烤煙氮脅迫響應(yīng)基因的篩選及氮脅迫分析

摘要：氮脅迫直接影響烤煙的生產(chǎn)與品質(zhì)。為探究烤煙對于低氮、高氮脅迫作出的響應(yīng)，利用RNA-Seq方法對打頂后的烤煙葉片進(jìn)行分子機(jī)制研究。結(jié)果顯示，在375個(gè)響應(yīng)低氮脅迫的基因中，有240個(gè)基因表現(xiàn)出上調(diào)的特征，135個(gè)基因則出現(xiàn)了下調(diào)的情況；另外，在1 079個(gè)響應(yīng)高氮脅迫的基因中，有691個(gè)基因表現(xiàn)出上調(diào)的特征，388個(gè)則出現(xiàn)了下調(diào)的情況。GO注釋和KEGG顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，氮信號(hào)主要對烤煙碳氮代謝、煙堿合成產(chǎn)生影響，篩選出氮代謝關(guān)鍵基因9個(gè)，碳代謝關(guān)鍵基因11個(gè)。低氮脅迫差異基因主要富集在各種轉(zhuǎn)移酶活性及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的囊泡等條目中，在低氮脅迫下，多種轉(zhuǎn)移蛋白酶活性被抑制，能量轉(zhuǎn)運(yùn)減少；葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化被抑制，促使更多蔗糖合成，優(yōu)先補(bǔ)償碳代謝；L-天冬酰胺酶上調(diào)，天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，影響煙堿形成。高氮脅迫的差異基因主要富集到與光合作用相關(guān)的條目與通路，葉綠素a/b結(jié)合蛋白7、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16及葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因上調(diào)，直接或間接地促進(jìn)CO2固定，更多的碳代謝產(chǎn)物被用于氮代謝中，使烤后煙葉中氮含量過度積累，碳氮代謝失衡；谷氨酰胺合成酶下調(diào)，氮更多地流向了煙堿形成途徑而非氨基酸合成途徑；查爾酮合酶1B基因下調(diào)，優(yōu)先保證1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)煙堿形成。

關(guān)鍵詞：烤煙；RNA-seq；氮脅迫；碳氮代謝

中圖分類號(hào)：S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0111-09

收稿日期：2024-02-18

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司貴州公司科技項(xiàng)目（編號(hào)：2023XM12）。

作者簡介：潘宇琪（1999—），男，貴州六盤水人，碩士研究生，主要從事煙草營養(yǎng)與施肥研究。E-mail：1552031764@qq.com。

通信作者：陳風(fēng)雷，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士生導(dǎo)師，主要從事優(yōu)質(zhì)煙葉栽培技術(shù)研究，E-mail：cfl-fenglei@163.com；黃 鶯，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事煙草營養(yǎng)與施肥及土壤環(huán)境化學(xué)研究，E-mail：316452492@qq.com。

氮是影響烤煙品質(zhì)及產(chǎn)量的重要營養(yǎng)物質(zhì)，參與烤煙體內(nèi)碳、氮代謝等重要生物過程［1］。N的供應(yīng)不足或過量都會(huì)對烤煙品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。植物在低氮脅迫下，葉片形態(tài)大小、干物質(zhì)質(zhì)量、硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合成酶（GOGTA）以及亞硝酸還原酶（NiR）等氮代謝相關(guān)酶活性降低，全株氮積累量下降但利用效率提高［2-3］。低氮下光合作用基因受到顯著抑制，特別是葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因下調(diào)［4］。含氮化合物、煙堿含量與施氮量呈正相關(guān)，總糖、還原糖含量相反，各生育時(shí)期的淀粉酶活性都隨施氮量增加而增加［5-9］。過量施用氮肥則會(huì)導(dǎo)致烤煙根系發(fā)育受到抑制，防御相關(guān)蛋白酶活性降低，且烤煙生長后期貪青晚熟，烤后煙葉品質(zhì)不佳等情況［10-11］。研究認(rèn)為隨著施氮量增加，導(dǎo)致煙草體內(nèi)糖代謝減弱以及α-酮戊二酸回補(bǔ)能力降低，是煙草體內(nèi)碳氮代謝失衡的主要原因之一［12］。以上結(jié)論只針對氮代謝的單一指標(biāo)進(jìn)行研究，很難真實(shí)反映出植物體內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的含氮化合物的變化。組學(xué)技術(shù)為此提供了解決方法，利用組學(xué)技術(shù)對植物環(huán)境壓力進(jìn)行篩選并揭示其機(jī)制成為近年來的研究熱點(diǎn)。張玉寧等利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)揭示了環(huán)境脅迫下氮代謝過程的復(fù)雜過程［13-15］。本研究用RNA-Seq的方法，分析氮脅迫下烤煙基因的變化，試圖從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度分析烤煙響應(yīng)氮脅迫相關(guān)的基因差異表達(dá)以及差異代謝途徑，為深入了解烤煙響應(yīng)氮脅迫的耐性分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和材料

