花魔芋GRAS家族基因全基因組鑒定與脅迫下表達(dá)分析

摘要：GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等多個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用?；в螅ˋmorphophallus konjac）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前尚無(wú)關(guān)于花魔芋GRAS家族基因的相關(guān)報(bào)道。采用生物信息學(xué)手段對(duì)花魔芋GRAS家族基因進(jìn)行全基因組鑒定與功能分析，通過(guò)RNA-Seq解析了花魔芋GRAS家族基因響應(yīng)非生物和生物脅迫脅迫的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，花魔芋有51個(gè)GRAS家族成員，劃分為8個(gè)亞家族。該家族編碼的蛋白由144～850個(gè)氨基酸組成，分子量介于15 789.78～90 823.32 u之間，等電點(diǎn)在4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩(wěn)定蛋白。順式作用元件分析顯示AkGRAS基因的啟動(dòng)子區(qū)富含激素、干旱和低溫等逆境響應(yīng)元件。RNA-seq結(jié)果表明，多個(gè)亞家族基因成員響應(yīng)干旱、鹽脅迫和軟腐病原菌侵染表達(dá)。且PAT1亞家族基因AkGRAS35、AkGRAS19、AkGRAS40在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，AkGRAS41顯著下調(diào)表達(dá)；AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51在軟腐病原菌侵染下上調(diào)表達(dá)，AkGRAS8和AkGRAS46下調(diào)表達(dá)。推測(cè)PAT1亞家族基因在花魔芋高鹽脅迫和軟腐病原菌侵染應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：花魔芋；GRAS家族基因；逆境響應(yīng)；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：Q943.2；S632.301" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0040-14

收稿日期：2024-11-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31860057）；云南省基礎(chǔ)研究專項(xiàng)面上項(xiàng)目（編號(hào)：202401AT070002）；安康市科技計(jì)劃（編號(hào)：AK2022-NY-04）；安康學(xué)院專項(xiàng)計(jì)劃（編號(hào)：2023AYKCYZ05）；曲靖師范學(xué)院博士創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃。

作者簡(jiǎn)介：李竹梅（1988—），女，云南騰沖人，博士，講師，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：lizhume@163.com。

通信作者：褚洪龍，博士，副教授，從事植物抗逆生理、植物與微生物互作研究。E-mail：chuhonglo@163.com。

GRAS是一類在植物中起著重要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子家族，其名稱來(lái)源于3個(gè)典型家族成員赤霉素不敏感（GAI）、赤霉素不敏感抑制因子（RGA）和稻草人（SCR）。GRAS家族蛋白一般含有400～770個(gè)氨基酸殘基，這些蛋白的編碼通常由非保守的N末端基序和高度保守的C末端基序組成［1］。GRAS蛋白的N末端包含固有無(wú)序區(qū)（IDR），即非折疊區(qū)，使得GRAS蛋白被歸類為固有無(wú)序化蛋白（IDPs）［2］。IDRs序列在溶液狀態(tài)下不形成穩(wěn)定的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，但在遇到合適的配體時(shí)會(huì)折疊成有序結(jié)構(gòu)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能調(diào)節(jié)。其中C末端基序中包含了一系列高度保守的結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸七肽重復(fù)序列Ⅰ（LHRⅠ）、VHIID、亮氨酸七肽重復(fù)序列Ⅱ（LHRⅡ）、PFYRE和SAW。VHIID（其中V為纈氨酸，H組氨酸，I為異亮氨酸，D為天冬氨酸）結(jié)構(gòu)域位于LRⅠ和LRⅡ結(jié)構(gòu)域之間，是這些保守結(jié)構(gòu)域中的核心結(jié)構(gòu)域，在蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用中起著重要作用［3］。Hirsch等根據(jù)GRAS蛋白結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將其分類為8個(gè)亞家族，分別為L(zhǎng)ISCL、DELLA、PAT1、HAM、LS、SCR、SHR和SCL3［4］。

目前GRAS家族己經(jīng)在水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹(shù)（Populus przewalskii Maxim.）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等多個(gè)物種中被鑒定研究［1，5-11］。不同物種之間由于GRAS蛋白序列N末端的長(zhǎng)度和序列不同，GRAS家族成員數(shù)量和亞族存在著較大的差異。在水稻、玉米、花生、獼猴桃、蘋果、楊樹(shù)、擬南芥中分別有60、49、64、173、88、78、106、34個(gè)GRAS基因。在獼猴桃、玉米以及花生中，GRAS基因家族分類為8個(gè)不同的亞家族；在蘋果中，GRAS基因家族劃分為11個(gè)亞家族，其中LISCL亞家族成員數(shù)量最多。在擬南芥、楊樹(shù)、水稻中GRAS基因蛋白至少分為13個(gè)亞家族。

