飼糧添加高蛋白牧草對(duì)黔東南小香雞腸道菌群的影響

摘要：本試驗(yàn)旨在研究黔東南小香雞在林下養(yǎng)殖過程中飼糧中添加不同牧草對(duì)雞腸道微生物菌群的影響。選擇180只60日齡初始體重相近的健康黔東南小香雞，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20只雞。對(duì)照組（A組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加200-/0白三葉草（B組）和20%光葉紫花苕（C組），預(yù)飼期5d，正式試驗(yàn)期56 d。試驗(yàn)結(jié)束后，收集試驗(yàn)雞盲腸內(nèi)容物，并通過高通量測序檢測盲腸中微生物組成。結(jié)果表明，與A組相比較，B組和C組黔東南小香雞腸道微生物可操作分類單元（OTUs）數(shù)量均有所增加，特有OTUs數(shù)量分別增加35. 36%、3.31%。各處理間Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均無差異顯著性；B組Chaol指數(shù)有所增加，但與A組差異不顯著，c組Chaol指數(shù)較A組顯著增加（P＜0.05）；c組ACE指數(shù)顯著高于A組和B組：B、C組Phocaeicola屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和吉米菌屬（Gemmiger）相對(duì)豐度均有所增加，勞森菌屬（Lawsonibacter）相對(duì)豐度降低。線性判別分析（LEfSe）得到的標(biāo)記性物種A組有10個(gè)，B組11個(gè)，C組5個(gè)。綜上，本試驗(yàn)條件下，基礎(chǔ)飼糧中分別添加20%白三葉草和20%光葉紫花苕可改變黔東南小香雞腸道微生物區(qū)系組成，提高細(xì)菌群落豐富度，增加Phocaeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對(duì)豐度，進(jìn)而促進(jìn)雞腸道健康。

關(guān)鍵詞：黔東南小香雞；牧草；高通量測序；腸道微生物

中圖分類號(hào)：S831.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025） 03-0102-06

貴州屬于典型的山區(qū)省份，山地和丘陵面積占總面積的92.5%，特色農(nóng)業(yè)發(fā)展具有巨大潛力和廣闊前景。近年來，貴州大力發(fā)展特色優(yōu)勢農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，推動(dòng)現(xiàn)代山地特色高效農(nóng)業(yè)快速發(fā)展，林下生態(tài)養(yǎng)雞已成為貴州生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)中的重點(diǎn)發(fā)展板塊。為開拓貴州喀斯特地區(qū)的可利用資源，林草優(yōu)化配置已成為林下生態(tài)養(yǎng)殖中不可替代的角色。林下雞養(yǎng)殖是一種立體生態(tài)養(yǎng)殖模式，該模式充分利用林下資源，實(shí)現(xiàn)生態(tài)種養(yǎng)循環(huán)，其產(chǎn)出的綠色健康的肉蛋產(chǎn)品已形成相對(duì)穩(wěn)定的市場，滿足了人們對(duì)高肉蛋品質(zhì)的追求，兼顧生態(tài)效應(yīng)與生產(chǎn)效益。黔東南小香雞為我國稀有優(yōu)良小型地方雞種，屬貴州省地方保護(hù)品種資源之一，主產(chǎn)于貴州省榕江、從江和黎平縣。黔東南州氣候溫和、雨量充足、植被覆蓋率高，為發(fā)展林下養(yǎng)殖提供了良好的生態(tài)環(huán)境。黔東南小香雞于1985年編入《貴州省畜禽品種志》，具有耐粗飼、覓食力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值與藥用功效，具有良好的發(fā)展前景和巨大的市場潛力。由于飼養(yǎng)管理粗放，林下養(yǎng)雞普遍存在飼養(yǎng)生產(chǎn)周期較長、飼料需求量較大、飼養(yǎng)成本高等問題，將牧草應(yīng)用于家禽飼糧中部分取代精飼料，是解決這一問題的可行方法。因此，開辟質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的牧草飼料原料，緩解生態(tài)家禽養(yǎng)殖中飼料原料緊缺等問題，降低飼養(yǎng)成本，生產(chǎn)安全、綠色、健康禽產(chǎn)品成為生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題。