試驗(yàn)于2022年在貴州省安順市西秀區(qū)楊武鄉(xiāng)（106°E、26°N）進(jìn)行。供試土壤為黃壤，有機(jī)質(zhì)含量47.38 g/kg，全氮含量2.25 g/kg，堿解氮含量175.19 mg/kg，有效磷含量16.31 mg/kg，速效鉀含量84.38 mg/kg，pH值5.48。試驗(yàn)品種為我國主要種植品種烤煙云煙87。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置3 個(gè)N肥施用水平（以N計(jì)），分別為低氮處理（LN）60 kg/hm2、正常氮處理（CK）105 kg/hm2、高氮處理（HN）150 kg/hm2。打頂后10 d，采集烤煙中部葉，混合后得到樣品，稱取20 g（鮮重）左右在超低溫冰箱（T≤-80 ℃）中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 化學(xué)成分含量測定

采用煙草行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)方法［16-18］，對煙葉煙堿、總氮、總糖以及還原糖的濃度進(jìn)行測定。

1.2.3 經(jīng)濟(jì)性狀

根據(jù)烤煙42級(jí)國家標(biāo)準(zhǔn)［19］，對所有原煙的等級(jí)進(jìn)行劃分，并以當(dāng)?shù)厥召弮r(jià)格作為參考。此外，對每個(gè)等級(jí)的產(chǎn)量、平均價(jià)格、產(chǎn)值以及上等煙中上等煙的比重等進(jìn)行精確的統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測定

RNA提?。喝? g保存完好的鮮樣，置于研缽中倒入液氮研磨，使其呈細(xì)微的顆粒后加入1 mL RNA提取試劑，在室溫下靜置 5 min；加入1/5體量的三氯甲烷，上下?lián)u晃后再次在室溫下靜置5 min；在8 939 r/min、4 ℃的條件下離心15 min；將離心過后的上層清液取出倒入新的離心管中，加入與上清液等量的2-丙醇上下?lián)u晃至均勻狀態(tài)，在室溫下靜置5 min；在同上條件下離心10 min；加入1 mL 75%乙醇對離心管中的沉淀進(jìn)行清洗；再次以上述條件離心5 min；保留沉淀并使其干燥；加DEPC水溶解沉淀。之后采用Nano Drop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）和Agilent 2100 Bioanalyze （Agilent Technologies，Santa Clara，USA） 檢查RNA的純度和評估RNA完整性。

轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建：將mRNA分離與片段化。使用VAHTS Universal V5 RNA-Seq Library Prep Kit試劑盒構(gòu)建文庫。通過使用具有寡聚物（dT）的磁珠富集mRNA，并利用片段化技術(shù)將其轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。接著，使用模板和隨機(jī)引物，合成雙鏈cDNA，以實(shí)現(xiàn)更高效的cDNA轉(zhuǎn)錄。通過純化、末端修復(fù)以及添加polyA，雙鏈cDNA被連接到接合器上，并且根據(jù)片段的大小進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Agilent 2100 Bioanalyzer評價(jià)構(gòu)建好的cDNA文庫質(zhì)量。

轉(zhuǎn)錄組測序：采用llumina Nova Seq 6000測序平臺(tái)（USA） 對文庫進(jìn)行測序，并生成150 bp生物功能雙端讀長。采用Fastp軟件進(jìn)行讀長過濾后獲得干凈讀長用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析［20］。使用HISAT2軟件將測序結(jié)果與烤煙的基因組比對，并進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算，并通過 HTSeq-count獲得每個(gè)基因的讀長計(jì)數(shù)［21］。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，使用R（v3.2.0）對基因進(jìn)行PCA分析以及繪圖，以評估樣本生物學(xué)重復(fù)。利用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，其中符合Q值lt;0.05且fold changegt;2或fold changelt;0.5閾值的基因被定義為差異表達(dá)基因［22］。