GRAS轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、逆境適應(yīng)等方面都具有重要的影響。研究表明，擬南芥GRAS轉(zhuǎn)錄因子中的DELLA蛋白是赤霉素（GA）信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子，例如在莖伸長(zhǎng)、開(kāi)花誘導(dǎo)、種子萌發(fā)和花發(fā)育等過(guò)程中抑制植物對(duì)GA的應(yīng)答反應(yīng) ［12-13］。GRAS蛋白家族的PAT1和SCL21在光信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著積極的調(diào)控作用。例如，Bolle等在擬南芥pat1-1突變體中發(fā)現(xiàn)，phyA（Phytochrome A）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期階段受到干擾，導(dǎo)致在遠(yuǎn)紅光照射下下胚軸的伸長(zhǎng)不再受光抑制［14］。此外，SCL21在不同的光線處理下表達(dá)量有所降低，而PAT1則未受影響，這表明它們?cè)谶h(yuǎn)紅光調(diào)控路徑中發(fā)揮著不同的作用。徐紅云和張明意通過(guò)比較野生型擬南芥和AtSCL4突變體在滲透脅迫下的生理指標(biāo)和基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AtSCL4在滲透脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，且突變體具有更強(qiáng)的抗?jié)B能力［15］。張群等通過(guò)對(duì)白樺（Betula platyphylla）的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，BpGRAS1的表達(dá)量上升，過(guò)表達(dá)植株的電解質(zhì)滲透率、失水率和MDA含量降低，同時(shí)POD和SOD活性增強(qiáng)，從而出現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株的耐鹽性增強(qiáng)，而抑制表達(dá)植株的耐鹽性降低［16］。王同歡等發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，菊花腦（Chrysanthemum nankingense）GRAS家族中有14個(gè)基因表現(xiàn)出顯著的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)［17］。楊杰等通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，枳（Poncirus trifoliata）中12個(gè)PtrGRAS基因在低溫脅迫下表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化，其中PtrGRAS11、PtrGRAS26和PtrGRAS30受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，推測(cè)它們可能在抵御低溫脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。

花魔芋（Amorphophallus konjac）隸屬于天南星科魔芋屬，是一種多年生草本植物，主要分布于中國(guó)、日本、東南亞地區(qū)。魔芋地下球莖主要成分為葡甘聚糖，含量在44%～64%之間［19］。葡甘聚糖具有多種優(yōu)良的特性，使得其在食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用 ［20-21］。隨著花魔芋全基因組測(cè)序工作的完成，為基因家族的全基因組分析提供了便利，也為花魔芋功能基因組學(xué)研究提供了可靠的基因組數(shù)據(jù)信息?；贕RAS基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的重要作用，本研究利用生物信息學(xué)手段，以花魔芋全基因組為基礎(chǔ)，鑒定花魔芋AkGRAS基因家族成員，并對(duì)這些基因的理化特性、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化、共線性關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)域以及啟動(dòng)子順式元件等進(jìn)行分析，利用RNA-Seq技術(shù)分析GRAS基因在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的表達(dá)模式。以期為后續(xù)花魔芋GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因功能研究提供重要參考，為魔芋分子育種提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 花魔芋GRAS基因的鑒定及定位分析

在線數(shù)據(jù)庫(kù)Figshare（https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.15169578）下載花魔芋gff3基因組注釋數(shù)據(jù)文件和蛋白序列文件，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_022559845.1/）數(shù)據(jù)庫(kù)下花魔芋的基因組文件［20］。從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）網(wǎng)站上下載GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域（Pfam檢索號(hào)為PF03514）的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）。利用Tbtools-Ⅱ（v2.083）軟件，使用Simple HMM Search命令對(duì)花魔芋全基因組蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索。篩選出E值小于1.0×10-5的基因ID，并提取相應(yīng)蛋白序列。通過(guò)NCBI Batch CD-Search工具（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART在線網(wǎng)站（https：//smart.embl.de/）驗(yàn)證候選蛋白是否包含GRAS保守結(jié)構(gòu)域。將缺失GRAS結(jié)構(gòu)域的候選基因移除，最終確定花魔芋GRAS基因。使用Tbtools的Graphics功能對(duì)基因位置進(jìn)行可視化。

