煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KUP基因家族鑒定與表達(dá)分析

摘要：煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)鉀素需求量較大。KUP家族是目前已知的最大的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著重要作用。對(duì)煙草KUP基因家族進(jìn)行鑒定和分析，并探究其在低鉀脅迫下的表達(dá)模式，可為進(jìn)一步研究和利用煙草KUP基因奠定基礎(chǔ)。本研究采用生物信息學(xué)方法在煙草基因組中鑒定KUP家族，且對(duì)家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、共線性分析、Ka/Ks值、順式作用元件等進(jìn)行分析，并探明KUP基因家族成員在根、莖、葉、花等不同組織及干旱脅迫條件下的表達(dá)模式；最后通過qRT-PCR方法分析其在低鉀脅迫下的表達(dá)模式。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：在煙草K326基因組中共鑒定出39個(gè)KUP基因，家族成員均含有一個(gè)典型的“K_trans superfamily”結(jié)構(gòu)域，其中26個(gè)被定位在13條染色體上，存在7對(duì)共線性基因?qū)Γ?對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，有1對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值大于1；KUP家族蛋白均為疏水性蛋白，其基因上游啟動(dòng)子區(qū)均包含多個(gè)激素和脅迫元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明：NtKUP家族基因大部分成員在根和花中高表達(dá)，少部分在莖和葉中高表達(dá)，且部分成員在花中表達(dá)量隨著成熟度逐漸降低；大多數(shù)基因?qū)Ω珊得{迫存在響應(yīng)。挑選4個(gè)NtKUP基因進(jìn)行qRT-PCR分析，試驗(yàn)結(jié)果表明：KUP2、KUP4、KUP8在低鉀脅迫下根中的表達(dá)量有不同程度的上調(diào)，且根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉，這和NtKUP家族大部分成員在根中參與低鉀脅迫響應(yīng)的生物信息學(xué)分析相一致。

關(guān)鍵詞：煙草；KUP基因家族；鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；生物信息學(xué)；表達(dá)模式；低鉀脅迫；干旱脅迫

中圖分類號(hào)：S188；S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0100-11

收稿日期：2024-05-16

基金項(xiàng)目：貴州省煙草公司重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：2021XM04）。

作者簡(jiǎn)介：石遠(yuǎn)帥（2000—），男，貴州黔南人，碩士研究生，主要從事煙草遺傳育種研究。E-mail：1765994937@qq.com。

通信作者：劉 洋，博士，副教授，主要從事煙草遺傳育種研究。E-mail：yliu21@gzu.edu.cn。

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)鉀素需求量較大，含量通常為氮素的1.4倍、磷素的3.5倍［1］。鉀離子不僅能夠滿足煙草的生長(zhǎng)發(fā)育需求，而且能夠提高煙葉的品質(zhì)，缺鉀會(huì)導(dǎo)致煙草代謝失調(diào)，光合速率下降，根系生長(zhǎng)受抑制，鉀對(duì)于提髙煙葉產(chǎn)量、改善品質(zhì)起著非常重要的作用［2］；研究表明，鉀離子能夠有效降低煙焦油以及其他部分有害物質(zhì)的含量［3］，含鉀高的煙葉色澤呈深橘黃色，香氣足，吃味好，富有彈性和韌性，填充性強(qiáng)，陰燃持火力和燃燒性好［4］。

