定系數(shù)為33.29，表明該蛋白具有疏水性和較好的穩(wěn)定性。在該基因編碼的氨基酸中，纈氨酸（Val）含量最高（10.4%），共32個(gè)；半胱氨酸（Cys）含量最低（0.9%），僅為7個(gè)；負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為63個(gè)；正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為76個(gè)。進(jìn)一步分析顯示，ClKUP6蛋白不存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其位于液泡膜上。

保守域分析表明，ClKUP6序列中包含KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的典型結(jié)構(gòu)域“K-trans”（圖2-A），該序列具備有11個(gè)跨膜區(qū)，在第2、3跨膜區(qū)之間存在著1個(gè)顯著的胞質(zhì)環(huán)（Loop）結(jié)構(gòu)（圖2-B）。經(jīng)BLAST比對(duì)可知，ClKUP6與擬南芥AtHAK5的蛋白序列同源率為61.21%（圖2-C）。

2.3 ClKUP6蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ClKUP6由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成（圖3），其中 α-螺旋占比為40.12%，無(wú)規(guī)則卷曲占比為43.11%，延伸鏈相對(duì)較少，占比為16.77%。進(jìn)一步對(duì)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，其GMQE值為0.76，覆蓋率高達(dá)98%。

2.4 ClKUP6基因在西瓜根部的表達(dá)特征分析

通過(guò)水培方法對(duì)西瓜植株進(jìn)行鉀饑餓處理，在低鉀脅迫下，ClKUP6基因在西瓜根部的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，是對(duì)照的35倍左右（圖4），表明ClKUP6基因?qū)Φ外汯+脅迫顯著響應(yīng)，對(duì)西瓜根系從周邊環(huán)境吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)K+可能起關(guān)鍵作用。

2.5 ClKUP6基因在酵母異源系統(tǒng)中的功能鑒定

為解析ClKUP6對(duì)K+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能，將ClKUP6轉(zhuǎn)入K+吸收缺陷型酵母突變體菌株R5421進(jìn)行異源表達(dá)分析，當(dāng)培養(yǎng)基中K+處于較高濃度（10、20、50 mmol/L）時(shí)，ClKUP6轉(zhuǎn)化子與空載pYES2菌株的生長(zhǎng)狀況基本一致（圖5）。隨著K+濃度的降低，兩者生長(zhǎng)均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。在K+濃度為 5 mmol/L 時(shí)，ClKUP6轉(zhuǎn)化子菌株在稀釋 1 000 倍的菌液中仍能正常生長(zhǎng)，而對(duì)照只能在稀釋100倍的濃度下生長(zhǎng)；當(dāng)K+濃度為0.1～1 mmol/L 時(shí)，空載pYES2菌株在稀釋100倍的菌液中幾乎觀察不到其生長(zhǎng)狀態(tài)，而ClKUP6酵母轉(zhuǎn)化子菌株仍能生長(zhǎng)；當(dāng)K+濃度降至極低水平（0.01 mmol/L）時(shí)，在4種稀釋倍數(shù)下空載pYES2菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制并停止生長(zhǎng)；而ClKUP6轉(zhuǎn)化子菌株雖受抑制但在不同稀釋倍數(shù)的菌液中

仍表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，ClKUP6在低鉀環(huán)境（K+濃度為≤5 mmol/L）中能夠恢復(fù)突變體R5421菌株的生長(zhǎng)，證實(shí)ClKUP6在低鉀條件下具有K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

3 討論與結(jié)論

鉀元素能夠直接影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，提升西瓜對(duì)環(huán)境中K+的吸收利用效率，對(duì)于鉀高效西瓜品種的培育至關(guān)重要。KUP/HAK/KT家族在植物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、生理生化調(diào)節(jié)及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［34-35］。AtKUP9在低鉀脅迫下介導(dǎo)靜止中心細(xì)胞（QC）中的K+及平衡輔素，以調(diào)節(jié)擬南芥分生組織的活性和維持根的生長(zhǎng)；NtKT4在低鉀環(huán)境下可以表現(xiàn)出較高的鉀積累和耐低鉀能力［36-37］。在應(yīng)對(duì)干旱脅迫方面，KUP/HAK/KT家族同樣發(fā)揮著重要作用。Osakabe等通過(guò)反向遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在干旱環(huán)境下擬南芥中的AtKUP6蛋白與ABA信號(hào)受體PYR家族的蛋白激酶SRK2E/OST1/SnRK2.6之間存在互作，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)氣孔關(guān)閉機(jī)制，以減少植物體內(nèi)的水分流失［38］。此外，該家族還在維持植物體內(nèi)K+/Na+平衡中也發(fā)揮作用，如擬南芥AtHAK1、水稻OsHAK2、甘蔗SsHAK2等能夠通過(guò)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)活性幫助植株吸收更多的K+，減輕高鹽毒害［39-42］。然而，目前對(duì)于西瓜中KUP/HAK/KT家族成員ClKUP6基因功能的研

