三種花色黃芩花青素合成酶基因(ANS)的克隆及表達(dá)分析

摘要：花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）在花青素合成途徑中將無色花青素催化合成有色花青素。本研究通過RT-PCR方法，從藍(lán)紫花、玫紅花、白花黃芩中克隆得到ANS基因的全長cDNA序列，分別命名為SbANS-b、SbANS-r、SbANS-w。經(jīng)序列比對，SbANS-b、SbANS-r和SbANS-w在第16、194、242、331、875、945、947 bp處存在堿基差異，其編碼的SbANS-B、SbANS-R和SbANS-W蛋白存在3個(gè)氨基酸差異。生物信息學(xué)分析顯示，三個(gè)SbANS蛋白均屬于無色花青素雙加氧酶樣蛋白超家族，定位在細(xì)胞質(zhì)中，具有典型20G-Fe Il_Oxy蛋白保守結(jié)構(gòu)域，還含有DHQ-2結(jié)合位點(diǎn)、MES/抗壞血酸結(jié)合位點(diǎn)、鐵離子結(jié)合位點(diǎn)、20G結(jié)合位點(diǎn)、DHQ-1結(jié)合位點(diǎn)等。ANS系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，黃芩與芡歐鼠尾草的ANS聚在一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，與大豆、擬南芥等物種的ANS親緣關(guān)系次之?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示，SbANS基因在藍(lán)紫花黃芩中整體表達(dá)水平最高。隨著花的發(fā)育，藍(lán)紫花黃芩SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，玫紅花黃芩SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，白花黃芩SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。藍(lán)紫花和玫紅花黃芩各花發(fā)育階段間SbANS的表達(dá)量差異極顯著。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究不同花色黃芩中SbANS基因功能差異、揭示黃芩花色變異的分子機(jī)理提供重要指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：黃芩；花色；花青素合成酶；基因克隆；表達(dá)分析

中圖分類號：S567.239：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0019-08

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）屬于唇形科黃芩屬植物，多以根入藥。現(xiàn)代臨床研究表明，黃芩具有抗腫瘤、抗菌、抑制心腦血管疾病、抗氧化及抗炎等作用。黃芩與其他中藥聯(lián)合使用可用于多種疾病的臨床治療，如：黃芩與蒲公英聯(lián)用可以治療扁桃體發(fā)炎、肺炎：黃芩與連翹聯(lián)用能夠消腫止痛，清熱瀉火：黃芩與穿心蓮聯(lián)用可以治療瘡癤膿瘍，皮膚化膿性感染；黃芩與甘草、白芍聯(lián)用可以治療腹瀉、腸胃積熱。

世界上共有360種唇形科黃芩屬植物，其中中國有98種及48個(gè)變種，在黃芩種內(nèi)也出現(xiàn)了不同花色的變異。花瓣主要呈色物質(zhì)為花青素，花青素屬于黃酮類化合物，植物中花青素的合成共分為三步：①以丙二酰輔酶A和對香豆酰輔酶A為前體，經(jīng)過查爾酮合酶（CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的催化合成二氫山奈酚（DHK）；②DHK被類黃酮3’-羥化酶（F3'H）羥基化以產(chǎn)生二氫槲皮素（DHQ）或被類黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）羥基化以產(chǎn)生二氫楊梅素（DHM）；③二氫黃酮醇還原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）將無色二氫黃酮醇（DHK、DHQ和DHM）催化生成呈色的花青素類物質(zhì)。其中ANS作為花青素合成的最后一步關(guān)鍵酶，能夠催化無色花青素合成有色花青素。有報(bào)道指出，ANS基因的突變是導(dǎo)致樹莓黃果表型的原因。目前，已在黑加侖、洋蔥、油菜、東方百合、藍(lán)莓等植物中克隆到ANS基因。但關(guān)于黃芩ANS基因的研究尚未見報(bào)道。

藍(lán)紫色是黃芩常見的花色，山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所前期篩選得到了玫紅花和白花的黃芩變異材料，并通過花青素生物合成的代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析得到了參與黃芩花顏色分化的關(guān)鍵候選基因ANS。本研究利用RT -PCR（reverse transcription PCR）技術(shù)從三種花色黃芩的花中克隆得到SbANS基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用qRT-PCR（real-time quantita-tive PCR）技術(shù)分析SbANS基因在不同花色黃芩不同花發(fā)育階段的表達(dá)模式，以期為研究黃芩花色變異原理奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步運(yùn)用分子育種技術(shù)改良黃芩品質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用黃芩材料均種植于山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所（下稱本單位）苗圃內(nèi)，將花期劃分為三個(gè)發(fā)育階段，即F1幼蕾期、F2中蕾期、F3盛花期（花期狀態(tài)參考文獻(xiàn)[12]），于2023年6月分別采集藍(lán)紫花（SB）、玫紅花（SR）、白花（SW）黃芩三個(gè)時(shí)期的花材料，置于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SbANS基因克隆