1.2 花魔芋GRAS家族的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

使用Tbtools軟件中的Protein Paramter Calc工具，對(duì)花魔芋GRAS家族編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行多項(xiàng)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，包括脂肪系數(shù)、親水性、不穩(wěn)定系數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目等。同時(shí)，通過(guò)在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）對(duì)該家族的蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析及保守結(jié)構(gòu)域、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析分析

使用TBtools軟件提取花魔芋GRAS基因上游的2 000 bp啟動(dòng)子序列，通過(guò)Plant CARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行分析。使用TBtools軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

將花魔芋GRAS蛋白序列上傳至NCBI網(wǎng)站的Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具中，獲取hitdata結(jié)果文件。hitdata文件包含了蛋白序列與Conserved Domain Database（CDD）中保守結(jié)構(gòu)域的匹配信息。隨后，利用TBtools軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化操作。利用MEME（http：//meme-suite.org）在線網(wǎng)站對(duì)花魔芋GRAS基因進(jìn)行motif預(yù)測(cè)。利用TBtools軟件展示出各個(gè)motif在GRAS基因家族中的分布情況和特征。根據(jù)基因組注釋文件（gff）通過(guò)TBtools軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化。

1.4 花魔芋GRAS家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

從Plant TFDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//planttfdb.gao-lab.org）上下載了擬南芥的34個(gè)GRAS蛋白序列和水稻的60個(gè)GRAS蛋白序列（附表 1）。利用MEGA 11.0對(duì)花魔芋、擬南芥和水稻這3種物種的GRAS蛋白進(jìn)行了多序列比對(duì)，最大似然法（ML）構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將Bootstrap method設(shè)置為1 000。利用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de/login.cgi）美化進(jìn)化樹(shù)。

1.5 花魔芋GRAS家族共線性分析

利用TBtools軟件的Fasta Stats和GFF3/GTF Gene Position（Info.） Parse功能來(lái)獲取染色體長(zhǎng)度和基因位置信息。通過(guò)Table Row Extract or Filter模塊提取目標(biāo)基因的信息。使用McscanX工具進(jìn)行共線性分析，并結(jié)合Advanced Circos工具繪制出花魔芋GRAS家族的共線性關(guān)系圖譜。使用TBtools軟件中McscanX功能分析花魔芋與擬南芥以及水稻之間的同源關(guān)系。通過(guò)TBtools軟件中Dual Systeny Plot for MCscanX工具進(jìn)行共線性可視化。

1.6 花魔芋GRAS基因非生物脅迫和生物脅迫下的表達(dá)分析

2022年10月對(duì)曲靖師范學(xué)院云南高原生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究中心組培間的花魔芋組培苗進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫處理：用濃度為20%的PEG-6000對(duì)花魔芋組培苗進(jìn)行干旱脅迫處理，脅迫誘導(dǎo)4 h；用濃度為80 mmol/L的NaCl溶液對(duì)花魔芋組培苗進(jìn)行鹽脅迫處理，脅迫誘導(dǎo)4 h。脅迫處理后分別對(duì)花魔芋組培苗的地上部分和地下部分進(jìn)行收樣，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，不做處理的為對(duì)照組（CK）。生物脅迫處理為接種花魔芋軟腐病病原菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），采用針刺法接種，于接種24、48 h后收樣液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以無(wú)菌水處理為對(duì)照［21］。