由于土壤溶液中的大部分鉀離子與黏土礦物結(jié)合，有效鉀離子的濃度非常低［5］；所以，在低鉀環(huán)境下（鉀離子濃度低于0.2 mmol/L），高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將土壤溶液中的鉀進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，以滿足煙草本身對(duì)鉀營(yíng)養(yǎng)的高需求［6］。目前，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白按結(jié)構(gòu)可分為：KUP/HAK/KT（K+uptake/high-affinity K+transporter/K+transporter）、HKT（high-affinity K+transporter）和CPA（cation-proton antiporter，CPA）。KUP家族是目前所知的最大的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其成員最多，覆蓋面最廣，廣泛存在于各種植物的器官當(dāng)中，在細(xì)胞膜和液泡膜上起作用［7］；KUP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的共同特征是具有12個(gè)跨膜區(qū)域（TMS），在第2個(gè)和第3個(gè)TMS之間有一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)環(huán)，其N-末端和C-末端均位于胞內(nèi)側(cè)［8］。擬南芥中，有關(guān)KUP家族的研究較多，AtHAK5在低鉀條件下表達(dá)上調(diào)，并且在根中定位于表皮和皮質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜，AtHAK5參與高親和力K+攝取，而且很大程度上是與shaker-type AtAKT1通道冗余的［9］；在低鉀條件下，AtKUP7功能的喪失導(dǎo)致木質(zhì)部汁液中鉀攝取率和鉀含量降低，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，AtKUP7對(duì)擬南芥根系的鉀離子攝取至關(guān)重要，并且還可能參與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)到木質(zhì)部汁液中的過程，從而影響鉀離子從根部到芽的轉(zhuǎn)運(yùn)［10］；AtKUP1和AtKUP2可以補(bǔ)充大腸桿菌突變體的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)缺乏，并且過表達(dá)AtKUP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥懸浮細(xì)胞顯示出Rb攝取增加［11］；AtKUP2、AtKUP6、AtKUP8參與膨脹、細(xì)胞大小和氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)突變株中的AtKUP2、AtKUP6、AtKUP8被破壞時(shí)，突變株根系中的鉀離子穩(wěn)態(tài)受到影響，與野生型相比，相對(duì)短暫的鉀離子攝取上調(diào)［12］。眾多研究表明，KUP基因家族在鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制上起著重要作用。

迄今為止，KUP基因家族僅在擬南芥、水稻、小麥、大麥等植物中被報(bào)道，未見煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因KUP及其相關(guān)功能的報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法在普通煙草K326基因組中鑒定NtKUP基因家族成員，并系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)及基因結(jié)構(gòu)，還利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR技術(shù)分析其時(shí)空表達(dá)模式和脅迫響應(yīng)模式，為探究該基因家族在煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收方面的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

煙草K326種子由貴州大學(xué)煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。2024年3月20日播種于貴州大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，將飽滿的煙草種子裝入1.5 mL離心管中，先用1 mL 30% NaClO溶液消毒20 min，用移液槍吸出消毒液，再加入1 mL 30% NaClO溶液消毒 20 min，2次消毒期間都要不斷地振蕩或反復(fù)顛倒EP管。然后用無(wú)菌水反復(fù)清洗5～7次后，吸干種子表面水分，布于MS 培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱光照度15 000 lx、溫度20 ℃、光照16 h/d培養(yǎng)［13］，培養(yǎng)至3張真葉完全展開。

1.2 煙草KUP基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

普通煙草K326基因組序列以及注釋文件通過茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//solgenomics.net/）獲得，由PFAM（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載KUP隱馬爾科夫模型（profile hidden markov models，profile HMMs）序列譜（PF02705）。利用hmmsearch軟件在K326蛋白組文件中檢索，將得到的KUP候選成員利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終獲得煙草KUP家族成員［14-15］。利用在線網(wǎng)站ExPasy （https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)煙草KUP家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析，包括氨基酸數(shù)目、分子量、蛋白質(zhì)疏水性值等指標(biāo)［16］。

1.3 煙草KUP基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI下載辣椒（Capsicum annum）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）蛋白完整數(shù)據(jù)，同樣使用hmmsearch鑒定和篩選KUP家族蛋白序列，隨后利用MEGA 11對(duì)5個(gè)物種KUP蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［17］，采用鄰接法，1 000次重復(fù)，利用Clustal X對(duì)KUP蛋白進(jìn)行多序列對(duì)比，利用ITOL（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行進(jìn)化樹美化［18］。

1.4 煙草KUP蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

將煙草KUP蛋白上傳至MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網(wǎng)站，保守基序設(shè)定為10個(gè)，其他采用默認(rèn)設(shè)定［19］。利用Tbtools進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域作圖，利用Tbtools軟件使用GFF注釋文件繪制基因結(jié)構(gòu)圖［20］。