差異表達(dá)基因功能分析：通過歐易生物分析云平臺(tái)、茄科基因組數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics network，SGN）、基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology Resource，GO）及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）深入探究差異表達(dá)基因的特殊功用，并將其特殊功用注解、富集，以期獲得更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果。然后從中篩選出與碳氮代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

對原始的測序結(jié)果進(jìn)行過濾，得到的干凈讀長在38.62～40.32 Mb之間，Q30均在95.20%以上。97.28%～98.19%測序序列能映射到已公布的烤煙基因組數(shù)據(jù)庫（表1），唯一映射率為 84.40%～87.15%，各樣本的測序質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 氮脅迫下的差異表達(dá)基因

由圖1可以看出，低氮脅迫下共獲得375個(gè)差異基因，其中240個(gè)差異基因上調(diào)，135個(gè)差異基因下調(diào)；高氮脅迫下共獲得1 079個(gè)差異基因，其中691個(gè)差異基因上調(diào)，388個(gè)差異基因下調(diào)。韋恩圖顯示響應(yīng)低氮脅迫與高氮脅迫的相同基因有67個(gè)，

響應(yīng)高氮脅迫的特有差異基因有1 013個(gè)，響應(yīng)低氮脅迫的有309個(gè)，這說明高氮脅迫對烤煙生長代謝的影響更大。

GO功能注釋主要分為三大獨(dú)立板塊：生物過程、分子功能和細(xì)胞組分。將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集功能分類，LN和CK之間共富集到650條條目，HN和CK之間共富集到1 181條條目。在圖2中顯示出了GO富集最顯著的前30條條目。

由圖2可知，LN和CK的差異基因參與的生物過程除細(xì)胞過程外，還有化合物代謝過程、生物過程的調(diào)節(jié)、對環(huán)境變化的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)及發(fā)育過程等，對免疫系統(tǒng)、生長過程等也有影響。低氮脅迫下差異基因描述的分子功能主要是結(jié)合，其次是催化活動(dòng)、轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)，還有酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和電子載流子活性等。差異基因所處的細(xì)胞組分主要是細(xì)胞、細(xì)胞組分，其次是細(xì)胞器、膜、膜組分、細(xì)胞器組分等，影響最小的主要是胞外區(qū)。

HN和CK的差異基因參與的生物功能主要是細(xì)胞過程，其次是各種化合物代謝過程、對外界刺激的響應(yīng)、生物調(diào)節(jié)及生物過程的調(diào)節(jié)。高氮脅迫下差異基因參與的分子功能主要是結(jié)合，其次是催化活動(dòng)以及轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)等，對分子傳感器活性、翻譯調(diào)控活性等的影響較小。差異基因參與的細(xì)胞組分主要是細(xì)胞，其次是細(xì)胞組分、細(xì)胞器、膜、膜組分以及細(xì)胞器等，影響最小主要是膜封閉、胞外區(qū)和擬核。

LN脅迫下特有的條目有217條，包括生物功能中的DNA起始復(fù)制過程、沿微管的囊泡運(yùn)輸、對二氧化碳的響應(yīng)等，分子功能中的L-阿拉伯激酶活性、ATP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、ADP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、AMP-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性、tRNA-二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性等，細(xì)胞組分中的原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體、復(fù)制識(shí)別復(fù)合物的核起源等。HN脅迫下特有的條目有748條，生物功能中的光合作用、光收集過程、調(diào)控次生芽形成過程、苯丙烷代謝過程的調(diào)控等，分子功能中核酮糖-二磷酸羧化酶活性、硫代葡萄糖苷生物合成過程的調(diào)控等是LN脅迫下沒有的。

通過KEGG通路數(shù)據(jù)庫對基因注釋進(jìn)行解析。LN和CK之間共富集到50條通路，HN和CK之間共富集到91條。圖3顯示了富集最顯著的前20條。

由圖3可知，LN和CK中差異基因主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，各種生物堿的生物合成，C-支鏈二元酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，賴氨酸生物合成，玉米素生物合成，硫磺酸和次硫磺酸代謝，色氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，倍半萜類化合物和三萜類化合物生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，二萜類生物合成，異喹啉酸生物堿生物合成，硫胺素代謝，半乳糖代謝，賴氨酸降解，脂肪酸伸長率，泛酸和輔酶A的生物合成，苯丙烷生物合成，丙酮酸代謝等。