干旱脅迫和鹽脅迫處理樣品送諾禾致源測(cè)序公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得測(cè)序結(jié)果。生物脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自BioProject數(shù)據(jù)庫(kù)，索引號(hào)為PRJNA1017648。根據(jù)花魔芋GRAS基因家族的ID提取該家族基因的FPKM數(shù)值，以Actin值（HIC_ASM_3.3714）作為參照，得到其相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)Student’s t-test（t檢驗(yàn)）檢測(cè)基因表達(dá)量與CK是否存在顯著差異，若有顯著差異，則用*號(hào)標(biāo)記。最后，利用TBtools軟件繪制熱圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花魔芋GRAS基因家族成員的鑒定及定位分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型（PF03514），對(duì)花魔芋全基因組序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析和篩選，初步篩選得到56個(gè)AkGRAS候選基因。進(jìn)一步運(yùn)用NCBI Batch CD-Search和SMART工具，對(duì)這56個(gè)候選基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了逐一檢索和驗(yàn)證，以確保每個(gè)候選基因均包含完整的GRAS基因保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果（圖1）顯示，有5個(gè)GRAS候選基因不具備完整的結(jié)構(gòu)域，分別是HIC_ASM_9.10171、CTG_ASM_14911.2、HIC_ASM_5.9023、HIC_ASM_11.6731、HIC_ASM_5.8807。因此，手動(dòng)剔除不具備完整GRAS結(jié)構(gòu)域的候選基因后，最終確定51個(gè)花魔芋GRAS基因家族成員。依照AkGRAS基因在染色體上的排列次序，51個(gè)基因被命名為AkGRAS1～AkGRAS51。經(jīng)過(guò)對(duì)AkGRAS基因家族的染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因（AkGRAS45～AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個(gè)基因則分布在13條染色體上。其中，第6號(hào)染色體上存在9個(gè)AkGRAS基因，是所有染色體中基因數(shù)量最多的一條染色體。而第5號(hào)染色體上則有7個(gè)AkGRAS基因，僅次于第6號(hào)染色體。而第1、4、13號(hào)染色體上各僅有1個(gè)AkGRAS基因。此外，有8組基因（AkGRAS5/AkGRAS6/AkGRAS7、AkGRAS10/AkGRAS11/AkGRAS12、AkGRAS13/AkGRAS14、AkGRAS21/AkGRAS22、AkGRAS27/AkGRAS28、AkGRAS37/AkGRAS38、AkGRAS40/AkGRAS41、AkGRAS42/AkGRAS43）在染色體上緊密連鎖在一起，推測(cè)每組基因可能具有某種結(jié)構(gòu)或功能上的聯(lián)系。

2.2 花魔芋GRAS家族的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

由表1可知，該家族成員所編碼的氨基酸數(shù)量在144～850個(gè)，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。51個(gè)AkGRAS基因家族成員親水性總平均值介于-0.653～0.334之間，僅有4個(gè)（AkGRAS4、AkGRAS15、AkGRAS22和AkGRAS50）是疏水性蛋白，表明大多數(shù)AkGRAS基因家族成員具有一定的親水性特征。不穩(wěn)定系數(shù)在34.23（AkGRAS15）～68.44（AkGRAS11）之間，AkGRAS4、AkGRAS15和AkGRAS50是穩(wěn)定蛋白。等電點(diǎn)分布在4.94～11.19之間，42個(gè)蛋白呈酸性，9個(gè)蛋白呈堿性。這9個(gè)蛋白分別是AkGRAS2、AkGRAS4、AkGRAS8、AkGRAS16、AkGRAS17、AkGRAS31、AkGRAS33、AkGRAS34、AkGRAS46。利用WoLF PSORT預(yù)測(cè)花魔芋GRAS蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果（表 1）表明，花魔芋GRAS蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體、線粒體這4個(gè)位置上的分布最為常見(jiàn)。

2.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析

通過(guò)PlantCARE在線網(wǎng)站，分析了花魔芋GRAS基因家族的順式作用元件種類和元件潛在功能。結(jié)果（圖2）表明，花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的順式調(diào)控元件，包括光響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、低溫響應(yīng)元件（LTR）等順式作用元件。由表2可知，51個(gè)AkGARS基因全部含有光響應(yīng)元件，其中有26個(gè)AkGARS含有赤霉素響應(yīng)元件、25個(gè)AkGARS含有水楊酸響應(yīng)元件、49個(gè)AkGARS含有脫落酸響應(yīng)元件、23個(gè)AkGARS含有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和22個(gè)AkGARS含有低溫響應(yīng)元件。除以上提到的順式作