1.5 煙草KUP基因定位、共線性分析及Ka/Ks計(jì)算

煙草KUP染色體定位利用Tbtools軟件中的Gene Location Visualize功能進(jìn)行作圖，并顯示各個(gè)染色體基因密度。利用Tbtools軟件對(duì)煙草KUP基因進(jìn)行復(fù)制分析以及物種間與煙草的共線性分析。擬南芥基因組數(shù)據(jù)從NCBI上獲得，辣椒基因組在ensemble上獲得，水稻基因組在rice上獲得。利用KaKs_Calculator v2.0軟件計(jì)算復(fù)制基因的Ka和Ks［21］。

1.6 煙草KUP基因順式作用元件分析

從煙草基因組中獲取每個(gè)KUP基因CDS序列上游2 000 bp序列，使用Plant_CARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/htm1/）獲得KUP基因啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件，并通過Tbtools進(jìn)行可視化［22］。

1.7 煙草KUP基因轉(zhuǎn)錄分析

在BioProject（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）和GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）網(wǎng)站上下載PRJNA208209和GSE214048的表達(dá)量數(shù)據(jù)［23-24］。GSE95717測(cè)序背景：煙草幼苗在塑料盆中生長(zhǎng)，白天在28 ℃和晚上23 ℃下光照循環(huán)16 h，收集了8個(gè)代表性煙草組織（根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、未成熟花、成熟花和衰老花）樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。GSE214048測(cè)序背景：使用200 mmol/L甘露醇進(jìn)行模擬干旱處理5葉1心煙草幼苗，收集0、1、2、4、8 h的煙草葉樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用Tbtools軟件歸一化處理后進(jìn)行可視化作圖。分析煙草NtGH3基因家族成員的差異表達(dá)特征。

1.8 qPCR基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證NtKUP家族成員是否對(duì)低鉀脅迫進(jìn)行響應(yīng)，挑選4個(gè)NtKUP基因（NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。待煙苗長(zhǎng)至3張真葉完全展開時(shí)，挑選生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)良一致的幼苗，去離子水中洗凈根系，放至不含鉀元素的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液鉀饑餓2 d后放入不同鉀濃度的Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。鉀濃度分正常供鉀和低鉀2個(gè)水平，其中正常供鉀溶液鉀離子濃度為5 mmol/L，低鉀溶液鉀離子濃度為0.15 mmol/L。試驗(yàn)共2個(gè)處理，設(shè)3次重復(fù)。每3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 d后對(duì)根和葉分別取樣，及時(shí)存放于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于 RNA 的提取。用Plant RNA Kit純植物試劑盒（GenStar，R6827）從 4 ℃ 和的樣品中提取總RNA，使用StarScript Ⅱ RT Mix with gDNA Remover試劑盒（GenStar，A224）獲得cDNA，基因引物設(shè)計(jì)使用Primer-Blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，以NtL25為內(nèi)參基因（表1）。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量［25］。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草KUP家族成員鑒定及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

通過HMMER 5.0軟件在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到NtKUP家族成員，去除重復(fù)和冗余序列，在線數(shù)據(jù)庫(kù)SMART中復(fù)篩，共鑒定得到39個(gè)NtKUP家族蛋白。其中26個(gè)成員分別被組裝在13條染色體上，根據(jù)基因在染色體中的相對(duì)位置對(duì)26個(gè)基因進(jìn)行命名，其余未能定位到染色體上的基因按照基因ID序號(hào)進(jìn)行命名。將其依次命名為NtKUP1～NtKUP39（表2）。