通過Primer Primier 5.0軟件，以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的SbANS基因序列為模板設(shè)計(jì)SbANS基因全長引物（表1）。分別提取3種花色黃芩花的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PCR試劑盒（寶生物）說明書配制PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 0C預(yù)變性5 min;95℃30 s，52℃30 s，72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

利用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用天根生化科技（北京）有限公司的膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段連接到pMD18-T載體（寶生物）后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，通過菌液PCR檢測，將陽性單克隆送至北京擎科生物科技股份有限公司測序。

1.3 SbANS基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件對克隆得到的SbANS序列進(jìn)行核苷酸比對；采用ORF（開放閱讀框）在線分析工具ORF finder預(yù)測SbANS的ORF，并利用Gene Tool軟件將ORF翻譯成氨基酸序列：利用DNAMAN軟件對SbANS蛋白進(jìn)行氨基酸比對。利用ExPASy網(wǎng)站（https：//web. expasy. org/prot-param/）的在線分析軟件進(jìn)行SbANS蛋白的理化性質(zhì)分析。

利用SOPMA、NCBI的CD - search功能、TM-HMM、SignalP 5.0、NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0等在線工具分別預(yù)測SbANS的二級結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽、磷酸化位點(diǎn)、0型和N型糖基化位點(diǎn)；用Plant - mPLoc和SWISS - MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/）對SbANS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位和同源建模分析。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行ANS蛋白多重序列比對，通過ClustalX和MEGA 6.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）對不同物種ANS構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 RNA提取及SbANS基因表達(dá)分析

根據(jù)RNA提取試劑盒（天根）方法分別提取三種花色黃芩不同發(fā)育階段花的總RNA，通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SbANS基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），并通過TBtools軟件檢測引物特異性。以黃芩18SrRNA為內(nèi)參基因，以稀釋5倍的cDNA作為熒光定量PCR（qRT-PCR）的模板，根據(jù)實(shí)時(shí)定量試劑盒（寶生物）的方法進(jìn)行基因表達(dá)分析。每種模板均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，每種花色的3個(gè)花期都設(shè)計(jì)3次生物學(xué)重復(fù)。用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbANS基因的克隆

以三種花色黃芩花cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。經(jīng)單克隆測序，三種花色黃芩的SbANS基因cDNA全長均為1137 bp，分別命名為SbANS-6、SbANS -r、SbANS-w，三者在第16、194、242、33 1、875、945、947 bp處存在堿基差異（圖2），這與本單位前期的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

2.2 SbANS理化性質(zhì)

Gene Tool軟件預(yù)測結(jié)果顯示SbANS -b、SbANS-r、SbFANS -w均編碼377個(gè)氨基酸，且SbANS-B、SbANS-R、SbANS-W蛋白的第6、111、316位氨基酸存在差異（圖3）。理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明，SbFANS-B、SbANS-R、SbANS -W蛋白分子量分別為43.16、43.19、43.13 kDa，理論等電點(diǎn)分別為5.92、6.08、5.92，平均親水系數(shù)均為負(fù)值，說明這三個(gè)蛋白均為親水性蛋白：Sb-FANS-B、SbANS -R、SbANS -W蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)分別為40. 39、41. 09、39. 66，說明白花黃芩的ANS蛋白與藍(lán)紫花和玫紅花黃芩相比更為穩(wěn)定。

2.3 SbANS蛋白結(jié)構(gòu)分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表3）顯示，SbANS -B、SbANS-R、SbANS-W均由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角組成，但各組分比例存在差異，均以無規(guī)則卷曲占比最高，其次為α-螺旋。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，SbANS蛋白屬于無色花青素雙加氧酶樣蛋白超家族，含有異青霉素N合成酶及其相關(guān)的雙加氧酶保守結(jié)構(gòu)域和2-氧戊二酸/Fe（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的蛋白質(zhì)N-末端高度保守區(qū)域（圖4）。

跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，SbANS蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，不含信號肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示三個(gè)蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)中。

SbANS蛋白磷酸化預(yù)測結(jié)果（圖5a、b）顯不，SbANS-B/R存在19個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）、6個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)，SbANS-W存在20個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）、6個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果表明，SbANS-B、SbANS-R和SbANS-W均含有3個(gè)N型糖基化位點(diǎn)（圖Sc）及6個(gè)0型糖基化位點(diǎn)。