白三葉草具有高蛋白、低纖維、易消化、適口性好等特點(diǎn)，還含有多種活性成分，可調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道功能，增強(qiáng)免疫力，有效預(yù)防便秘，因此成為畜禽養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)牧草。光葉紫花苕具有莖汁柔嫩、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富而全面等特點(diǎn)，是反芻動(dòng)物、豬、雞等畜禽的理想飼料蛋白原料。目前，對(duì)白三葉草和光葉紫花苕的研究多集中在種植模式、飼喂評(píng)價(jià)方面，對(duì)畜禽腸道微生物菌群的影響研究較少。本研究以黔東南小香雞為試驗(yàn)對(duì)象，探究在基礎(chǔ)飼糧中添加高蛋白牧草白三葉草和光葉紫花苕對(duì)其盲腸微生物菌群的影響，以期為白三葉草和光葉紫花苕作為黔東南小香雞飼糧添加牧草的科學(xué)飼喂提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

光葉紫花苕、白三葉草草種分別購于貴州省草業(yè)研究所、貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站，由養(yǎng)殖戶種植、采挖、飼喂。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取體重相近、健康無病的60日齡黔東南小香雞180只，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20只。A組飼喂基礎(chǔ)飼糧，B組和C組分別在基礎(chǔ)飼糧干物質(zhì)基礎(chǔ)上添加20%白三葉草、20%光葉紫花苕。試驗(yàn)期共6ld（2023年6月10日-8月9日），其中預(yù)飼期5d，正式試驗(yàn)期56 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在從江縣兩料村的養(yǎng)殖場進(jìn)行，飼料購自臨桂漓源糧油飼料有限責(zé)任公司，飼料主要營養(yǎng)水平如表1所示。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)雞每日上午8：00和下午17：00進(jìn)食，自由飲水，白天在林間固定區(qū)域內(nèi)自由活動(dòng)，晚上集中歸巢。

1.4 樣品采集及腸道微生物菌群測定

無菌操作收集各試驗(yàn)組雞盲腸糞便，置于液氮保存。按照DAN提取試劑盒（OMEGA SoilDNA Kit M5635 - 02）說明書提取所有樣品總DNA，分別使用Nanodrop 2000和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和完整性。以質(zhì)量合格的DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)特異性引物338F（5＇- ACTCCTACGGGAGGCAG-CA-3＇），806R（5＇- GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3＇）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：2×Phan-to Max Master Mix 25μL，引物338F和806R各2μL，DNA模板30μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min：94℃變性30 S，55℃退火45 S，72℃延伸45 S，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。使用Agilent High Sensitivity DNA Kit對(duì)文庫進(jìn)行質(zhì)檢，合格的文庫由上海派森諾生物科技股份有限公司采用Illumina NovaSeq高通量測序平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用fastp軟件對(duì)質(zhì)控前和質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Kraken2算法與Kaiju軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。基于OTUs聚類結(jié)果，利用Qiime軟件進(jìn)行樣本復(fù)雜度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接質(zhì)控與OTUs聚類分析

經(jīng)Illumina NovaSeq測序分析得到A、B、C組雞腸道微生物平均原始序列分別為44 212 875、48 720 347條和44 151 582條，有效序列分別為43 673 620、48 123 073條和43 589 725條，目標(biāo)序列分別為42 985 091、47 802 538條和43 443 359條。由圖l可見，A、B、C組聚類OTUs數(shù)分別為1 868、2 001個(gè)和1 905個(gè)，特有OTUs的數(shù)量表現(xiàn)為B＞C＞A，B、C組較A組分別增加36.36%、3.31%，3個(gè)組共有OTUs數(shù)為1 495個(gè)。說明飼喂白三葉草和光葉紫花苕可調(diào)節(jié)黔東南小香雞腸道微生物豐度。

2.2 不同牧草對(duì)黔東南小香雞腸道菌群Alpha多樣性的影響

隨著測序深度和樣本序列數(shù)量不斷增加，OTUs數(shù)量逐漸趨于平緩，說明樣本量充足，測序數(shù)據(jù)合理，能夠較好地反映各試驗(yàn)組菌群信息（圖2）。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)反映樣本中細(xì)菌群落物種多樣性，值越大說明群落物種多樣性越豐富：Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣本中細(xì)菌群落物種豐富度，值越大說明群落中物種總數(shù)越多。由表2可見，各處理組Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均無顯著差異；與A組相比較，B組Chaol指數(shù)有所增加，但差異不顯著，C組Chaol指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；C組ACE指數(shù)顯著高于A組和B組。