蛋白理化性質(zhì)分析表明，煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NtKUP家族成員的蛋白序列長(zhǎng)度在639～854個(gè)氨基酸之間，分子量為71.3～95.2 ku，其中NtKUP38的氨基酸數(shù)量最少，分子量?jī)H為71.3 ku；而NtKUP39的氨基酸數(shù)目最多，分子量為95.2 ku。NtKUP蛋白中有29個(gè)屬于堿性蛋白，1個(gè)屬于中性蛋白，9個(gè)屬于酸性蛋白；其中NtKUP33的等電點(diǎn)最高（9.38），NtKUP16的等電點(diǎn)最低（5.49），KUP1為電中性蛋白（7）。NtKUP蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為32.22～50.47，共有15個(gè)蛋白穩(wěn)定系數(shù)＞40，屬于不穩(wěn)定蛋白，且NtKUP25的穩(wěn)定系數(shù)達(dá)到50.47，極為不穩(wěn)定，其余24個(gè)蛋白為穩(wěn)定蛋白。NtKUP蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為97.56～114.56，表明該類蛋白的極性氨基酸含量較低，具有較好的溶解性。同時(shí)NtKUP蛋白的親水系數(shù)為0.103～0.413，該家族39個(gè)蛋白均為疏水性蛋白，符合鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特征。

2.2 煙草KUP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用Hammer軟件分別在擬南芥中鑒定出13個(gè)基因，玉米22個(gè)基因，水稻19個(gè)基因，葡萄16個(gè)基因，并使用MEGA X軟件采用最大似然（ML）法與煙草KUP基因構(gòu)建了1個(gè)鄰接（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。109個(gè)基因可分為4個(gè)亞類，在4個(gè)亞類中，Ⅰ類成員包括17個(gè)煙草成員、6個(gè)擬南芥成員、6個(gè)水稻成員、7個(gè)葡萄成員、8個(gè)玉米成員；Ⅱ類成員包括7個(gè)煙草成員、3個(gè)擬南芥成員、2個(gè)水稻成員、1個(gè)葡萄成員、3個(gè)玉米成員；Ⅲ類成員包括12個(gè)煙草成員、4個(gè)擬南芥成員、8個(gè)水稻成員、7個(gè)葡萄成員、8個(gè)玉米成員；Ⅳ類成員包括3個(gè)煙草成員、2個(gè)水稻成員、1個(gè)葡萄成員、1個(gè)玉米成員。每一個(gè)亞家族都包含了至少4個(gè)物種家族成員，說明KUP家族成員的分化時(shí)間是要早于5個(gè)物種的分化時(shí)間的。煙草家族成員的數(shù)量較多，說明在煙草物種形成后，NtKUP家族成員在該物種形成之后可能經(jīng)歷了多次復(fù)制事件。

2.3 煙草KUP基因家族成員序列分析及啟動(dòng)子分析

一般序列相似的基因具有相似的生物學(xué)功能，為此采用在線網(wǎng)站MEME對(duì)煙草KUP家族成員的保守基序進(jìn)行了分析，結(jié)果表明NtKUP家族成員均包含14～20個(gè)基序，NtKUP家族成員除NtKUP13外均含有motif 7，表明這個(gè)基序是NtKUP家族成員

的保守序列（圖2-A）。CD Search分析顯示，NtKUP家族成員含有鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的保守結(jié)構(gòu)域（K_trans superfamily）（圖2-B）。NtKUP基因結(jié)構(gòu)表明，NtKUP基因家族成員均含有5～12個(gè)外顯子（圖2-C）。

利用Plant CARE在線軟件對(duì)NtKUP基因家族成員上游2 000 pb序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上游序列中有許多與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)以及厭氧誘導(dǎo)的調(diào)控等相關(guān)的元件（圖3），其中與激素響應(yīng)相關(guān)的元件有IAA（TGA-element、AuxRR-core）、SA

（TCA-element）、ABA（ABRE）、MeJA（CGTCA-motif）、GA（P-box）；與光反應(yīng)相關(guān)的元件有ACE、G-Box、circadian、GT1-motif、MRE；與非生物脅迫相關(guān)的元件有TC-rich repeats、LTR、MBS；另外還有1個(gè)參與厭氧調(diào)節(jié)的順式作用元件ARE。與脫落酸相關(guān)的ABRE、與厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的ARE、以及與光響應(yīng)相關(guān)的G-Box存在于大多數(shù)家族成員之中，表明大多數(shù)NtKUP成員可能直接或者間接參與脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)以及光反應(yīng)。