2.4 花魔芋GRAS家族的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

研究結(jié)果顯示，在這些AkGRAS基因中，不同的motif種類和數(shù)量存在一定的差異，而且這些motif的排列順序也呈現(xiàn)一定的規(guī)律。大部分AkGRAS基因按照motif10、motif6、motif1、motif8、motif7、motif9、motif5、motif3、motif2、motif4的排列順序來(lái)呈現(xiàn)其保守基序motif骨架。其中有14個(gè)基因，即AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS9、AkGRAS12、AkGRAS13、AkGRAS14、AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS21、AkGRAS35、AkGRAS43、AkGRAS44、AkGRAS47、AkGRAS51，它們都包含了10個(gè)motif，顯示出較為豐富的保守基序種類。相反，AkGRAS8和AkGRAS17基因包含的保守基序種類最少，只有1個(gè)motif。值得注意的是，在每個(gè)GRAS蛋白里，motif4通常出現(xiàn)在C端的末尾位置，而motif8則容易出現(xiàn)缺失。此外，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，所有的花魔芋GRAS基因包含了1～3個(gè)編碼序列（CDS），有38個(gè)AkGRAS成員不含內(nèi)含子（圖3）。

2.5 花魔芋GRAS家族的保守結(jié)構(gòu)域分析

AkGRAS家族基因編碼的蛋白都含有GRAS結(jié)構(gòu)域（圖4）。值得注意的是，AkGRAS9、AkGRAS3和AkGRAS15這3個(gè)蛋白質(zhì)中各有2個(gè)不同的保守結(jié)構(gòu)域。AkGRAS9蛋白包含1個(gè)能夠參與植物各種生理過(guò)程調(diào)節(jié)的DELLA結(jié)構(gòu)域。因此，可以推測(cè)AkGRAS9蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。AkGRAS3蛋白含有Atrophin1 superfamily結(jié)構(gòu)域。Atrophin1 superfamily結(jié)構(gòu)域在不同生物體中都具有重要的功能，可能與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)。AkGRAS15蛋白含有RNA1 superfamily結(jié)構(gòu)域，可能在基因調(diào)控或信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著特定的功能。

2.6 花魔芋GRAS家族共線性分析

通過(guò)對(duì)花魔芋GRAS基因的共線性分析發(fā)現(xiàn)，在51個(gè)GRAS基因中共有7對(duì)共線性關(guān)系（圖5）。具體來(lái)說(shuō)，第8號(hào)與第9號(hào)和第10號(hào)染色體之間有1對(duì)同源基因；第6號(hào)和第2號(hào)染色體之間有1對(duì)同源基因；第5號(hào)和第3號(hào)染色體之間存在1對(duì)同源基因；第11號(hào)和第12號(hào)染色體上各自存在同源基因。這些結(jié)果為深入研究花魔芋基因的演化和功能提供了重要的基礎(chǔ)。此外，還進(jìn)行了花魔芋、擬南芥和水稻之間的GRAS基因家族的共線性分析。其中，擬南芥為雙子葉植物，花魔芋和水稻屬于

子葉植物。 從共線性圖譜中（圖6）可以觀察到， 花

魔芋與擬南芥、水稻之間的同源基因?qū)?shù)量的差異，即花魔芋與擬南芥存在12對(duì)同源基因，與水稻存在18對(duì)同源基因。花魔芋與水稻之間的同源基因?qū)?shù)量多于花魔芋與擬南芥之間的同源基因?qū)?shù)量。這種現(xiàn)象表明花魔芋與其他物種之間的GRAS基因在演化過(guò)程中存在一定的差異，可能反映了它們?cè)诨蚪M結(jié)構(gòu)和功能上的特異性。

2.7 花魔芋GRAS家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 11.0將篩選得到的花魔芋（51個(gè)）與擬南芥（34個(gè)）、水稻（60個(gè)）的GRAS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖7）。根據(jù)Hirsch等［4］和Dutta等［22］的分類方式，51個(gè)AkGRAS家族基因被劃分為8個(gè)亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族，但是各亞家族成員數(shù)量的分布并不均勻。其中，LISCL、DELLA和SCL3亞家族的成員數(shù)量較少，分別有4、5、8個(gè)；而SHR和PAT1亞家族的成員數(shù)量最多，都有10個(gè)。相比之下，LS亞族的成員數(shù)量最少，僅有2個(gè)。