2.3 不同牧草對(duì)黔東南小香雞腸道菌群Beta多樣性的影響

PCoA分析可直觀體現(xiàn)樣本內(nèi)或樣本間的差異，在坐標(biāo)軸上的投影距離越近，表明樣本在相應(yīng)維度中的群落組成越相似。對(duì)各組黔東南小香雞腸道內(nèi)容物菌群多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果（圖3）顯示，第1個(gè)主坐標(biāo)軸和第2個(gè)主坐標(biāo)軸分別解釋數(shù)據(jù)22.7%和15.9%的方差。A組和C組間的投影距離較近，B組與A組節(jié)點(diǎn)之間的距離較長，說明這3種飼喂模式下黔東南小香雞腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.4 不同牧草對(duì)黔東南小香雞腸道菌群相對(duì)豐度的影響

由表3可見，在門水平上，各組黔東南小香雞盲腸中優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota），其中厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度較高，占微生物總量的83 070以上。與A組相比，B組厚壁菌門相對(duì)豐度增加2.85%，C組則降低6.79%：B、C組擬桿菌門相對(duì)豐度分別增加8.03%和14.35%;B、C組擬桿菌門／厚壁菌門比值分別較較A組增加5.04%、22. 68%。對(duì)相對(duì)豐度排名前10的屬進(jìn)行分析可知，屬水平上的優(yōu)勢物種為Phocaeicola屬和擬桿菌屬（Bacteroides）；與A組相比，B、C組Phocaeicola屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和吉米菌屬（Gemmiger）相對(duì)豐度均有所增加，勞森菌屬（Lawsonibacter）的相對(duì)豐度降低。說明飼糧添加不同牧草可調(diào)節(jié)黔東南小香雞腸道微生物菌群相對(duì)豐度。

2.5 不同處理黔東南小香雞腸道菌群LEfSe分析

由LEfSe篩選結(jié)果（圖4）可見，在LDA值＞4水平上，共發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌群結(jié)構(gòu)有差異。A組中有10個(gè)標(biāo)記性物種，隸屬于1個(gè)綱、2個(gè)目、2個(gè)科、2個(gè)屬和3個(gè)種，以密螺旋體目（Treponematales）、密螺旋體科（Treponemataceae）和密螺旋體屬（Treponema_F）為主；B組中有II個(gè)標(biāo)記性物種，隸屬于1個(gè)門、1個(gè)綱、1個(gè)目、2個(gè)科、2個(gè)屬和4個(gè)種，以文肯菌科（Rikenellaceae）、另枝菌屬（Al-istipes）、彎曲菌門（Campylobacterota）為主；C組中有5個(gè)標(biāo)記性物種，隸屬于1個(gè)屬和4個(gè)種，以Merdivivens sp.、Bacteroides intestinipullorum 和Li-m2soma faecipullorum為主。以上結(jié)果說明，飼喂白三葉草和光葉紫花苕可明顯改變黔東南小香雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，并改變特征微生物種類。

3 討論與結(jié)論

隨著我國家禽業(yè)向著產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化方向快速發(fā)展，環(huán)境約束、抗生素耐藥性、人畜爭糧等問題日益突出。飼料支出作為畜禽生產(chǎn)過程中最主要成本之一，其價(jià)格直接影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。隨著節(jié)糧型畜牧業(yè)發(fā)展實(shí)施需要和貴州林下經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展力度的提高，選擇牧草替代部分精飼料飼喂家禽對(duì)實(shí)現(xiàn)生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。貴州省適宜的氣候條件使得牧草資源豐富。優(yōu)質(zhì)的飼料牧草蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富。以草養(yǎng)禽實(shí)現(xiàn)循環(huán)養(yǎng)殖，不僅可提高資源利用率，還可以保護(hù)環(huán)境。用牧草替代部分精飼料，不僅可以降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，而且能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的禽產(chǎn)品。同時(shí)，通過篩選綠原酸等生物活性物質(zhì)含量高的牧草，提高家禽生長性能、免疫力和抗氧化能力，調(diào)節(jié)腸道微生物多樣性和豐富度，增強(qiáng)胃腸道功能，可有效預(yù)防胃腸道疾病。王霞霞在核桃林下種植白三葉草、黑麥草和鴨茅草不同組合養(yǎng)雞可改善雞的生長性能和屠宰性能，增加草地生長能力和恢復(fù)能力。

