代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析揭示白長(zhǎng)果桑獨(dú)特香味物質(zhì)組成及其合成途徑

摘""要：桑葚是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、藥食同源果樹(shù)，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。香氣是桑葚感官品質(zhì)的重要因素，對(duì)消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)行為起到重要作用。白長(zhǎng)果是一種非常獨(dú)特的桑葚品種，它能散發(fā)出濃烈的類(lèi)似于奶油的香味，有巨大的潛在市場(chǎng)價(jià)值，但關(guān)于這種香味形成的關(guān)鍵代謝物和機(jī)制尚不清楚。本研究利用GC-MS和RNA-seq技術(shù)，檢測(cè)白長(zhǎng)果和無(wú)特殊香味的紅長(zhǎng)果桑的關(guān)鍵香味物質(zhì)（VOCs）和基因表達(dá)情況。結(jié)果表明：2個(gè)桑葚品種共檢測(cè)出661種揮發(fā)性代謝物，其中多數(shù)在白長(zhǎng)果桑中有更高的相對(duì)含量，且47種僅在白長(zhǎng)果桑中存在，表明白長(zhǎng)果桑含有豐富的VOCs。312種代謝物被鑒定為差異代謝物；結(jié)合VOCs感官注釋信息和相對(duì)含量，其中70種候選VOCs被注釋為與甜、香、椰子味和奶油味的感官形成有關(guān)，可能是白長(zhǎng)果桑獨(dú)特香氣形成的關(guān)鍵代謝物；利用相對(duì)氣味活性值（rOAV）分析，最終確定γ-葵內(nèi)酯為白長(zhǎng)果桑特殊香氣形成的關(guān)鍵VOC；通過(guò)RNA-seq鑒定19個(gè)與酯類(lèi)合成相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因（包括AAT、ACX、ALDH、CYP、EHL、FAD、HPL、LOX），這些結(jié)構(gòu)基因多在白長(zhǎng)果桑果實(shí)中的高表達(dá)，可能是形成其特殊奶油香味的主要因素。本研究為不同種類(lèi)桑葚的香氣差異研究提供依據(jù)，為后續(xù)桑葚的品種改良提供新思路。

關(guān)鍵詞：揮發(fā)性代謝物；相對(duì)氣味活度值；γ-葵內(nèi)酯；轉(zhuǎn)錄組中圖分類(lèi)號(hào)：S663.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Unique"Flavor"Substance"Composition"and"Its"Synthetic"Pathway"of"Baichang"Mulberry"Revealed"by"Metabolome"and"Transcriptome"Analyses

WU"Huazhou1，2，"HUANG"Jingjing1，2，"LOU"Dezhao1，"GENG"Tao1，"LIN"Peiqun1，"WANG"Shuchang1*

1."National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding，"Sanya，"Hainan，"572024，"China;"2."Institute"of"Environment"and"Plant"Protection，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Science"（Key"Laboralory"of"Integrated"Pest"Management"on"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Aflairs"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Monitoring"and"Control"of"Tropical"Agricultural"Pests），"Haikou，"Hainan，"571101，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China