而在HN和CK中差異基因主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，MAPK信號(hào)通路-植物，鞘糖脂生物合成神經(jīng)節(jié)系列，硫代謝，糖胺聚糖降解，黃酮類生物合成，氰基氨基酸代謝，二苯乙烯類二芳基庚烷類和姜辣素生物合成，光合作用-天線蛋白，各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，氮代謝，泛酸和輔酶A的生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，淀粉和蔗糖代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，半乳糖代謝，苯丙烷生物合成，谷胱甘肽代謝等。

僅在LN脅迫下富集的KEGG通路有4條，分別是萜類骨架生物合成通路、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、二萜類生物合成以及C-支鏈二元酸代謝。而HN中特有的通路有46條，其中有氮代謝、光合作用-天線蛋白、托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成、精氨酸生物合成、組氨酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等。

2.3 烤煙氮代謝對氮脅迫的響應(yīng)

通過比對茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.sgn.cornell.edu/organism/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017）對不同處理篩選到的基因進(jìn)行基因注釋。從LN vs CK的KEGG通路中共篩選到與氮代謝相關(guān)的基因3 個(gè)（表2），分別是編碼多酚氧化酶E基因（Nitab4.5_0003171g0010）、斷馬錢子苷合成酶基因（Nitab4.5_0001073g0090）和L-天冬酰胺酶/β-天冬氨酸肽酶基因（Nitab4.5_0000412g0050）。

從HN vs CK的KEGG通路中共篩選到相關(guān)基因6個(gè)（表2），分別是編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2.5基因（Nitab4.5_0002255g0010、Nitab4.5_0007682g0010）、谷氨酰胺合成酶基因（Nitab4.5_0000777g0010）、尼古丁N-去甲基酶基因（Nitab4.5_0009277g0010）、查爾酮合酶1B基因（Nitab4.5_0003904g0060）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（Nitab4.5_0000052g0220）。

2.4 烤煙碳代謝對氮脅迫的響應(yīng)

由表3可知，從LNvsCK的KEGG通路中共篩選到碳代謝相關(guān)的基因2個(gè)，分別是編碼丙酮酸激酶同工酶A基因（Nitab4.5_0003815g0060）和UDP-糖焦磷酸化酶基因（Nitab4.5_0002557g0050）。

從HNvsCK的KEGG通路中共篩選到相關(guān)基因9個(gè)（表3），分別是葉綠素a/b結(jié)合蛋白7基因（Nitab4.5_0004269g0080）、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16基因（Nitab4.5_0000982g0200）、葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因（Nitab4.5_0001434g0050）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因（Nitab4.5_0000052g0220）、β-果糖呋喃糖苷酶基因（Nitab4.5_0003404g0040）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Nitab4.5_0009972g0030）、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶2基因（Nitab4.5_0000928g0020）、蔗糖合成酶6基因（Nitab4.5_0001180g0180）、1，4-α-葡聚糖支鏈酶2-2基因（Nitab4.5_0003541g0040）。

2.5 氮脅迫對烤煙生長及煙葉品質(zhì)的影響

從植物外觀形態(tài)鑒定氮脅迫最為直觀。圖4是不同供氮水平下烤煙的田間表現(xiàn)。試驗(yàn)地力水平下，團(tuán)棵期CK、HN差異不顯著，LN處理葉色較淺，略黃。采烤期，CK正常落黃，LN提前落黃且葉色淺淡、葉片窄小，HN葉片寬大且落黃延遲，LN、HN處理從外觀形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的缺素或過量脅迫癥狀。

由表4可知，烤后煙葉氮的含量隨著施氮量的增加而顯著增加。LN脅迫下，還原糖、淀粉和煙堿含量與CK相比均未達(dá)到顯著差異，但總糖卻顯著高于CK；HN脅迫與LN脅迫相似，水溶性總糖、還原糖、淀粉和煙堿含量與CK相比均未達(dá)到顯著差異水平，但是水溶性總糖、還原糖以及淀粉含量均低于對照處理，且煙堿含量升高。糖氮比隨著施氮量的增加而降低，兩糖比以CK協(xié)調(diào)性最佳。

由表5可知，HN處理相較于CK生物產(chǎn)量提高，但是經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量及產(chǎn)值均顯著降低。LN條件下，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量與CK無顯著差異，但是因?yàn)橹猩系葻熉实?，?dǎo)致產(chǎn)值降低。