2.4 煙草KUP基因定位與共線性分析

Tbtools軟件分析和可視化NtKUP基因的染色體定位結(jié)果表明，有26個(gè)NtKUP基因分布在13條染色體上，其中2、3、7、8、13號(hào)染色體上各有1個(gè)成員；4、12、21、23、24號(hào)染色體上分別有2個(gè)成員；17號(hào)染色體上有3個(gè)成員；19和20號(hào)染色體上分別有4個(gè)成員；13個(gè)NtKUP基因未定位到染色體上（圖4）。煙草基因組內(nèi)共線性分析表明，在Circos圖中發(fā)現(xiàn)了7對(duì)片段重復(fù)的基因?qū)?，均為大片段?fù)制，用黑色曲線連接（圖5）。由于植物基因家族的擴(kuò)展主要是由片段重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)事件促進(jìn)的，所以推測(cè)NtKUP基因家族的擴(kuò)展與串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制事件有關(guān)，而片段復(fù)制是NtKUP基因家族新成員的主要來(lái)源。

通過軟件計(jì)算Ka和Ks值（表3），除NtKUP18/NtKUP26外，其余3對(duì)基因的Ka和Ks值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，主要為同義替換，基因受純化選擇；而NtKUP18/NtKUP26這對(duì)基因的Ka和Ks值大于1，主要為異義替換，基因受正選擇，即異義替換有可

能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能，因此會(huì)造成適應(yīng)性的變化，從而帶來(lái)自然選擇的優(yōu)勢(shì)或者劣勢(shì)（一般是劣勢(shì)）。

煙草分別和擬南芥、辣椒、水稻的KUP成員共線性分析發(fā)現(xiàn)（圖6）：5個(gè)NtKUP基因與7個(gè)AtKUP基因組成8個(gè)基因?qū)Γ?9個(gè)NtKUP基因與5

個(gè)CaKUP基因組成9個(gè)基因?qū)Γ?個(gè)NtKUP基因與1個(gè)OsKUP基因形成1個(gè)基因?qū)Γ?說明基因復(fù)制有可能是煙草基因組NtKUP基因擴(kuò)增和進(jìn)化的動(dòng)力。

2.5 煙草KUP家族基因表達(dá)分析

正常生長(zhǎng)條件下的不同煙草組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明NtKUP基因在不同部位的差異表達(dá)（圖7）。NtKUP家族大部分成員都在根和花中表達(dá)，NtKUP19、NtKUP9等9個(gè)基因主要在根部表達(dá)，且在其他部位表達(dá)很少甚至不表達(dá)；NtKUP12、NtKUP14等6個(gè)基因僅在衰老花中表達(dá)，在其他組織部位不表達(dá)；NtKUP4在花和葉中表達(dá)較多，在幼花、幼葉尤其明顯；NtKUP8在各個(gè)部位表達(dá)分布較為均勻，在幼花表達(dá)量達(dá)到峰值；NtKUP2和NtKUP5在各組織表達(dá)分布也較為均勻，在根和莖

當(dāng)中表達(dá)量較高；NtKUP1、NtKUP10等10個(gè)基因的表達(dá)量趨勢(shì)基本一致，均是在根、花的各個(gè)時(shí)期、以及成熟葉和衰老葉中表達(dá)，在根和花中表達(dá)量較高，且隨著花的衰老，表達(dá)量不斷增高，在葉片中表達(dá)不明顯。

用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理煙草幼苗的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到的26個(gè)NtKUP成員（圖8）。干旱脅迫后，NtKUP2、NtKUP4等10個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)；KUP8的表達(dá)量下調(diào)；NtKUP3、NtKUP7等8個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)；NtKUP15、NtKUP22等2個(gè)基因呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)；NtKUP6、NtKUP14等5個(gè)基因不受干旱脅迫的影響。