2.8 花魔芋GRAS基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

干旱和高鹽等非生物因素對(duì)作物產(chǎn)量造成的負(fù)面影響已經(jīng)成為全球糧食生產(chǎn)上的一大挑戰(zhàn)。植物對(duì)干旱、高鹽等逆境壓力做出響應(yīng)時(shí)，植物根系充當(dāng)直接響應(yīng)外部環(huán)境的器官，發(fā)揮著重要作用。如圖 8所示，花魔芋地下部分SCL、DELLA和PAT1亞家族的成員在干旱脅迫和鹽脅迫時(shí)，其表達(dá)量顯著上調(diào)。這些成員包括1個(gè)SCL的基因（AkGRAS24）、1個(gè)DELLA的基因（AkGRAS29）和3個(gè)PAT1的基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40），推測(cè)它們可能是花魔芋地下部分抗旱、耐鹽的候選基因。然而，部分亞家族基因在花魔芋地下部分呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，例如SCR（AkGRAS12）、HAM（AkGRAS3和AkGRAS23）、DELLA（AkGRAS9）?；в蟮厣喜糠郑ㄈ缜o、葉）鹽脅迫誘導(dǎo)下PAT1亞族基因AkGRAS8表達(dá)顯著上調(diào)，而LISCL亞族基因AkGRAS36表達(dá)顯著下調(diào)；而在干旱脅迫下地上部分沒(méi)有任何基因顯著差異表達(dá)。在干旱和鹽脅迫條

件下，花魔芋GRAS家族基因中的DELLA、SHR、SCL3、SCR、PAT1、LISCL和HAM亞家族均顯示出明顯的表達(dá)變化。值得關(guān)注的是，在鹽脅迫條件下，PAT1（AkGRAS41）和SHR（AkGRAS13）在花魔芋地上部分和地下部分的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著下調(diào)，PAT1（AkGRAS40）則呈現(xiàn)顯著上調(diào)。

2.9 花魔芋GRAS基因在生物脅迫下的表達(dá)分析

魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）引起的毀滅性病害［23］，因目前缺乏有效防控措施，嚴(yán)重影響著魔芋的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了魔芋的生產(chǎn)和發(fā)展［21］。本研究探究了花魔芋接種軟腐病原菌24、48 h GRAS家族基因的表達(dá)情況。結(jié)果（圖9）表明，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的AkGRAS家族基因成員被誘導(dǎo)下調(diào)或上調(diào)表達(dá)。其中，接種軟腐病原菌24 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調(diào)，AkGRAS8和AkGRAS46顯著下調(diào)；SCL3亞家族AkGRAS45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調(diào)；DELLA亞家族的AkGRAS32，HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6顯著下調(diào)。接種軟腐病原菌 48 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調(diào)，AkGRAS8顯著下調(diào)；SCL3亞家族的AkGRAS24、AkGRA45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調(diào)；而HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22，SCL42亞家族的AkGRAS42，SCR亞家族的AkGRAS10、AkGRAS11、AkGRAS12和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS21、AkGRAS47顯著下調(diào)。

3 討論

GRAS基因家族參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)傳導(dǎo)和逆境脅迫等生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，隨著多種植物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的公布，對(duì)GRAS基因家族成員的鑒定工作已經(jīng)在不同植物物種中開(kāi)展，如水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹(shù)（Populus przewalskii）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等［1，5-11，22］?；в笫且环N多年生草本植物，其塊莖富含葡甘聚糖，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。目前未見(jiàn)有關(guān)花魔芋GRAS基因家族的研究。本研究采用生物信息學(xué)手段對(duì)花魔芋GRAS基因家族進(jìn)行了鑒定與表達(dá)分析。結(jié)果顯示，花魔芋有51個(gè)GRAS家族成員，并發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因（AkGRAS45～ AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個(gè)基因則分布在13條染色體上（圖1）?；в驡RAS基因家族成員劃分為8個(gè)亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族（圖7）。其蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該家族成員所編碼的氨基酸數(shù)量在 144～850個(gè)之間，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。等電點(diǎn)在 4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩(wěn)定蛋白，且具有一定的親水性（表1）。

花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的順式調(diào)控元件（圖2），這些元件的種類多樣，主要包括光響應(yīng)元件、脅迫應(yīng)答元件（例如低溫、厭氧和防御反應(yīng)等）以及各種激素響應(yīng)元件（例如生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素和水楊酸等）。這表明花魔芋GRAS基因幫助植物適應(yīng)外界環(huán)境變化和抵御各種生物或非生物脅迫。對(duì)花魔芋的GRAS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，約75%的花魔芋GRAS基因家族成員不含內(nèi)含子（圖3）。在其他植物中，如黃瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum lycopersicum）中，無(wú)內(nèi)含子的GRAS蛋白所占的比例分別為75.67%和77.40%［24-25］。這表明在不同植物中，無(wú)內(nèi)含子的GRAS基因比例相對(duì)較高，且這種基因結(jié)構(gòu)在各種物種中都表現(xiàn)出較高的保守性。

