海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族鑒定及枯萎病脅迫下的表達(dá)分析

摘要：基于棉花基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地鑒定了棉花DUF677基因家族成員，對(duì)海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的進(jìn)化分析。在海島棉、陸地棉、雷蒙德氏棉、亞洲棉、擬南芥和水稻中，共鑒定出158個(gè)DUF677基因家族成員，其中海島棉基因組中包含40個(gè)成員，分布在17條染色體上，進(jìn)化樹分析表明可分為3個(gè)亞族。海島棉D(zhuǎn)UF677亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，均為親水性蛋白質(zhì)，含有1個(gè)外顯子，至少含有1個(gè)基序和有DUF677結(jié)構(gòu)域。通過啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，含有與茉莉酸甲酯及水楊酸相關(guān)的順式作用元件最多。結(jié)合啟動(dòng)子和表達(dá)分析，推測(cè)GbDUF677-01、GbDUF677-14、GbDUF677-21、GbDUF677-22、GbDUF677-24和GbDUF677-35可能參與了海島棉對(duì)枯萎病的脅迫過程。進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)這6個(gè)基因在抗感枯萎病的極端材料中進(jìn)行枯萎病脅迫后的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)基因均受枯萎病脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，其中GbDUF677-14和GbDUF677-21在抗病材料中的表達(dá)最大可達(dá)到脅迫前的6倍，說明這2個(gè)基因可能參與了海島棉抗枯萎病過程。本研究結(jié)果表明DUF677基因家族在海島棉抗枯萎病方面具有重要作用。

關(guān)鍵詞：海島棉；枯萎??；脅迫；生物信息學(xué)；DUF677基因家族

中圖分類號(hào)：S562.01；S435.621.2+4" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0054-10

收稿日期：2024-03-19

基金項(xiàng)目：國家科技創(chuàng)新2030-重大項(xiàng)目（編號(hào)：2023ZD04041）；“天山英才”培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：2023TSYCLJ0012）；安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：陸佳欣（1996—），女，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：joli_jia@163.com。

通信作者：曲延英，博士，教授，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：xjyyq5322@126.com。

棉花不僅是我國紡織工業(yè)的重要原料，也是食品、飼料和生物燃料的重要來源，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位［1］。海島棉（Gossypium barbadense）是世界棉花種植的第二栽培棉種，在我國主要種植于新疆地區(qū)，其特點(diǎn)是纖維品質(zhì)優(yōu)良，抗病性好［2-3］?？菸∈怯杉怄哏牭毒‵usarium oxysporum f. sp. vasinfectum，F(xiàn)ov）引起的土傳性真菌病害，可以感染100多種植物，對(duì)棉花、番茄（Solanum lycopersicum）和香蕉（Musa nana）等許多重要作物，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［4］?？菸?huì)導(dǎo)致棉花產(chǎn)量急劇下降，纖維品質(zhì)惡化，被稱為棉花“癌癥”［5］。目前世界范圍內(nèi)已鑒定到8個(gè)生理小種，其中7號(hào)生理小種在我國分布最為廣泛且致病力最強(qiáng)，是影響我國棉花生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)小種［6］。