究尚未見(jiàn)報(bào)道。

已有研究指出，KUP/HAK/KT家族成員通常具有不同數(shù)量的跨膜區(qū)，其中在2、3跨膜區(qū)之間存在1個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)［43-44］。本研究從蘇夢(mèng)6號(hào)西瓜中成功克隆得到ClKUP6基因，并通過(guò)生物信息學(xué)方法深入分析其序列特性及理化性質(zhì)，結(jié)果表明，ClKUP6基因所編碼的蛋白具有該家族典型的“K-trans”結(jié)構(gòu)域并包含11個(gè)跨膜區(qū)，在第2、3個(gè)跨膜區(qū)之間存在1個(gè)較為顯著的胞質(zhì)環(huán)（Loop）結(jié)構(gòu)，這與KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的特征相吻合，從而證實(shí)了ClKUP6是該家族成員。

KUP/HAK/KT家族成員通過(guò)定位于細(xì)胞質(zhì)膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和葉綠體膜等多種膜結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)其離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能［45-46］。在低鉀條件下，液泡膜上的成員能夠參與細(xì)胞內(nèi)離子運(yùn)動(dòng)，釋放K+到胞質(zhì)中以維持離子平衡［47］。本研究對(duì)ClKUP6蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其為一個(gè)定位于液泡膜中的跨膜蛋白。根據(jù)直系同源功能推測(cè)假說(shuō)，不同物種間的同源基因通常會(huì)展現(xiàn)出相似功能［48］。本研究序列比對(duì)結(jié)果顯示，ClKUP6與擬南芥AtHAK5的蛋白序列具有較高相似度，表明其具有相近功能，Gierth等的研究已證實(shí)擬南芥AtHAK5在根中受低鉀脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，并具備介導(dǎo)高親和性K+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的能力［49］。因此，可合理推測(cè)ClKUP6也具備相似的功能。

KUP/HAK/KT家族基因?qū)憫?yīng)非生物脅迫及K+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)均具有重要作用［50］。本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析西瓜根中ClKUP6基因在K+缺失、K+供應(yīng)處理下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)ClKUP6的相對(duì)表達(dá)量顯著受環(huán)境中K+濃度的影響，即低鉀環(huán)境可誘導(dǎo)ClKUP6的高表達(dá)，這種上調(diào)表達(dá)對(duì)于促進(jìn)植物在逆境下對(duì)K+的高效吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要意義。為驗(yàn)證ClKUP6基因?qū)+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能，將ClKUP6轉(zhuǎn)入K+吸收缺陷型酵母突變體菌株R5421進(jìn)行異源表達(dá)分析。酵母突變體菌株R5421為鉀吸收缺陷型菌株，在K+濃度較低時(shí)無(wú)法正常生長(zhǎng)，擬南芥AtKUP1、水稻OsHAK1、黃冠梨PbKT8等基因已在酵母突變體R5421中得到驗(yàn)證［51-54］。本研究結(jié)果顯示，ClKUP6能夠有效回補(bǔ)R5421在低鉀環(huán)境下的鉀吸收缺陷，從而證實(shí)ClKUP6基因在低鉀條件下能夠介導(dǎo)植物根系對(duì)K+的高效吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)。

本研究從分子生物學(xué)角度對(duì)KUP/HAK/KT家族關(guān)鍵基因ClKUP6在響應(yīng)低鉀脅迫中的功能及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析，期待可為提高西瓜鉀吸收效率以及培育耐低鉀型西瓜品種提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Peng L R，Xiao H J，Li R，et al. Potassium transporter OsHAK18 mediates potassium and sodium circulation and sugar translocation in rice［J］. Plant Physiology，2023，193（3）：2003-2020.

［2］Chérel I，Lefoulon C，Boeglin M，et al. Molecular mechanisms involved in plant adaptation to low K+ availability［J］. Journal of Experimental Botany，2014，65（3）：833-848.

［3］Wang M，Zheng Q S，Shen Q R，et al. The critical role of potassium in plant stress response［J］. International Journal of Molecular Sciences，2013，14（4）：7370-7390.