Abstract："Mulberry"is"a"fruit"tree"with"rich"nutrition"and"dual"functions"of"food"and"medicine，"which"is"deeply"loved"by"consumers."The"fragrance"is"a"significant"factor"in"the"sensory"quality"of"mulberries，"playing"a"crucial"role"in"consumer"purchasing"behavior."Mulberry"Baichang"is"a"unique"variety"that"emits"a"strong，"creamy"fragrance，"which"has"enormous"potential"market"value."However，"the"key"metabolites"and"mechanisms"responsible"for"the"formation"of"this"fragrance"are"still"unclear."In"this"study，"we"utilized"GC-MS"and"RNA-seq"technology"to"examine"the"volatile"organic"compounds"（VOCs）"and"gene"expression"in"Baichang"and"Hongchang，"which"lacking"a"distinct"fragrance."The"results"showed"that"661"volatile"metabolites"were"detected"in"both"varieties."Most"of"these"were"found"in"higher"relative"amounts"in"Baichang，"with"47"types"being"present"only"in"Baichang，"suggesting"a"rich"composition"of"VOCs"in"this"variety."A"total"of"312"metabolites"were"identified"as"differential"metabolites;"combining"the"sensory"annotation"information"and"relative"content"of"VOCs，"70"candidate"VOCs"were"annotated"as"being"related"to"the"formation"of"“sweet，"waxy，"coconut"and"oily”"sensations."These"could"potentially"be"the"key"metabolites"contributing"to"the"unique"aroma"of"Baichang."The"relative"odor"activity"value"（rOAV）"analysis"revealed"that"5-hexyldihydro-2（3H）-furanone"（also"known"as"γ-decalactone）"was"the"key"VOC"contributing"to"the"formation"of"the"special"aroma"of"Baichang."Using"RNA-seq，"19"key"structural"genes"related"to"ester"synthesis"were"screened，"including"AAT，"ACX，"ALDH，"CYP，"EHL，"FAD，"HPL"and"LOX."The"high"expression"levels"of"these"structural"genes"in"Baichang"may"contribute"to"the"unique"creamy"aroma"of"this"variety;"however，"the"underlying"mechanisms"require"further"investigation."This"study"would"provide"insights"into"the"aroma"differences"among"different"kinds"of"mulberries.

Keywords："volatile"organic"compounds;"rOAV;"2（3H）-furanone，"5-hexyldihydro;"RNA-seq

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.006

香氣是判斷水果風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，具有誘人香味的水果能增強(qiáng)消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望[1]。不同品種的水果具有不同的香氣特征，而具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)的產(chǎn)品更容易在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中勝出。桑葚果實(shí)汁水豐沛、口味甜美、營(yíng)養(yǎng)充足，既可以鮮食，也可以加工成桑葚酒、桑葚飲品或其他桑葚產(chǎn)品，深受市場(chǎng)的青睞。近期本課題組發(fā)現(xiàn)一種新的白長(zhǎng)果桑，在成熟時(shí)能散發(fā)出獨(dú)特的類(lèi)似奶油的香味，這在其他品種桑葚中不常見(jiàn)。作為差異明顯的品種，該桑葚具有巨大的育種價(jià)值和潛在商業(yè)價(jià)值。

水果的香味主要由揮發(fā)性物質(zhì)（volatile"organic"compounds，"VOCs）決定，VOCs的種類(lèi)包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、萜類(lèi)和雜環(huán)化合物等[2-3]。雖然VOCs只占果實(shí)重量的很小一部分，但是對(duì)水果的香氣起著決定性作用，對(duì)果實(shí)的口感也有一定影響。不同的VOCs給人以不同的風(fēng)味感官，因此，VOCs對(duì)香氣成分的貢獻(xiàn)不僅僅取決于濃度，還與VOCs的閾值密切相關(guān)[4]。對(duì)于單一VOC來(lái)說(shuō)，其濃度和閾值共同決定了其對(duì)香氣構(gòu)成的貢獻(xiàn)，通常用香氣強(qiáng)度值（odor"activity"value，"OAV）來(lái)衡量[5]。

已有的研究顯示，酯類(lèi)是VOCs中重要組成部分，對(duì)很多水果的感官風(fēng)味起到?jīng)Q定性作用。如歐洲梨（Pyrus"spp）的主要香味來(lái)源則是十烯二酸甲酯和己基酯[6]；在桃子（Prunus"persica）已經(jīng)被鑒定出的100多種VOCs中，酯類(lèi)對(duì)其香味有著決定性的影響[7-8]。揮發(fā)性酯類(lèi)通常在果實(shí)成熟期積累更多，并為多種果實(shí)如草莓（Fragaria×"ananassa）、香蕉（Musa"acuminata）和蘋(píng)果（Malus"domestica）等提供獨(dú)特的水果風(fēng)味[9-10]。植物中酯類(lèi)通過(guò)脂肪酸途徑合成，涉及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，包括丙酮酸脫羧酶（pyruvate"decarboxylase，"PDC）、乙醛脫氫酶（aldehyde"dehydrogenase，"ALDH）、?；d體蛋白?；D(zhuǎn)移酶（acyl"carrier"protein-acyltransferase，"ACP）、脂肪酸脫氫酶（fatty"acid"desaturase，"FAD）、酯酰輔酶A氧化酶（acyl-CoA"oxidase，"ACX）、細(xì)胞色素P450酶（cytochrome"P450，"CYP）、脂肪酸羥化酶（fatty"acidhydr"oxylase，"FAH）、脂氧合酶（lipoxygenase，"LOX）、?環(huán)氧化物水解酶（?epoxide"hydrolase，"EHL）、裂解酶（hydroperoxide"lyase，"HPL）、乙醇脫氫酶（alcohol"dehydrogenase，"ADH）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase，"AAT）等[11-14]。

