西瓜AUX／LAX基因的鑒定及在芽再生過程中的表達(dá)分析

摘要：生長(zhǎng)素是最重要的植物激素之一，生長(zhǎng)素內(nèi)流載體AUX/LAX（AUXIN RESISTENT1/LIKE AUX1）與多膜跨越蛋白和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，參與生長(zhǎng)素的主動(dòng)運(yùn)輸過程。AUX/LAX基因已在多個(gè)物種中被鑒定，被發(fā)現(xiàn)在植物多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮非常重要的作用，但在西瓜中還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究在全基因組水平對(duì)西瓜AUX/LAX基因進(jìn)行鑒定，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、啟動(dòng)子順式調(diào)控元件等進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從西瓜全基因組中鑒定到5個(gè)AUX/LAX基因，都含有保守的Aa_trans結(jié)構(gòu)域；對(duì)西瓜與擬南芥、水稻、黃瓜的21個(gè)AUX/LAX蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，它們被聚為兩個(gè)亞族，而絕大多數(shù)西瓜與黃瓜的AUX/LAX蛋白存在一對(duì)一同源關(guān)系；從西瓜AUX/LAX基因啟動(dòng)子上鑒定到脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element），以及赤霉素等激素和厭氧誘導(dǎo)、低溫、干旱等防御和非生物脅迫響應(yīng)元件。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析發(fā)現(xiàn)，除了ClAUX/LAX4，其他ClAUX/LAXs均在雄花中的表達(dá)水平最低，具有顯著的組織特異性：而且西瓜AUX/LAXs基因在分化能力不同的西瓜材料中的表達(dá)各不相同，其中ClAUX/LAX5在分化Sd的高再生材料中的表達(dá)水平顯著高于低再生材料，暗示其可能在西瓜芽再生過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究生長(zhǎng)素在西瓜芽再生過程中的作用提供證據(jù)，并為挖掘西瓜芽再生調(diào)控基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)載體；AUX/LAX基因；西瓜；芽再生過程；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S651： Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025） 03-0001-09

生長(zhǎng)素作為最重要的植物激素之一，參與調(diào)節(jié)植物的頂端優(yōu)勢(shì)、向光性、向地性、花序和葉片發(fā)育、側(cè)根和不定根形成、維管組織分化及果實(shí)成熟等過程。生長(zhǎng)素通過建立濃度梯度影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，其濃度梯度是由其合成、代謝、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等共同決定的。生長(zhǎng)素在植物的活性部位，如莖尖、頂芽、幼葉、發(fā)育中的種子、主根尖分生組織和發(fā)育中的側(cè)根中合成，然后通過莖維管組織中的大量流動(dòng)以非極性自由擴(kuò)散的方式或通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至遠(yuǎn)端目標(biāo)組織。生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)載體參與了生長(zhǎng)素的主動(dòng)運(yùn)輸過程，這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要包括AUXIN RESIS-TENTI/LIKE AUXI（AUX/LAX）內(nèi)流載體、PIN -FORMED （PIN）外排載體和ATP結(jié)合盒B/P -糖蛋白／多藥耐藥（ABCB/MDR/PGP）外排／狀態(tài)載體。其中，AUX/LAX與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，是氨基酸／生長(zhǎng)素滲透酶超家族中植物特有的亞類。

研究發(fā)現(xiàn)，AUX/LAX基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮非常重要的作用。在擬南芥中，AUX/LAX包括AUX1、LAX1、LAX2和LAX3四個(gè)成員，盡管它們?cè)谛蛄泻蜕δ苌细叨缺Ｊ?，但每個(gè)成員都表現(xiàn)出不同的時(shí)空表達(dá)模式，并在各種發(fā)育過程中獨(dú)立或聯(lián)合起作用。AUX1是AUX/LAX家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，其突變會(huì)導(dǎo)致根系向地性的顯著喪失：此外，AUX1不對(duì)稱地存在于根韌皮部細(xì)胞的質(zhì)膜中，促進(jìn)生長(zhǎng)素從根向頂部和底部的運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)根毛生長(zhǎng)。AtLAX3和AtAUX1通過調(diào)節(jié)側(cè)根原基的萌發(fā)和起始來協(xié)調(diào)側(cè)根的發(fā)育。LAX2參與葉脈形成和木質(zhì)部發(fā)育。在水稻基因組中鑒定到5個(gè)高度保守的AUX/LAX成員，分別是OsAUX1、Os-AUX2、OsAUX3、OsAUX4和OsAUX5，其中Os-AUX1和OsA UX3主要調(diào)節(jié)根的發(fā)育。在番茄中共鑒定出5個(gè)SlLAX基因，除了SlLAX3以外，其余SlAUX/LAX基因在番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間的表達(dá)量比成熟時(shí)高。黃瓜CsLAX2將細(xì)胞外生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)的凸側(cè)，從而控制黃瓜果實(shí)彎曲。除了上述功能外，AUX/LAX基因還參與植物的種子萌發(fā)、不定根和雌性配子體發(fā)育等過程。