2.6 低鉀脅迫對(duì)部分NtKUP基因表達(dá)分析

由于NtKUP家族屬于鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，大部分成員和根系鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，因此，對(duì)煙草幼苗進(jìn)行低鉀脅迫處理12 d，分析NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8等4個(gè)基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，在低鉀脅迫下，4個(gè)基因在根和葉上均表現(xiàn)出不同程度的變化，12 d低鉀處理過后，葉片NtKUP1表達(dá)量極顯著下調(diào)，根無(wú)明顯變化；根NtKUP2表達(dá)量極顯著上調(diào)，葉片與處理前無(wú)明顯變化，但根表達(dá)量極顯著高于葉片；各部位NtKUP4表達(dá)量與處理前均無(wú)顯著差異，但根表達(dá)量還是略高于葉片；根NtKUP8表達(dá)量極顯著上調(diào)，葉片表達(dá)量與處理前無(wú)顯著差異，但明顯低于根中表達(dá)量。這些結(jié)果表明，NtKUP1、NtKUP2、NtKUP4、NtKUP8均在根中表達(dá)，參與低鉀脅迫的響應(yīng)均在根中進(jìn)行。

3 結(jié)論與討論

本研究在煙草全基因組（K326）范圍內(nèi)對(duì)煙草NtKUP進(jìn)行鑒定，共鑒定到39個(gè)NtKUP基因家族成員。NtKUP家族成員均含有1個(gè)典型的“K_trans superfamily”結(jié)構(gòu)域（PF02705），該結(jié)構(gòu)域是KUP鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員所特有的，這與在大麥中的預(yù)測(cè)結(jié)果［26］相似。Ka/Ks（有時(shí)稱為dN/dS，非同義替換率/同義替換率）通常用于幫助理解編碼序列中的進(jìn)化方向及其選擇強(qiáng)度Ka/Ksgt;1 表示基因受正選擇，Ka/Kslt;1表示基因受純化選擇，Ka/Ks=1表示基因受中性進(jìn)化［27］。共線性基因?qū)χ杏?對(duì)基因?qū)Φ腒a/Ks值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，有1對(duì)基因?qū)a/Ks大于1，結(jié)果表明NtKUP家族基因大多在復(fù)制之后進(jìn)行了純化選擇。推測(cè)KUP家族的分化早于6個(gè)物種的形成，但是由于后期分化導(dǎo)致煙草與擬南芥和辣椒的親緣關(guān)系較近，與水稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)［28］。煙草的KUP成員明顯多于擬南芥、玉米、水稻、葡萄，說明發(fā)生在煙草KUP家族中的復(fù)制事件多于其余物種［29］。

在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程中，基因啟動(dòng)子及其順式作用元件起著重要的調(diào)控作用，編碼蛋白質(zhì)的基因的核心啟動(dòng)子通常包含1個(gè)“TATA-box”［30］。順式作用元件和核心啟動(dòng)子可以成為轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合位點(diǎn)［31］。通過對(duì)啟動(dòng)子序列的分析發(fā)現(xiàn)：NtKUP家族成員上游含有許多與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)以及厭氧誘導(dǎo)的調(diào)控等相關(guān)的元件識(shí)別位點(diǎn)，推測(cè)NtKUP可通過激素來(lái)對(duì)外界環(huán)境變化做出響應(yīng)。前人研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸觸發(fā)多種生理過程，如氣孔閉合、根系調(diào)節(jié)、組織土壤微生物群落、激活轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的激活以及代謝改變等多種生理過程［32］。與脫落酸相關(guān)的ABRE存在于絕大多數(shù)NtKUP家族成員當(dāng)中，推測(cè)NtKUP直接或間接參與脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)，并以此來(lái)應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化。以往的研究也表明KUP家族是最大的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀離子積累以維持植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著至關(guān)重要

的作用［33-34］。因此可以推測(cè)NtKUP有可能通過參與脫落酸的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)響應(yīng)鉀離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