已有多種植物的GRAS基因家族被報(bào)道參與非生物脅迫應(yīng)答［25-28］。例如，葡萄（Vitis vinifera）的GRAS基因VviRGA5（DELLA亞家族）和VviLISCL1（SCL亞家族）對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)；擬南芥（A. thaliana）的SCL亞家族基因AtSCL14對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)強(qiáng)烈［26-27］。番茄（Lycopersicon esculentum）的SlGRAS2（PAT4亞家族）和LeHAM3（HAM亞家族）對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出強(qiáng)烈響應(yīng) ［25］。水稻（Oryza sativa）的OsGRAS23（SCL亞家族）在鹽脅迫下也有顯著響應(yīng)，而在鹽地堿蓬（Halostachys caspica）中，SCL亞家族的HcSCL13在干旱和鹽脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，且增加了其過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長(zhǎng)量和鹽脅迫耐受性［28-29］。胡楊（Populus euphratica）中的PeSCL7也對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽和干旱脅迫下，花魔芋中1個(gè)SCL亞家族基因（AkGRAS24）、1個(gè)DELLA亞家族基因（AkGRAS29）和3個(gè)PAT1亞家族基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40）顯著上調(diào)；同時(shí)，部分基因在脅迫下顯著下調(diào)，例如SCR亞家族（AkGRAS12）、HAM亞家族（AkGRAS3和AkGRAS23）和DELLA亞家族（AkGRAS9）。植物通過(guò)增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性來(lái)清除細(xì)胞中過(guò)量的活性氧（ROS），從而提高干旱和鹽的耐受性［31-32］。例如，水稻中的OsGRAS2（SCL亞家族）參與干旱脅迫響應(yīng)，而OsGRAS23在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，且其過(guò)表達(dá)植株中SOD和POD活性增加［33］。PeSCL7

是胡楊中的應(yīng)激響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，能提高其對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［34］。在本研究中，花魔芋在干旱脅迫下，多數(shù)AkGRAS基因在地下部分差異表達(dá)，推測(cè)這些基因主要在根部發(fā)揮調(diào)控作用。值得注意的是，在鹽脅迫下顯著差異表達(dá)的AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS40和AkGRAS41成員都屬于PAT1亞家族。同樣，干旱脅迫下葡萄中的PAT1亞家族基因VviPAT3、VviPAT4、VviPAT6和VviPAT7上調(diào)表達(dá) ［35］。Zhang等發(fā)現(xiàn)棉花中的GRAS基因 Gh_D01G0564 和Gh_A04G01966（屬于PAT1亞家族）在鹽、低溫、高溫和PEG處理下的表達(dá)顯著上調(diào)［36］。Yuan等則發(fā)現(xiàn)葡萄（Vitis amurensis）的GRAS轉(zhuǎn)錄因子VaPAT1過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫、干旱和高鹽的耐受性［37］。因此，推測(cè)花魔芋的PAT1亞家族基因在提高鹽耐受性方面具有重要作用。然而，要全面了解GRAS基因在植物干旱和鹽脅迫中的功能，仍需進(jìn)一步研究。

GRAS基因DELLA亞家族的成員在擬南芥感染致病細(xì)菌期間起到了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并增強(qiáng)了對(duì)病原菌的抗性［38］。本研究中，發(fā)現(xiàn)花魔芋在感染軟腐病原菌24 h后，AkGRAS42（DELLA亞家族）顯著下調(diào)。Bonshtien等首次證明了GRAS基因在番茄抗病起關(guān)鍵作用，S1GRAS4和S1GRAS6在響應(yīng)真菌誘導(dǎo)劑時(shí)也被誘導(dǎo)表達(dá)，GRAS基因的超表達(dá)表明這些基因可能參與了激活植物防御反應(yīng)［39-0］。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著接種病原細(xì)菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)，更多GRAS基因家族成員被誘導(dǎo)表達(dá)。盡管如此，大多數(shù)GRAS家族基因的具體作用仍不清楚，進(jìn)一步研究有助于深入理解GRAS基因與植物防御系統(tǒng)的相互關(guān)系。

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