功能未知結(jié)構(gòu)域（DUF）蛋白在真核生物中形成了大量功能未知的蛋白家族［7］。目前通過生物信息學(xué)的方法對(duì)大量的DUF基因家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)和進(jìn)化研究，從而揭示其潛在的功能［8］。Zhao等對(duì)陸地棉D(zhuǎn)UF668基因家族進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)GhDUF668-08和GhDUF668-23受到干旱和黃萎病的顯著誘導(dǎo)表達(dá)［9］。Martinez等在對(duì)谷類植物稻瘟病的研究中解釋了其包含DUF結(jié)構(gòu)域的多糖單加氧酶（MoPMO9A）活性以及在底物結(jié)合或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中的重要作用［10］。Shen等對(duì)棉花DUF1117基因家族進(jìn)行了鑒定并利用VIGS和過表達(dá)擬南芥驗(yàn)證了GhRDUF4D在抗黃萎病過程中的功能［11］。解美霞對(duì)陸地棉D(zhuǎn)UF642基因家族鑒定后利用VIGS技術(shù)證明了GhDUF642-10在棉花黃萎病中發(fā)揮的重要作用［12］。目前對(duì)于DUF677的研究較少，主要集中在擬南芥和水稻中。擬南芥AT14A基因編碼DUF677蛋白，與真菌、昆蟲和人類整合素蛋白（integrin）具有部分相似序列和功能的膜蛋白，被命名為類整合素蛋白（integrin like protein，ILP）。擬南芥AT14A還參與了對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過程。Chen等分析了DUF677在水稻中可能參與了其籽粒發(fā)育過程和幼苗根系生長(zhǎng)過程的調(diào)控，為后期探究提供了研究依據(jù)［13］。孫偉清等的研究表明，OsU496A作為質(zhì)膜上介導(dǎo)細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體的候選蛋白，對(duì)水稻籽粒發(fā)展具有重要意義［14］。

基因組測(cè)序在棉花中取得了顯著的成果，使系統(tǒng)地鑒定和研究棉花基因家族成為可能［15］。陸地棉和海島棉是由A基因組和D基因組通過自然雜交和染色體加倍形成的異源四倍體，其中A亞基因組供體是亞洲棉（A2基因組），D亞基因組供體是雷蒙德氏棉（D5基因組）［16］。DUF677家族基因已顯示出參與植物抗逆的潛作用。該基因家族在棉花中的進(jìn)化、功能和分類尚未系統(tǒng)研究。本研究分析了海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族的染色體分布、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、基序（Motif）及啟動(dòng)子順式作用元件，并結(jié)合RNA-Seq和qRT-PCR分析候選基因在枯萎病脅迫下的表達(dá)模式，揭示其可能的生物學(xué)功能。該結(jié)果將進(jìn)一步拓展我們對(duì)DUF677在植物種作用的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步研究這些基因在枯萎病脅迫下的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究選擇抗枯萎病海島棉品種06-146和感枯萎病品種新海14（XH14）為試驗(yàn)材料，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。菌種為尖孢鐮刀菌7號(hào)生理小種，接菌濃度為1×107個(gè)/mL。采用土培法將高溫滅菌后的營養(yǎng)土和蛭石按3 ∶1的體積比混合后裝入營養(yǎng)缽，選擇飽滿的06-146和新海14海島棉種子種植于營養(yǎng)缽中。待棉苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，用已滅菌的剪刀將營養(yǎng)缽底部剪掉，采用傷根法處理棉苗后，進(jìn)行枯萎病脅迫，分別在0、1、3、6、12、24 h對(duì)棉苗的根部組織進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后迅速凍存于液氮中，以便用于后續(xù)試驗(yàn)［17］。

本研究于2023年在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花DUF677家族成員鑒定

海島棉、陸地棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉基因組和蛋白組數(shù)據(jù)均來自COTTON-FGD數(shù)據(jù)庫（http：//www.cottonfgd org/）［18］。擬南芥和水稻的基因組和蛋白組數(shù)據(jù)均來自Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫 （http：//plants.ensembl.org/index.html）。在Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）獲取DUF677家族HMM模型文件（PF05055）［19］。利用HMMER3軟件（http：//www.hmmer.org/）對(duì)海島棉、陸地棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉、水稻和擬南芥的DUF677蛋白序列進(jìn)行鑒定［20］。通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和CDD數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）對(duì)DUF677家族基因預(yù)測(cè)并驗(yàn)證候選基因序列的保守結(jié)構(gòu)域［21-22］。

1.2.2 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)海島棉D(zhuǎn)UF677蛋白的氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和基本理化性質(zhì)［23］。采用在線網(wǎng)站CELLO （http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對(duì)海島棉D(zhuǎn)UF677基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)［24］。

1.2.3 棉花DUF677基因家族的進(jìn)化分析

利用MEGA 11軟件中的Clustal W默認(rèn)設(shè)置對(duì)以上植物的DUF677蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)［25］?；谛蛄斜葘?duì)結(jié)果，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，其中Bootstrap值設(shè)定為 1 000［26］。所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/tree/）進(jìn)行編輯和美化［27］。