綜上，LN、HN處理相較于CK，從外觀、內(nèi)在化學(xué)成分和經(jīng)濟(jì)性狀上均表現(xiàn)出氮缺乏、氮過量的脅迫癥狀。

3 討論與結(jié)論

3.1 煙株氮脅迫的界定

氮是影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)最為重要的營養(yǎng)元素，輕微的氮脅迫會(huì)引起植株生理生化過程改變，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致外觀變化［23］。LN、HN處理的煙株，

在打頂后10 d外觀有明顯變化，烤后煙葉的化學(xué)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)性狀降低，說明均已處于缺氮和氮過量的脅迫狀態(tài)。

3.2 烤煙氮代謝及煙堿合成對氮脅迫的響應(yīng)

氮是植物生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)以及信號(hào)分子，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮是植物吸收無機(jī)態(tài)氮的主要形態(tài)。本研究中，高氮脅迫促使高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2.5（NRT 2.5）基因顯著下調(diào)，這表示烤煙內(nèi)的低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能替代高親和力硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以此進(jìn)行硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)， 減少植物對氮的轉(zhuǎn)

運(yùn)，主動(dòng)避免過多硝態(tài)氮累積對植物的傷害［24-25］。當(dāng)銨態(tài)氮充足時(shí)，谷氨酰胺合成酶活性升高，以存儲(chǔ)更多的氮。研究中高氮條件下谷氨酰胺合成酶基因顯著下調(diào)，可能是因?yàn)榈嗟亓飨蛄松飰A合成途徑，而非氨基酸合成途徑。

在烤煙氮代謝中，煙堿是極為重要的品質(zhì)指標(biāo)，是產(chǎn)生生理依賴的原因，還影響了煙草的香吃味［26］。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在植物體內(nèi)催化天冬氨酸和2-氧代戊二酸由草酰乙酸和谷氨酸生成的途徑，天冬氨酸作為烤煙煙堿合成的前體物質(zhì)，其含量也影響著煙堿的合成［27］。LN脅迫下，L-天冬酰胺酶基因顯著上調(diào)意味著天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，這可能是低氮下煙堿含量較低的原因。HN處理則提高了天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致天冬氨酸含量升高進(jìn)而使煙堿含量上升。

氮脅迫除了影響煙堿形成前體物外，對其形成和降解過程也產(chǎn)生了影響。在高氮脅迫下，查爾酮合酶1B基因下調(diào)，表明1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化促進(jìn)了煙堿的生物合成而非類黃酮類物質(zhì)的生成（圖5）。另外，尼古丁N-去甲基酶基因下調(diào)，表明去甲基尼古丁的生物合成在高氮下受到抑制，這一過程減少了去甲基煙堿的形成，也降低了煙堿的降解，可能是施氮水平高導(dǎo)致煙堿含量增加的又一途徑［28］。而在LN處理下，多酚氧化酶E基因下調(diào)影響了異喹啉生物堿的合成；斷馬錢子苷合成酶基因的上調(diào)可能導(dǎo)致茄堿和番茄堿含量上升，但由于其占烤煙總生物堿的比例太小，煙草總生物堿含量較CK依然降低。

3.3 烤煙碳代謝對氮脅迫的響應(yīng)

碳代謝的中心是光合作用。煙草進(jìn)行HN處理后，葉綠素a/b結(jié)合蛋白7、葉綠素a/b結(jié)合蛋白16及葉綠素a/b結(jié)合蛋白40基因顯著上調(diào)，合成更多的葉綠素以促進(jìn)光合作用，進(jìn)而促進(jìn)C的固定［29-30］。與其他作物一樣，HN使煙葉天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因上調(diào)，促進(jìn)CO2的固定。