白三葉草為豆科多年生草本植物，具有易種植、利用年限長、營養(yǎng)豐富、適口性好等特點(diǎn)，其主要營養(yǎng)物質(zhì)為維生素和植物蛋白。研究表明，白三葉草初花期和開花期粗蛋白含量較高，可達(dá)24%以上，是各種畜禽的優(yōu)質(zhì)青綠飼料。鄒建華研究發(fā)現(xiàn)，在育肥豬基礎(chǔ)飼料中添加20%的白三葉草粉可增加豬肉中的粗蛋白含量，改善豬肉品質(zhì)：譚劍蓉等通過添加40%的白三葉草粉可顯著提高肉兔血液IgM、IgA及IgG水平，料重比較對(duì)照組降低5.15%。林下放養(yǎng)模式下在飼料中添加白三葉草對(duì)興義矮腳雞生長性能有顯著性影響，其中80%白三葉草+20%黑麥草效果最好。光葉紫花苕為一年生或越年生草本植物，產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)，含有豐富的氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)及多種黃酮類成分，營養(yǎng)價(jià)值高并具有一定的藥理活性，是牛、羊、豬、兔、禽等動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)飼料。育肥豬日糧中添加20%的光葉紫花苕草粉代替精料，可使料肉比降低13. 16%，瘦肉率提高3.21%。在肉雞飼料中添加10%～15%的光葉紫花苕草粉，飼料利用率提高14.3%，肉雞每千克增重飼料成本降低18.46%。

本研究表明，添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后黔東南小香雞腸道微生物OTUs數(shù)量均有所增加，特有OTUs數(shù)量分別增加35.36%、3.31%：添加200-/0的白三葉草Chaol指數(shù)有所增加，但與對(duì)照組差異不顯著，添加20%的光葉紫花苕Chaol指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。說明添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后黔東南小香雞腸道中細(xì)菌物種數(shù)增加。厚壁菌門和擬桿菌門廣泛存在于動(dòng)物的腸道中，厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發(fā)酵，是主要的纖維素分解菌，而擬桿菌門是主要的多糖降解利用菌，兩者共同促進(jìn)宿主消化一些自身無法消化的食物，提高宿主對(duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)的利用率，二者的平衡對(duì)維持宿主腸道微生態(tài)的穩(wěn)定及宿主的健康有重要的作用。本研究中，黔東南小香雞腸道中厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度最高，占微生物總量的83%以上，添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后擬桿菌門相對(duì)豐度分別增加8.03%、和14. 35%，白三葉草組厚壁菌門相對(duì)豐度增加2.85%，兩個(gè)試驗(yàn)組擬桿菌門／厚壁菌門比值分別增加5.04%和22.68%，促進(jìn)小香雞對(duì)飼料的消化與吸收，進(jìn)而提高其生產(chǎn)性能。在屬水平上，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Phocaeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等相對(duì)豐度有所增加。Phocaeicola屬是人與動(dòng)物腸道中的一類共生菌，參與腸道免疫調(diào)節(jié)、維持屏障功能等，是維持動(dòng)物機(jī)體健康的益生菌；擬桿菌屬在腸道中為有益菌，在含氮物質(zhì)利用、膽汁酸及其他類固醇等生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，在維持宿主腸道健康及提高宿主對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收方面有重要作用：普雷沃氏菌屬是具有降解蛋白質(zhì)功能數(shù)量最多的微生物，可分泌多種酶，以提高肉、蛋等的蛋白質(zhì)含量。說明添加牧草可通過提高腸道Phocaeico-la屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對(duì)豐度促進(jìn)黔東南小香雞腸道健康。LEfSe分析結(jié)果得到A組有標(biāo)記性物種10個(gè)，B組11個(gè)，C組5個(gè)，表明飼喂不同牧草可明顯改變黔東南小香雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，并改變特征微生物屬。

綜上所述，飼糧中分別添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕均可調(diào)節(jié)黔東南小香雞腸道微生物豐度，提高物種多樣性，增加腸道Pho-caeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對(duì)豐度，促進(jìn)雞腸道健康。

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目“從江小香雞林下生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖技術(shù)集成及示范”（黔科合支撐[2021]001）、“生態(tài)家禽養(yǎng) 殖全程質(zhì)量安全追溯監(jiān)測研究”（黔科合支撐[2023]一般039）；貴州省生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目“飼料與營養(yǎng)功能實(shí)驗(yàn)室”（黔禽科發(fā)[2017]01號(hào)）