1.2.4 海島棉D(zhuǎn)UF677進(jìn)化、蛋白基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在線軟件對(duì)DUF677蛋白序列的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，參數(shù)設(shè)置如下：“Maximum number of motifs”為10；“Occurrences of a single motif”為“zero or one per sequence”［28］。通過MEGA 11本地軟件對(duì)海島棉D(zhuǎn)UF677家族構(gòu)建進(jìn)化樹，獲得進(jìn)化樹nwk文件［29］。將保守基序預(yù)測(cè)得到的xml、進(jìn)化樹nwk、保守機(jī)構(gòu)域hitdata和基因結(jié)構(gòu)GFF文件利用TBtools軟件進(jìn)行處理及可視化。

1.2.5 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因的染色體定位

從海島棉基因組GFF注釋文件中提取DUF677基因家族成員的染色體位置信息，利用TB tools軟件繪制海島棉D(zhuǎn)UF677家族成員在染色體上的位置圖。

1.2.6 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因的順勢(shì)作用元件分析

利用棉花基因組數(shù)據(jù)庫Cotton FGD（http：//www.cottonfgd.org/）提取海島棉D(zhuǎn)UF677基因序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp序列，運(yùn)用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）在線軟件對(duì)此序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，并運(yùn)用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.2.7 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因響應(yīng)枯萎病脅迫表達(dá)量分析

基于前期研究結(jié)果，對(duì)感病品種新海14、抗病品種06-146進(jìn)行枯萎病脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，以確定表達(dá)水平；使用TBtools軟件生成表達(dá)量熱圖［30］。

1.2.8 qRT-PCR

根據(jù)海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因的cDNA信息，采用Premier 5.0軟件在GbDUF667-01、GbDUF667-14、GbDUF667-21、GbDUF667-22、GbDUF667-24和GbDUF667-35的特異區(qū)域設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1）。RNA提取使用總RNA提取試劑盒（天根，中國），使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根，中國）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以GbUBQ7基因?yàn)閮?nèi)參基因在ABI 7500 fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR分析。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix （BioRad，美國）試劑盒并按其提供的方法，擴(kuò)增體系為20 μL，包括Eva Green 2×qPCR MasterMix9 10.0 μL、ddH2O 6.8 μL、正反向引物各0.6 μL、cDNA模板2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s；60 ℃退火34 s，72 ℃延伸 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法［31］對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉D(zhuǎn)UF677家族成員的鑒定結(jié)果及理化性質(zhì)分析

通過HMMER搜索棉花DUF677基因家族序列，利用SMART和NCBI-CDD工具預(yù)測(cè)并驗(yàn)證保守結(jié)構(gòu)域，最終獲得DUF677基因：海島棉中40個(gè)、陸地棉中45個(gè)、亞洲棉中26個(gè)、雷蒙德氏棉中20個(gè)。海島棉A亞基因組和D亞基因組均包含20個(gè)DUF677家族基因，而亞洲棉、雷蒙德氏棉的DUF677家族基因數(shù)量分別為26、20個(gè)。A亞基因組的DUF677基因數(shù)量比亞洲棉少6個(gè)，D亞基因組DUF677基因數(shù)量與雷蒙德氏棉數(shù)量相等。這說明在棉花的進(jìn)化過程中A亞基因組的DUF677基因可能發(fā)生了丟失。

根據(jù)海島棉40個(gè)DUF677序列在染色體上的位置，依次命名為GbDUF677-01～GbDUF677-40。海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因的氨基酸數(shù)為55～406個(gè)，理論等電點(diǎn)分布在5.54～9.8，相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)域?yàn)?.390～46.03 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為28.86～61.44，脂溶性指數(shù)為74.55～108.77，并且40個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677家族成員基因均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GbDUF667-08、GbDUF667-11、GbDUF667-27這3個(gè)基因預(yù)測(cè)定位均在膜外蛋白上，另37個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因均定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核（表2）。