西瓜（Citrullus lanatus）是炎炎夏日里的解暑水果之一，富含多種維生素，可起到調(diào)節(jié)心臟功能和平衡血壓的作用。然而，在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，西瓜易受不同病害和逆境脅迫的危害，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量下降。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于培育抗逆作物品種中，然而，有些西瓜品種的芽分化能力低下，進(jìn)而導(dǎo)致其遺傳轉(zhuǎn)化效率較低。研究證實(shí)，AUX/LAX基因在植物芽再生過程中發(fā)揮著十分重要的作用。目前已經(jīng)在擬南芥、水稻、番茄等物種中鑒定了AUX/LAX基因，但西瓜AUX/LAX基因的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究在全基因組水平對(duì)西瓜AUX/LAX基因進(jìn)行鑒定，并從基因數(shù)量、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式調(diào)控元件、時(shí)空表達(dá)模式等方面進(jìn)行分析，同時(shí)利用浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所西瓜甜瓜育種研究室前期篩選獲得的再生能力不同的兩份西瓜材料，探索ClAUX/LAXs基因在芽再生過程中的表達(dá)模式，以期為將來進(jìn)一步開展ClAUX/LAXs的功能和調(diào)控機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理和樣品采集

2023年6月從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)安基地分別采集再生能力強(qiáng)（RC）和弱（NRC）的兩份西瓜材料的種子，用濃度為20%的NaClO溶液消毒30 min，期間不斷用鑷子攪拌：用無(wú)菌水清洗4次，每次5 min，用濾紙吸干表面多余水分后置于1/2 MS培養(yǎng)基上，30℃催芽36 h后轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)12 h：待子葉微張開時(shí)切下子葉中段，置于MS培養(yǎng)基的無(wú)菌濾紙上暗培養(yǎng)，4d后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基（含有2 mg/L玉米素和300 mg/L特美汀的MS培養(yǎng)基）上進(jìn)行分化誘導(dǎo)，分別在分化Sd和10 d取愈傷組織。將西瓜幼苗置于30℃光照16 h、25℃黑暗8h的條件下生長(zhǎng)至4周大，然后分別取其根、莖、葉、雄花、雌花和授粉后3d的果實(shí)，每種樣品3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少10株幼苗。所有樣品采集后立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室并保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)ClAUX/LAX基因的表達(dá)分析。

1.2 西瓜AUX/LAX基因的鑒定

從The Arabidopsis Information Resource（TAIR）10和Rice Genome Annotation Project數(shù)據(jù)庫(kù)分別下載擬南芥和水稻的AUX/LAX蛋白序列，并在CuGenDBv2（http：//cucurbitgenomics. org/）進(jìn)行BLASTP檢索，初步篩選出西瓜AUX/LAX家族的候選成員，同時(shí)利用HMM軟件檢索西瓜AUX/LAX，結(jié)合兩種方法獲取的候選蛋白，去掉冗余后使用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析（E值為1.08）候選序列以確認(rèn)MFS-2（PF13347.6）結(jié)構(gòu)域的存在，過濾掉沒有MFS-2結(jié)構(gòu)域的候選蛋白。

1.3 西瓜AUX/LAX基因家族的系統(tǒng)發(fā)育、保守基序和理化性質(zhì)分析

利用ClustalW對(duì)擬南芥、水稻、黃瓜和西瓜的AUX/LAX蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA X（10.0.1版本）采用鄰接法（1 000次置信值）構(gòu)建。為了分析基因結(jié)構(gòu)，使用基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（GSDS）在線程序（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）將ClAUX/LAXs基因的編碼序列（CDS）與其對(duì)應(yīng)的基因組序列（DNA）進(jìn)行比較。利用ExPASy ProtParam（http：//www. expasy. org/proteomics）網(wǎng)站分析CIAUX/LAXs的理化參數(shù)，包括蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)（pI）等。使用Multiple Em for Motif Elicitation（MEME）（ht-tps：//meme-suite. org/tools/meme）分析CIAUX/LAXs蛋白的保守基序，基序數(shù)目設(shè)置為5個(gè)。利用ProtCompv9.0（http：//linuxl. sofberry. com/berry.phtml？topic=protcompplamp;group=programsamp;subgroup=proloc）預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4 ClAUX/LAXs啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用ClAUX/LAXs基因的ID號(hào)在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CuGenDBv2中下載這些基因起始密碼子（ATG）上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，并提交到PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行順式作用元件分析。利用TBtools軟件制圖。