［4］Pettigrew W T. Potassium influences on yield and quality production for maize，wheat，soybean and cotton［J］. Physiologia Plantarum，2008，133（4）：670-681.

［5］王夢(mèng)姣. 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AlHAK1提高轉(zhuǎn)基因玉米的鉀營(yíng)養(yǎng)吸收［D］. 大連：大連理工大學(xué)，2022：2-4.

［6］Maathuis F J，Sanders D. Mechanism of high-affinity potassium uptake in roots of Arabidopsis thaliana［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（20）：9272-9276.

［7］Maathuis F J，Sanders D. Regulation of K+absorption in plant root cells by external K+：interplay of different plasma membrane K+transporters［J］. Journal of Experimental Botany，1997，48（Special）：451-458.

［8］李 姣. 4個(gè)煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體KUP的基因克隆及功能分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：1-9.

［9］Mo Z J，Luo W，Pi K，et al. Comparative transcriptome analysis between inbred lines and hybrids provides molecular insights into K+content heterosis of tobacco （Nicotiana tabacum L.）［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：940787.

［10］Okada T，Yamane S，Yamaguchi M，et al. Characterization of rice KT/HAK/KUP potassium transporters and K+uptake by HAK1 from Oryza sativa［J］. Plant Biotechnology，2018，35（2）：101-111.

［11］Rubio F，Santa-María G E，Rodríguez-Navarro A. Cloning of Arabidopsis and barley cDNAs encoding HAK potassium transporters in root and shoot cells［J］. Physiologia Plantarum，2000，109（1）：34-43.

［12］晁毛妮，溫青玉，張晉玉，等. 大豆KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族的鑒定與表達(dá)分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2017，37（2）：239-249.

［13］李 姣，許 力，魯黎明，等. 煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體NtKT12的克隆及表達(dá)分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31（2）：65-70.

［14］Lei H，Li J L，Song Z Z. Genome-wide identification and expression profiling of the shaker K+channel and HAK/KUP/KT transporter gene families in grape （Vitis vinifera L.）［J］. Phyton，2022，91（11）：2519-2536.

［15］司偉娜，孫 毅，李曉玉. 栽培型與野生型辣椒HAK/KUP/KT基因家族的進(jìn)化分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，45（4）：753-761.

［16］Gupta M，Qiu X H，Wang L，et al. KT/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice （Oryza sativa）［J］. Molecular Genetics and Genomics，2008，280（5）：437-452.

［17］程 瑞，汪國(guó)蓮，孫玉東，等. 蘿卜HAK/KUP/KT基因家族鑒定與表達(dá)特性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（3）：777-787.

［18］Zhang Z B，Zhang J W，Chen Y J，et al. Genome-wide analysis and identification of HAK potassium transporter gene family in maize （Zea mays L.）［J］. Molecular Biology Reports，2012，39（8）：8465-8473.

［19］楊天元. 水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsHAK5的功能研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：34-44.

［20］Ahn S J，Shin R，Schachtman D P. Expression of KT/KUP genes in Arabidopsis and the role of root hairs in K+uptake［J］. Plant Physiology，2004，134（3）：1135-1145.

［21］Wang Y R，Xu J，Zhang M C，et al. GhKT2：a novel K+transporter gene in cotton（Gossypium hirsutum）［J］. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2018，5（2）：226-235.

［22］肖火軍. 水稻鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因OsHAK18的功能研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：37-46.

［23］Maathuis F J M. The role of monovalent cation transporters in plant responses to salinity［J］. Journal of Experimental Botany，2006，57（5）：1137-1147.

［24］曾 洋. OsHAK17在水稻鉀分配及HtNHX在耐鹽和鋁脅迫中的功能解析［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021：75-78.

［25］楊中敏，王 艷. 鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體KUP/HAK/KT家族功能的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)，2014，24（3）：100-103.

［26］尤 春，孫興祥. 土壤有效鉀含量及鉀肥用量對(duì)西瓜生長(zhǎng)的影響［J］. 中國(guó)瓜菜，2016，29（9）：26-30.

［27］董 亞，王 碩，吳 萍，等. 西瓜鉀素吸收特征及鉀肥施用優(yōu)化機(jī)制［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（1）：98-104.

［28］楊曉燕，夏體淵，吳 甜.植物鉀營(yíng)養(yǎng)脅迫研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2023，39（18）：101-106.

［29］Lester G E，Jifon J L，Makus D J. Impact of potassium nutrition on postharvest fruit quality：melon （Cucumis melo L.） case study［J］. Plant and Soil，2010，335（1）：117-131.