2.2 海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族染色體定位

通過染色體定位發(fā)現(xiàn)這40個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因分布在17條染色體中（A02、A03、A04、A05、A09、A10、A12、A13、D01、D02、D03、D05、D09、D10、D11、D12和D13），且A亞組和D亞組都分別含有20個(gè)DUF677基因（圖1）。其中，A09和D09、A10和D10以及A13和D13這3對(duì)染色體中分別含有1個(gè)DUF677基因，A12和D12染色體中分別含有3個(gè)基因，且以上A亞組和D亞組染色體中基因數(shù)量均一致。在海島棉中，A01和A11染色體中沒有該家族的序列，而在D01和D11中均含有1個(gè)序列；A02、A03、A04和A05染色體中分別含有8、2、1、3個(gè)該家族序列，而D02、D03和D05中分別含有2、6、4個(gè)該家族序列，D04染色體中則無該家族序列。說明海島棉D(zhuǎn)UF677基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因的丟失。但是A亞基因組與D亞基因組整體上依然具有很強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.3 海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族進(jìn)化分析

為了解析DUF677基因家族的進(jìn)化關(guān)系，本研究對(duì)40個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因和21個(gè)擬南芥DUF677基因、6個(gè)水稻DUF677基因蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2-a）。根據(jù)擬南芥及水稻的分組，將進(jìn)化樹分為A、B、C等3組，這3個(gè)亞組中分別含有3、10、27個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因。其中A亞組海島棉D(zhuǎn)UF677基因數(shù)量分別是擬南芥和水稻的3倍；B亞組海島棉D(zhuǎn)UF677基因數(shù)量分別是擬南芥

的2倍、水稻的5倍；C亞組海島棉D(zhuǎn)UF677基因數(shù)量約為擬南芥的2倍、水稻的9倍。這說明DUF677基因家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了部分A亞組基因的丟失，盡管A亞組成員較少，但它們?cè)谶M(jìn)化過程中一直保留著，這說明它們?cè)谏飳W(xué)過程中可能有著重要的作用。

為了進(jìn)一步解析棉花DUF677基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究對(duì)4個(gè)棉屬的DUF677基因蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2-b）。根據(jù)海島棉的分組，將進(jìn)化樹分為A、B、C等3組，這3個(gè)亞組中海島棉和陸地棉的DUF677基因數(shù)量基本約為亞洲棉和雷蒙德氏棉的2倍。這與前面的分析結(jié)果一致，符合棉花的進(jìn)化關(guān)系，說明DUF677家族基因在棉花進(jìn)化過程中相對(duì)保守。

2.4 海島棉D(zhuǎn)UF677蛋白基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)海島棉D(zhuǎn)UF677基因的全長(zhǎng)、CDS和蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行進(jìn)化樹、保守繼續(xù)、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。在40個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族成員中，根據(jù)基序特征和基因結(jié)構(gòu)可以分為3個(gè)亞組（圖3）。大多數(shù)DUF677成員具有相同的基序，且都具有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，說明同一家族存在功能相似性。其中A、B、C等3個(gè)亞組均含有Motif1和Motif3，但A亞組中包含Motif5，B亞組和C亞組中均沒有；C亞組中包含Motif2和Motif4，而A和B亞組中都分別僅有1個(gè)基因包含Motif2，且均不包含Motif5?；蚴堑鞍踪|(zhì)分子中含有特點(diǎn)空間構(gòu)象和特定功能的結(jié)構(gòu)成分，是結(jié)構(gòu)域的亞單位，與特定的功能聯(lián)系在一起。這說明3個(gè)亞組的基因結(jié)構(gòu)可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了變化，并對(duì)棉花的生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗枯萎病響應(yīng)發(fā)揮著不同的功能。

2.5 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因的順勢(shì)作用元件分析

運(yùn)用TBtools軟件提取海島棉D(zhuǎn)UF677基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)