1.5 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用RNA Easy Fast植物組織RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取西瓜總RNA。按照操作說明書，使用FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于RT - qPCR分析。所用引物序列見表1。RT-qPCR分析在BioRad CFX96實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行，使用試劑為GoTaq Green Master Mix（Pro-mega，北京）。PCR體系包括TOROGreenqPCRMaster Mix 10μL，primer-F 0.8μL， primer-R 0.8μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.4μL。程序設(shè)置為：預(yù)變性9 5℃3 min；9 5℃變性10s，5 5℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)：熔解曲線設(shè)定為95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。選用西瓜Actin基因（ClActin）作為內(nèi)參基因，進(jìn)行3次生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)，用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。柱狀圖用Mi-crosoft Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜AUX/LAX家族基因的鑒定

本研究從西瓜基因組中篩選并鑒定出5個(gè)ClAUX/LAX基因，根據(jù)在西瓜染色體上的排列順序分別被命名為ClAUX/LAX1-ClAUX/LAX5（表2）。這5個(gè)ClAUX/LAX蛋白的氨基酸長(zhǎng)度為466（ClAUX/LAX2）～497 aa（ClAUX/LAX1），分子量范圍為52.59-55.91 kDa，等電點(diǎn)范圍為8.45（ClAUX/LAX3）～9.09（ClAUX/LAX1），蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均在質(zhì)膜上。

2.2 ClAUX/LAX家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地了解ClAUX/LAXs與其他植物同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用西瓜、擬南芥、水稻和黃瓜的AUX/LAX蛋白序列構(gòu)建了進(jìn)化樹。結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)物種的21個(gè)AUX/LAX蛋白被劃分為兩個(gè)亞族，亞族Ⅰ和Ⅱ分別包含10個(gè)和11個(gè)成員。其中，西瓜的ClAUX/LAXI和ClAUX/LAX2被聚類在亞族Ⅰ，而ClAUX/LAX3、ClAUX/LAX4、ClAUX/LAX5則被聚類在亞族Ⅱ。

2.3 ClAUX/LAX家族成員的結(jié)構(gòu)分析

利用SMART網(wǎng)站對(duì)5個(gè)ClAUX/LAX蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均含有一個(gè)保守的Aa_trans結(jié)構(gòu)域（圖2）。利用MEME網(wǎng)站對(duì)其保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示它們均含有5個(gè)保守的蛋白基序（圖3）。使用GSDS在線軟件分析ClAUX/LAXs的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，除了ClAUX/LAX4有6個(gè)內(nèi)含子，其余4個(gè)基因均含有7個(gè)內(nèi)含子（圖4）。

2.4 ClAUX/LAXs的染色體定位分析

5個(gè)ClAUX/LAX基因隨機(jī)分布在西瓜的5條染色體上（圖5）。其中，ClAUX/LAX1分布在2號(hào)染色體上，ClAUX/LAX2分布在3號(hào)染色體上，ClAUX/LAX3分布在4號(hào)染色體上，ClAUX/LAX4分布在10號(hào)染色體上，ClAUX/LAX5分布在11號(hào)染色體上。沒有發(fā)現(xiàn)由大片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)造成的基因家族擴(kuò)張事件。

2.5 ClAUX/LAXs啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析

利用PlantCARE在線軟件分析ClAUX/LAXs基因起始密碼子上游2 000 bp啟動(dòng)子序列上的順式作用元件，結(jié)果檢測(cè)到21個(gè)激素和逆境脅迫響應(yīng)元件（圖6）。其中，激素響應(yīng)元件包括1個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、3個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif和TGACG - motif）、2個(gè)水楊酸響應(yīng)元件（TCA - element）和1個(gè)赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif），而逆境脅迫響應(yīng)元件包括8個(gè)厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE）、2個(gè)低溫響應(yīng)元件（LTR）、2個(gè)干旱響應(yīng)元件（MBS）和2個(gè)參與防御和非生物脅迫響應(yīng)的元件（TC-rich repeats）．

2.6 ClAUX/LAXs基因在西瓜不同組織中的表達(dá)分析

利用RT-qPCR對(duì)ClAUX/LAXs基因在西瓜根、莖、葉、雄花、雌花和授粉后3d的果實(shí)中的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)，所有ClAUX/LAX成員的表達(dá)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的組織特異性。其中，ClAUX/LAX2和ClAUX/LAX5分別在葉和根中表達(dá)水平最高，在雄花中最低：ClAUX／LAX1在雌花中的表達(dá)水平最高，在雄花中幾乎不表達(dá)：ClAUX/LAX3在莖中的表達(dá)水平最高，在雄花中最低：而ClAUX/LAX4在雄花中表達(dá)水平最高，在根中最低。