通過對(duì)不同煙草組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因各部位和器官中也有表達(dá)，但部分成員表達(dá)量極低，表達(dá)量之間和各部位之間也存在差異，大部分成員在根和花中高表達(dá)，少部分在莖和葉中高表達(dá)，且部分成員在花中表達(dá)量隨著成熟度逐漸降低［23］。在根中高表達(dá)與高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白根部吸收鉀離子特征相印證，有研究表明擬南芥KUP4最初被鑒定為微小根毛1（TRH1），是根毛擴(kuò)張和正常發(fā)育所必需的［35］。甚至還有一些KUP鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的敲除不僅影響鉀離子的獲得和易位，還影響根系形態(tài)和枝條表型，這種表型缺陷無(wú)法通過增加鉀供應(yīng)來(lái)挽救［36］。NtKUP基因家族成員還包含許多逆境脅迫應(yīng)答元件，本研究探討了NtKUP家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式；干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，大多數(shù)基因?qū)Ω珊得{迫存在應(yīng)答，隨著脅迫時(shí)間出現(xiàn)上調(diào)、下調(diào)、先上調(diào)后下調(diào)以及先下調(diào)后上調(diào)4種情況，其次從qRT-PCR結(jié)果可以看出，在低鉀脅迫下NtKUP家族4個(gè)基因出現(xiàn)不同程度的影響，其中3個(gè)基因（KUP2、KUP4、KUP8）在低鉀處理后根中的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，且根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉中，這更加印證了NtKUP家族大部分成員在根中參與調(diào)控。

綜上所述，本研究分析確定了煙草NtKUP基因家族的39個(gè)家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、蛋白保守結(jié)構(gòu)、染色體定位、共線性和表達(dá)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。確定了煙草KUP家族成員為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，啟動(dòng)子和表達(dá)分析表明該家族在干旱、低鉀等逆境脅迫方面發(fā)揮作用。因此NtKUP基因家族可以作為研究鉀轉(zhuǎn)運(yùn)和逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制的候選基因，為煙草的遺傳與改良提供理論基礎(chǔ)，對(duì)選育優(yōu)質(zhì)的煙草品種具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］郝浩浩，許自成，黃海棠，等." 煙草對(duì)鉀素吸收與積累轉(zhuǎn)運(yùn)及損失機(jī)理研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（12）：6-7，9.

［2］聞?dòng)啦? 氮鉀互作對(duì)煙草基因表達(dá)及代謝產(chǎn)物的影響［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

［3］魯逸飛，李立芹，任學(xué)良，等." 煙草（Nicotiana tabacum）鉀吸收的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種，2019，17（22）：7572-7578.

［4］司叢叢，劉好寶，曲平治. 煙草鉀離子通道及轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（2）：45-49.

［5］Rmheld V，Kirkby E A. Research on potassium in agriculture：needs and prospects［J］. Plant and Soil，2010，335（1）：155-180.

［6］蘇 文，劉 敬，王 冰，等." 植物高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HAK功能研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（8）：144-152.

［7］Wang J，Luo Y，Ye F，et al. Structures and ion transport mechanisms of plant high-affinity potassium transporters［J］. Molecular Plant，2024，17（3）：409-422.

［8］Sato Y，Nanatani K，Hamamoto S，et al. Defining membrane spanning domains and crucial membrane-localized acidic amino acid residues for K+transport of a Kup/HAK/KT-type Escherichia coli potassium transporter［J］. The Journal of Biochemistry，2014，155（5）：315-323.

［9］Rubio F，AlemáN F，Nieves-Cordones M，et al. Studies on Arabidopsis athak5，atakt1 double mutants disclose the range of concentrations at which AtHAK5，AtAKT1 and unknown systems mediate K+uptake［J］. Physiologia Plantarum，2010，139（2）：220-228.

［10］Han M，Wu W，Wu W H，et al. Potassium Transporter KUP7 is involved in K acquisition and translocation in Arabidopsis root under K-limited conditions［J］. Molecular Plant，2016，9（3）：437-446.

［11］Kim E J，Kwak J M，Uozumi N，et al. AtKUP1：an Arabidopsis gene encoding high-affinity potassium transport activity［J］. The Plant Cell，1998，10（1）：51-62.

［12］Osakabe Y，Arinaga N，Umezawa T，et al. Osmotic stress responses and plant growth controlled by potassium transporters in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2013，25（2）：609-624.