［30］江 蛟，孫玉東，張朝陽(yáng)，等. 西瓜新品種蘇夢(mèng)6號(hào)的選育［J］. 中國(guó)蔬菜，2018（11）：75-77，71.

［31］Hoagland D R，Arnon D.The water-culture method for growing plants without soil［R］. California Agricultural Experiment Station，1950：1-32.

［32］Wang Y Z，Lü J H，Chen D，et al. Genome-wide identification，evolution，and expression analysis of the KT/HAK/KUP family in pear［J］. Genome，2018，61（10）：755-765.

［33］闞麗平，石曉倩，楊 晗，等. 梨果實(shí)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因PbKT12的克隆與功能驗(yàn)證［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2023，50（4）：713-723.

［34］葉明輝. 馬鈴薯鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族基因的克隆和功能分析［D］. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021：1-10.

［35］鐘亞琴. 嫁接西瓜響應(yīng)低鉀脅迫的生理和分子機(jī)制研究［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：24-37.

［36］Zhang M L，Huang P P，Ji Y，et al. KUP9 maintains root meristem activity by regulating K+and auxin homeostasis in response to low K［J］. EMBO Reports，2020，21（6）：e50164.

［37］蔡 露. 煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體NtKT4的克隆及功能分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：51-55.

［38］Osakabe Y，Arinaga N，Umezawa T，et al. Osmotic stress responses and plant growth controlled by potassium transporters in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2013，25（2）：609-624.

［39］段慧榮，周學(xué)輝，胡 靜，等. 高等植物K+吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2019，28（9）：174-191.

［40］Chandran A E J，F(xiàn)inkler A，Hait T A，et al. Calcium regulation of the Arabidopsis Na+/K+transporter HKT1；1 improves seed germination under salt stress［J］. Plant Physiology，2024，194（3）：1834-1852.

［41］柴薇薇，王文穎，崔彥農(nóng)，等. 植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KUP/HAK/KT家族研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2019，55（12）：1747-1761.

［42］凌秋平，曾巧英，胡 斐，等. 甘蔗鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SsHAK2的克隆及表達(dá)特性分析［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，25（3）：378-385.

［43］Sato Y，Nanatani K，Hamamoto S，et al. Defining membrane spanning domains and crucial membrane-localized acidic amino acid residues for K+ transport of a Kup/HAK/KT-type Escherichia coli potassium transporter［J］. Journal of Biochemistry，2014，155（5）：315-323.

［44］李 巖. 杜梨對(duì)低鉀脅迫的生理響應(yīng)及其鉀吸收關(guān)鍵基因的分析［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018：3-11.

［45］Li X W，You X L，Wang Y. Research progress of HAK/KUP/KT potassium transporter family in plant response to salt stress［J］. Plant Science Journal，2019，37（1）：101-108.

［46］Tang R J，Zhao F G，Yang Y，et al. A calcium signalling network activates vacuolar K+remobilization to enable plant adaptation to low-K environments［J］. Nature Plants，2020，6（4）：384-393.

［47］Santa-María G E，Oliferuk S，Moriconi J I. KT-HAK-KUP transporters in major terrestrial photosynthetic organisms：a twenty years tale［J］. Journal of Plant Physiology，2018，226：77-90.

［48］Gabaldón T，Koonin E V. Functional and evolutionary implications of gene orthology［J］. Nature Reviews Genetics，2013，14（5）：360-366.

［49］Gierth M，Mser P，Schroeder J I. The potassium transporter AtHAK5 functions in K+ deprivation-induced high-affinity K+ uptake and AKT1 K+ channel contribution to K+ uptake kinetics in Arabidopsis roots［J］. Plant Physiology，2005，137（3）：1105-1114.

［50］晁毛妮，溫青玉，張志勇，等. 陸地棉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因GhHAK5的序列特征及表達(dá)分析［J］. 作物學(xué)報(bào)，2018，44（2）：236-244.

［51］Cereghino J L，Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］. FEMS Microbiology Reviews，2000，24（1）：45-66.

［52］宋毓峰，張 良，董連紅，等. 植物KUP/HAK/KT家族鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15（6）：92-98.

［53］Chen G，Zhang Y，Ruan B P，et al. OsHAK1 controls the vegetative growth and panicle fertility of rice by its effect on potassium-mediated sugar metabolism［J］. Plant Science，2018，274：261-270.

［54］石曉倩，申長(zhǎng)衛(wèi)，劉慧冉，等. 黃冠梨鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因PbKT8的克隆與表達(dá)分析［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，42（4）：706-712.