2.7 ClAUX/LAXs在西瓜芽再生過程中的表達(dá)分析

為了探討ClAUX/LAXs基因在西瓜芽再生過程中的潛在功能，本研究利用RT-qPCR對(duì)分化5d和10 d的西瓜高再生材料（RC）和低再生材料（NRC）愈傷組織中ClAUX/LAXs基因的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)，除ClAUX/LAX5外，ClAUX/LAXs基因在分化10 d的RC和NRC西瓜中的表達(dá)水平均比分化Sd時(shí)顯著降低。在分化5d時(shí)，與NRC相比，ClAUX/LAX1、ClAUX／LAX3和ClAUX/LAX4在RC中的表達(dá)水平顯著降低，是NRC的60％～85％；ClAUX/LAX2在RC中的表達(dá)水平稍高，是NRC的1.34倍；而ClAUX/LAX5在RC中的表達(dá)量顯著增高，是NRC的2.77倍。在分化10 d時(shí)，與NRC相比，除ClAUX/LAX5表達(dá)量明顯增高外，其余ClAUX/LAXs在兩種材料中的表達(dá)水平基本一致。

3 討論與結(jié)論

本研究在西瓜基因組中共鑒定到5個(gè)ClAUX/LAXs基因，比較發(fā)現(xiàn)，西瓜中AUX／LAX基因的數(shù)量與水稻（5個(gè)）一致，略高于擬南芥（4個(gè)），但比黃瓜（7個(gè)）少。對(duì)擬南芥、水稻、黃瓜和西瓜的AUX/LAXs蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明這些AUX/LAXs蛋白被分為兩個(gè)亞族，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致：在各個(gè)亞族中，單子葉（水稻）和雙子葉（擬南芥、黃瓜和西瓜）植物的AUX/LAXs蛋白又形成了各自的分支：西瓜與黃瓜AUX/LAXs蛋白存在一對(duì)一的同源關(guān)系，表明它們可能來自共同的祖先，但是西瓜中缺失了與黃瓜CsLAX1和CsLAX4蛋白對(duì)應(yīng)的同源蛋白，這說明葫蘆科物種的AUX/LAX家族進(jìn)化存在特異性，西瓜AUX/LAX家族在進(jìn)化過程中可能丟失了部分成員。研究還發(fā)現(xiàn)，ClAUX/LAXs基因的結(jié)構(gòu)與擬南芥的相似，均包含6-8個(gè)內(nèi)含子，而水稻的AUX/LAXs基因則包含2-7個(gè)內(nèi)含子：與其他物種的研究報(bào)道相似，ClAUX/LAXs蛋白也被預(yù)測(cè)均定位在質(zhì)膜上。表明ClAUX/LAXs基因的結(jié)構(gòu)保守。

本研究進(jìn)一步對(duì)ClAUX/LAXs基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了ClAUX／LAX4，其他ClAUX/LAXs均在雄花中的表達(dá)水平最低。其中，ClAUX/LAX2與擬南芥AtLAX3同源，在根中的表達(dá)水平較高，而AtLAX3是側(cè)根原基起始和發(fā)育的重要調(diào)控因子，說明ClAUX/LAX2很可能在西瓜根的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ClAUX/LAX3與ClAUX/LAX4的親緣關(guān)系比其與擬南芥和水稻直系同源蛋白的更近，與擬南芥AtLAX1聚類在同一分支。但ClAUX/LAX3和ClAUX/LAX4的表達(dá)具有明顯的組織特異性：ClAUX/LAX3在莖中高表達(dá)，其次是根，這與擬南芥AtLAX1相似，而AtLAX1在莖和根組織中均促進(jìn)木質(zhì)部分化，這為后續(xù)研究ClAUX/LAX3基因的生物學(xué)功能提供了一定的借鑒：ClAUX/LAX4在雄花和雌花中高表達(dá)，表明其很可能在花發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控功能。

同時(shí)，本研究選用再生能力不同的兩種西瓜材料，分析ClAUX/LAXs基因在其分化5d和10 d的愈傷組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClAUX/LAXs的表達(dá)水平隨著西瓜子葉的分化逐漸降低，表明它們很可能與西瓜的再生能力相關(guān)。值得注意的是，只有ClAUX/LAX5在分化Sd的高再生材料中的表達(dá)水平顯著高于低再生材料，其余ClAUX/LAXs在兩種材料中的表達(dá)水平差異不顯著。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ClAUX/LAX5與擬南芥AtAUX1是同源蛋白。AtAUX1不僅影響側(cè)根的形成和定位，還能調(diào)控?cái)M南芥愈傷組織生長(zhǎng)。而ClAUX/LAX5在西瓜根中特異表達(dá)，推測(cè)其很可能也在西瓜愈傷組織生長(zhǎng)和芽再生過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究西瓜再生調(diào)控基因、提高西瓜的再生能力、完善西瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32202478）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY22C150010）；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)子課題（2021C02065-3-1-1）