分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的響應(yīng)植物激素及與環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件。如圖4所示，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將40個(gè)DUF677家族基因分為A、B、C等3組進(jìn)行啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分析，結(jié)果可看出DUF677基因具有多種植物激素和光響應(yīng)相關(guān)元件。參與枯萎病誘導(dǎo)激素反應(yīng)的元素主要有GA（赤霉素）、MeJA（茉莉酸甲酯）、SA（水楊酸）和類黃酮等。其中含有MeJA、GA的分別為20、18個(gè)，含有SA的有11個(gè)，另外參與類黃酮生物合成的順式作用元件有3個(gè)，所以從這4個(gè)生物合成誘導(dǎo)元件中進(jìn)行探究海島棉D(zhuǎn)UF677對(duì)枯萎病的脅迫表達(dá)情況。

2.6 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因響應(yīng)枯萎病脅迫表達(dá)量分析

基因表達(dá)模式通常與基因的功能有關(guān)。本研究對(duì)海島棉在枯萎病脅迫下差異的DUF677基因在4種抗感病極端材料（06-146_CK、06-146_Fov、XH14_CK、XH14_Fov）中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，40個(gè)海島棉D(zhuǎn)UF677基因可分為3種表達(dá)模式。GbDUF667-07、16、20、29和30可分為第1組，這5個(gè)基因在抗感材料中的表達(dá)量均較高，變化幅度較??；GbDUF667-02、03、05、06、09、17、22、34、35、36、38和39可分為第2組，大部分基因在材料中的表達(dá)量均為中等值；其余基因?yàn)榈?組，本組基因在各材料中的表達(dá)量均較低。

其中，GbDUF677-03和GbDUF677-05在品種新海14中的表達(dá)量較高，但在品種06-146中的表達(dá)量都趨近于0；GbDUF677-01、18、26和35在抗感病材料的對(duì)照組中表達(dá)量均為處理后的3倍及以上；GbDUF677-09和GbDUF677-22在抗感病材料處理后的表達(dá)量均為對(duì)照組的2倍及以上；GbDUF677-14和GbDUF677-21在新海14對(duì)照組中的表達(dá)量均為0，且在抗感材料中處理后的表達(dá)量均高于對(duì)照組，而GbDUF677-33在新海14處理后的表達(dá)量為0，且在抗感病材料對(duì)照組中表達(dá)量均高于處理后；GbDUF677-24僅在06-146進(jìn)行枯萎病侵染后有表達(dá)。因此選取這12個(gè)表達(dá)量變化幅度較大的基因進(jìn)行下一步研究，為深入海島棉GbDUF677基因家族抗逆脅迫研究提供依據(jù)。

2.7 海島棉D(zhuǎn)UF677家族基因響應(yīng)枯萎病脅迫的qRT-PCR

結(jié)合啟動(dòng)子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，推測(cè)GbDUF667-01、GbDUF667-14、GbDUF667-21、GbDUF667-22、 GbDUF667-24和GbDUF667-35這6個(gè)基因可能參與了海島棉枯萎病脅迫?；虮磉_(dá)模式通常與基因功能相關(guān)聯(lián)，為此本研究利用海島棉抗枯萎病材料06-146和感枯萎病材料新海14進(jìn)行枯萎病脅迫后的表達(dá)量分析（圖6）。與脅

迫前相比，在枯萎病脅迫處理后這6個(gè)基因的表達(dá)量顯示均被顯著誘導(dǎo)，在抗病材料中的表達(dá)顯著高于在感病材料中的表達(dá)。其中GbDUF677-14和GbDUF677-21的表達(dá)量相較于脅迫前提高了6倍左右，說明這2個(gè)基因在海島棉抵抗枯萎病脅迫過程中可能起到了重要的作用。