［13］宋文強(qiáng). 煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的克隆以及功能分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

［14］Johnson L S，Eddy S R，Portugaly E. Hidden Markov model speed heuristic and iterative HMM search procedure［J］. BMC Bioinformatics，2010，11（1）：431.

［15］Letunic I，Bork P. 20 years of the SMART protein domain annotation resource［J］. Nucleic Acids Research，2018，46（D1）：D493-D496.

［16］Artimo P，Jonnalagedda M，Arnold K，et al. ExPASy：SIB bioinformatics resource portal［J］. Nucleic Acids Research，2012，40（W1）：W597-W603.

［17］Tamura K，Stecher G，Kumar S. MEGA 11：molecular evolutionary genetics analysis version 11［J］. Molecular Biology and Evolution，2021，38（7）：3022-3027.

［18］Letunic I，Bork P. Interactive tree of life （iTOL） v5：an online tool for phylogenetic tree display and annotation［J］. Nucleic Acids Research，2021，49（W1）：W293-W296.

［19］Bailey T L，Boden M，Buske F A，et al. MEME Suite：tools for motif discovery and searching［J］. Nucleic Acids Research，2009，37（suppl_2）：W202-W208.

［20］Chen C，Chen H，Zhang Y，et al. TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

［21］Wang D，Zhang Y，Zhang Z，et al. KaKs_Calculator 2.0：a toolkit incorporating gamma-series methods and sliding window strategies［J］. Genomics，Proteomics amp; Bioinformatics，2010，8（1）：77-80.

［22］Lescot M，DéHais P，Thijs G，et al. PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences［J］. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327.

［23］Su H，Meng L，Qu Z，et al. Genome-wide identification of the N6-methyladenosine regulatory genes reveals NtFIP37B increases drought resistance of tobacco （Nicotiana tabacum L.）［J］. BMC Plant Biology，2024，24（1）：134.

［24］Hu Z，He Z，Li Y，et al. Transcriptomic and metabolic regulatory network characterization of drought responses in tobacco［J］. Frontiers in Plant Science，2023，13：1067076.

［25］Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the method 2-ΔΔCT［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［26］Cai K，Zeng F，Wang J，et al. Identification and characterization of HAK/KUP/KT potassium transporter gene family in barley and their expression under abiotic stress［J］. BMC Genomics，2021，22（1）：317.

［27］Li J，Zhang Z，Vang S，et al. Correlation between Ka/Ks and Ks is related to substitution model and evolutionary lineage［J］. Journal of Molecular Evolution，2009，68（4）：414-423.

［28］Panchy N，Lehti-Shiu M，Shiu S H. Evolution of gene duplication in plants［J］. Plant Physiology，2016，171（4）：2294-2316.

［29］Cannon S B，Mitra A，Baumgarten A，et al. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana［J］. BMC Plant Biology，2004，4（1）：10.

［30］Sun Y，Jia X，Yang Z，et al. Genome-wide identification of PEBP gene family in Solanum lycopersicum［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（11）：9185.

［31］Zou C，Sun K，Mackaluso J D，et al. Cis-regulatory code of stress-responsive transcription in Arabidopsis thaliana［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2011，108（36）：14992-14997.

［32］Muhammad Aslam M，Waseem M，Jakada B H，et al. Mechanisms of abscisic acid-mediated drought stress responses in plants［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（3）：1084.

［33］VéRy A A，Nieves-Cordones M，Daly M，et al. Molecular biology of K+transport across the plant cell membrane：what do we learn from comparison between plant species？［J］. Journal of Plant Physiology，2014，171（9）：748-769.

［34］程 瑞，汪國(guó)蓮，孫玉東，等. 蘿卜HAK/KUP/KT基因家族鑒定與表達(dá)特性分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（3）：777-787.

［35］Rigas S，Debrosses G，Haralampidis K，et al. TRH1 encodes a potassium transporter required for tip growth in Arabidopsis root hairs［J］. The Plant Cell，2001，13（1）：139-151.

［36］Li W，Xu G，Alli A，et al. Plant HAK/KUP/KT K transporters：function and regulation［J］. Seminars in Cell amp; Developmental Biology，2018，74：133-141.