作為植物能量代謝的碳代謝、蔗糖代謝兩大部分，蔗糖合酶（SS）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG）的催化作用使得蔗糖代謝發(fā)生了一種可逆的變化，即SS將果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，從而維持植物體內(nèi)蔗糖濃度的穩(wěn)定性。HN下SS顯著下調(diào)，抑制了蔗糖合成，Yang等在烤煙根系中也觀察到了相同現(xiàn)象［31］。蔗糖的分解代謝中，β-果糖呋喃糖苷酶上調(diào)，使蔗糖持續(xù)分解為果糖及葡萄糖，積累量下降。HN處理可以顯著降低葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（GPAT）的活性，從而阻礙腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）的生成，這種情況下，淀粉的生產(chǎn)量可能會(huì)大幅度減少［32］。另外，HN下的1，4-α-葡聚糖支化酶2-2基因（GBSS2-2）的上調(diào)促進(jìn)直鏈淀粉鏈合成支鏈淀粉，這表明了HN不僅抑制淀粉的合成，還會(huì)促使淀粉結(jié)構(gòu)改變。在LN條件下，UDP-糖焦磷酸化酶表達(dá)量下調(diào)（圖5），葡萄糖-1-磷酸鹽轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖的過程受抑制，而葡萄糖-1-磷酸來源于葡萄糖，所以這可能是LN下烤煙糖含量較高的原因之一。

ATP-磷酸果糖激酶是控制糖酵解/糖異生途

徑第一步的關(guān)鍵酶，催化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6-二磷酸，這個(gè)反應(yīng)阻礙了果糖-6-磷酸向蔗糖和淀粉轉(zhuǎn)化，整個(gè)糖酵解/糖異生過程都受到該酶的控制。HN誘導(dǎo)該酶的基因顯著下調(diào)，抑制了糖酵解/糖異生途徑，蔗糖合成受抑制。丙酮酸激酶作為糖酵解的終止步驟，它通過無法逆轉(zhuǎn)的方式把磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸基團(tuán)從ADP轉(zhuǎn)換到ATP和丙酮酸。在LN條件下，為了補(bǔ)償碳代謝，煙葉中丙酮酸激酶同工酶A顯著上調(diào)，促進(jìn)丙酮酸的生成，以提高對碳的利用效率，這與Ambasht等的研究結(jié)果［33-34］一致。

3.4 氮代謝對烤煙碳氮平衡的影響

烤煙內(nèi)部的碳氮代謝平衡對于烤煙的產(chǎn)量品質(zhì)形成有著極為重要的影響，碳氮代謝是烤煙生長發(fā)育的基礎(chǔ)，它們之間的聯(lián)系非常密切，不僅存在著彼此的限制，也存在著協(xié)同的作用，即氮代謝的進(jìn)行需要碳代謝提供碳源和能量，而碳代謝則需要氮代謝提供酶和光合色素，這種雙向的交換使得烤煙的生長發(fā)育受到至高的保障，從而決定了其產(chǎn)量和品質(zhì)的高低［35］。

對于差異基因的GO以及KEGG分析顯示，LN使各種轉(zhuǎn)移酶活性及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的囊泡等條目受到十分顯著的抑制，氮供應(yīng)不足時(shí)碳代謝優(yōu)先滿足自身代謝所需能量，降低了轉(zhuǎn)移蛋白酶活性，這一點(diǎn)也可以從丙酮酸激酶同工酶A基因的顯著上調(diào)可以看出；此外，LN下減少葡萄糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化，促使更多蔗糖合成，優(yōu)先補(bǔ)償碳代謝，煙葉葉色較淺，這些都體現(xiàn)了低氮下氮代謝強(qiáng)度不高、碳代謝增強(qiáng)。通過L-天冬酰胺酶上調(diào)，天冬氨酸被更多地轉(zhuǎn)化為天冬酰胺而非α-亞氨基琥珀酸，影響了煙堿形成。

HN的差異基因主要富集到與光合作用相關(guān)的條目與通路，葉綠素a/b結(jié)合蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的上調(diào)，直接或間接地促進(jìn)了C固定，煙葉外觀葉色也較為濃綠。結(jié)合對烤后煙葉含氮量增加看來，光合作用強(qiáng)度增大是為了提供更多的能量來進(jìn)行氮代謝，符合大部分研究報(bào)道的耗“碳”得“氮”的規(guī)律，這應(yīng)該是導(dǎo)致高氮下碳氮代謝失衡的原因。值得一提的是，打頂后HN處理下煙株獲得的氮，因?yàn)楣劝滨０泛铣擅傅南抡{(diào)，更多地流向了煙堿形成途徑而非氨基酸合成途徑。此時(shí)，煙堿形成途徑也發(fā)生著變化，查爾酮合酶1B基因下調(diào)，阻止了氮代謝產(chǎn)物向非黃酮類化合物的轉(zhuǎn)移，保證了1-N甲基吡咯啉的轉(zhuǎn)化，以便合成更多的煙堿。

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