3 討論

棉花在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中面臨高溫、病害、干旱、鹽堿等多種非生物脅迫，嚴(yán)重影響著棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。在保證棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ)上，提高棉花抵抗非生物逆境脅迫的能力則至關(guān)重要［32］。DUF家族最初是一類功能未知的超基因家族，隨著研究的深入，部分功能被發(fā)掘［33］。隨著基因組工程和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷研究，大量的未知功能基因被發(fā)掘出來，根據(jù)這些基因的序列同源性被分到不同的家族。用已知的蛋白功能來推測(cè)未知功能的蛋白，進(jìn)而通過分子手段研究其功能，是解決問題的關(guān)鍵。海島棉D(zhuǎn)UF677研究的開展，為揭示DUF677家族的功能研究拓展了更廣闊的空間。在不同物種中，DUF677基因的數(shù)量和基序組成往往有所不同。前人在水稻中研究發(fā)現(xiàn)了7個(gè)DUF677基因［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲棉、雷蒙德氏棉、陸地棉和海島棉基因組中分別含有26、20、45、40個(gè)DUF677家族基因。本研究在海島棉中共鑒定出40個(gè)DUF677家族成員，分析了這40個(gè)家族成員在海島棉植株中的進(jìn)化和表達(dá)，探討了DUF677基因的潛在抗枯萎病作用。

根據(jù)進(jìn)化樹分析，同組的海島棉D(zhuǎn)UF677成員有相似的基因結(jié)構(gòu)和基序分布，表明同組海島棉D(zhuǎn)UF677成員可能具有相似的功能。激素在植物對(duì)抗病原真菌的過程中有著極其重要的作用，茉莉酸（JA）、SA和類黃酮是參與植物內(nèi)部對(duì)抗病原菌的主要激素以及參與調(diào)節(jié)針對(duì)病原性攻擊和植食性的防御基因［34-36］。Li等在研究中發(fā)現(xiàn)，SA能夠進(jìn)入病原體細(xì)胞并抑制枯萎病病原體的關(guān)鍵靶點(diǎn)［37］。Pei等驗(yàn)證了GhABP19通過激活JA通路來調(diào)控棉花對(duì)枯萎病抗性中的重要作用［38］。Zu等報(bào)道了CHI基因中所產(chǎn)生的類黃酮生物合成途徑在棉花枯萎病抗病中起到了關(guān)鍵作用［39］。結(jié)合順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)DUF677家族成員含有諸多與抵抗枯萎病脅迫相關(guān)的元件，如SA、MeJA和類黃酮作用元件等，說明DUF677可能具有更復(fù)雜的功能。

進(jìn)一步研究GbDUF677家族基因在海島棉抵抗枯萎病脅迫下不同抗感材料中的特異性表達(dá)，能揭示GbDUF677基因在棉花抗枯萎病脅迫中的潛在作

用。在水稻中抑制DUF677的表達(dá)，可以提高水稻的耐鹽性，減少水分流失，提升水稻產(chǎn)量［13］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)譜結(jié)果表明，GbDUF677家族各成員對(duì)枯萎病脅迫處理后的響應(yīng)表達(dá)變化幅度較大，推測(cè)其部分家族成員可能在海島棉響應(yīng)枯萎病脅迫過程中發(fā)揮重要作用，為后期的研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

本研究顯示，接種枯萎病菌處理下各GbDUF677基因的qRT-PCR表達(dá)模式為功能分析提供了重要依據(jù)。通過對(duì)海島棉06-146和新海14進(jìn)行枯萎病脅迫處理，利用qRT-PCR進(jìn)行海島棉D(zhuǎn)UF677基因表達(dá)量初步分析，研究結(jié)果表明DUF677家族成員在海島棉抵抗枯萎病脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用，并且海島棉D(zhuǎn)UF677基因很可能在受到枯萎病脅迫后，通過表達(dá)量變化引起GbDUF677-14和GbDUF677-21相關(guān)基因表達(dá)，來提高海島棉的抗枯萎病性。

4 結(jié)論

本研究對(duì)棉花DUF677基因進(jìn)行了全基因組鑒定，根據(jù)基因數(shù)量、進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)DUF677基因家族可分為3個(gè)亞組。對(duì)海島棉基因組中的40個(gè)DUF677家族基因的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GbDUF677-14和GbDUF677-21在海島棉響應(yīng)枯萎病脅迫過程中發(fā)揮重要的作用。本研究初次對(duì)海島棉D(zhuǎn)UF677基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)解析，并對(duì)海島棉的抗枯萎病響應(yīng)機(jī)制提供了新的參考，為這些基因功能的深入解析和育種應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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