同源建模結(jié)果{圖6）顯示，SbANS的蛋白模型與松蒿（Phtheirospermum japonicum） AOA830C745.I.A Pro-tein的一致性較高，序列一致性為75. 35070，模型質(zhì)量評估（GMQE）值為0.87，模型可信度較高。

2.4 SbANS蛋白多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

將SbANS-B、SbANS-W、SbANS-R蛋白與相近物種同源蛋白序列進(jìn)行多重比對分析，結(jié)果（圖7）顯示，SbANS具有20G-FeⅡ_Oxy蛋白保守結(jié)構(gòu)域，還含有DHQ-2結(jié)合位點(diǎn)、MES/抗壞血酸結(jié)合位點(diǎn)、鐵離子結(jié)合位點(diǎn)、20G結(jié)合位點(diǎn)、DHQ-1結(jié)合位點(diǎn)。

基于ANS蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖8），黃芩與同為唇形科的芡歐鼠尾草親緣關(guān)系最近，與大豆、擬南芥等物種的親緣關(guān)系次之。

2.5 SbANS基因不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

對藍(lán)紫花、玫紅花和白花黃芩不同發(fā)育階段花中ANS基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以藍(lán)紫花F1時(shí)期的表達(dá)量為對照，結(jié)果（圖9）顯示，在花發(fā)育過程中，藍(lán)紫花黃芩的SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在F1幼蕾時(shí)期表達(dá)量最高，其次是F3盛花期，F(xiàn)2中蕾期表達(dá)量最低：玫紅花黃芩的SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，在F3盛花期表達(dá)量達(dá)到最高：白花黃芩的SbANS基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，F(xiàn)2中蕾期的表達(dá)量最高，其次是F3盛花期，F(xiàn)1幼蕾期的表達(dá)量最低。藍(lán)紫花和玫紅花黃芩ANS表達(dá)量在不同花發(fā)育階段間差異極顯著，白花黃芩ANS基因只在F1和F2階段間差異極顯著。不同材料間比較，藍(lán)紫花黃芩各發(fā)育階段花中的SbANS基因表達(dá)量最高。

ANS是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，作為花青素合成最后一步的關(guān)鍵酶，能夠催化無色花青素合成有色花青素。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR方法克隆獲得三種花色黃芩ANS基因全長1137 bp的cDNA序列。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，SbANS-b、SbFANS-r和SbANS -w在第16、194、242、331、875、945、947 bp處存在堿基差異。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，三個(gè)SbANS蛋白均屬于無色花青素雙加氧酶樣蛋白超家族，不含有跨膜結(jié)構(gòu)，定位在細(xì)胞質(zhì)中，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，不含信號肽，與之前報(bào)道的ANS蛋白分析結(jié)果一致：SbANS-B和SbANS -R均存在19個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）、6個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)，而SbANS-W存在20個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）、6個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。

三種花色黃芩不同發(fā)育階段花中SbANS基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，SbANS基因在花發(fā)育過程中的表達(dá)量變化因花色而異，在藍(lán)紫色花中表現(xiàn)為先降低后升高，在玫紅花中表現(xiàn)為逐漸升高，而在白花中表現(xiàn)為先升高后降低：不同花色間比較，白花和玫紅花的SbANS基因表達(dá)量明顯低于藍(lán)紫花。

綜合本研究結(jié)果，藍(lán)紫花、玫紅花和白花黃芩的SbANS基因存在堿基差異，導(dǎo)致其氨基酸序列存在差異，推測這可能導(dǎo)致三種花色黃芩ANS蛋白功能差異，進(jìn)而使其呈現(xiàn)出不同的花色。另外，白花黃芩與藍(lán)紫花、玫紅花黃芩ANS蛋白的磷酸化位點(diǎn)存在差異，而蛋白磷酸化在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性中起到重要作用，因此推測ANS蛋白磷酸化位點(diǎn)的差異也可能是導(dǎo)致黃芩呈現(xiàn)不同花色的原因之一。玫紅花和白花中SbANS基因的表達(dá)量明顯低于藍(lán)紫花，可能是玫紅花和白花中花青素含量低的緣故。SbANS基因在黃芩花發(fā)育過程中的表達(dá)變化因花色不同而不同，推測SbANS基因的表達(dá)可能還受其他轉(zhuǎn)錄因子或外界環(huán)境的影響，具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究不同花色黃芩中SbANS基因功能差異、揭示黃芩花色變異的分子機(jī)理提供一定的研究基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（Q-2022083）；山東省中醫(yī)藥研究院科研孵化基金項(xiàng)目（2022SACM-4）；國家中醫(yī)藥管理 局中藥資源保障能力提升工程項(xiàng)目（E2023]19號）；中央本級重大增減支項(xiàng)目（2060302）；山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2022TSGC1059，2023TSGC0444）；濟(jì)南市農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CX202112）