本研究利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)白長(zhǎng)果桑和無(wú)特殊香味的紅長(zhǎng)果桑果實(shí)的VOCs和基因表達(dá)情況，篩選決定白長(zhǎng)果桑特殊香氣的關(guān)鍵VOCs，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組鑒定與香氣形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。本研究將為桑葚香氣的形成機(jī)制提供新的依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""植物材料

本研究使用的試驗(yàn)材料為白長(zhǎng)果桑（BC）和紅長(zhǎng)果桑（HC）的果實(shí)，栽培于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院環(huán)境與植物保護(hù)研究所種質(zhì)資源圃（海南儋州，中國(guó)）。每個(gè)品種選取9株生長(zhǎng)狀況良好的壯年樹(shù)，每3棵作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每株取10～15個(gè)完熟果實(shí)作為樣品。取樣后立即液氮冷凍，?80"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2""方法

1.2.1""揮發(fā)性代謝組檢測(cè)與分析""將研磨均勻的500"mg樣品加入頂空瓶中，再依次加入飽和NaCl溶液、10"μL（50"μg/mL）內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)行全自動(dòng)頂空固相微萃?。℉S-SPME）后備用。萃取條件：60"℃恒溫，5"min震蕩，120"μm"DVB/CWR/PDMS萃取頭置于樣品頂空瓶中萃取15"min，250"℃下解析5"min，進(jìn)行GC-MS分離鑒定。取樣前，萃取頭在Fiber"Conditioning"Station中進(jìn)行5"min老化，溫度為250"℃。色譜條件為DB-5MS毛細(xì)管柱，載氣為高純氦氣，恒流流速設(shè)定為1.2"mL/min，進(jìn)樣口設(shè)定溫度250"℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5"min。程序升溫設(shè)置，40"℃保持3.5"min，以10"℃/min升至100"℃，再以7"℃/min升至180"℃，最后以25"℃/min升至280"℃，保持5"min。質(zhì)譜條件設(shè)置為：電子轟擊離子源（EI），離子源設(shè)定溫度230"℃，四級(jí)桿設(shè)定溫度為150"℃，質(zhì)譜接口溫度為280"℃，電子能量70"eV。掃描方式為選擇離子檢測(cè)模式（SIM），定性定量離子精準(zhǔn)掃描（GB"23200.8—2016）。

使用MassHunter軟件處理質(zhì)譜分析后的下機(jī)原始數(shù)據(jù)，基于Metetware公司自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性定量分析。利用主成分分析（PCA）對(duì)樣品中代謝物的差異性和可靠性進(jìn)行分析驗(yàn)證。使用R軟件繪制聚類(lèi)熱圖，利用cor函數(shù)計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)。以VIPgt;1和Fold"Change≥2和Fold"Change≥0.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物，使用LRI"amp;"odour"database、Flavornet"and"human"odor"space和Flavor"Ingredient"Library數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)VOCs的感官風(fēng)味特征注釋。通過(guò)R包計(jì)算VOCs的相對(duì)氣味活度值（relative"odor"activity"value，"rOAV）值[15]。

1.2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析""取1.1的樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），測(cè)序由武漢邁特維爾公司完成。使用CTAB法提取樣品RNA，利用片段化后的mRNA和隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成，然后在其兩端加上接頭并進(jìn)行純化。

每個(gè)樣品建立1個(gè)測(cè)序文庫(kù)，用Illumina"Hiseq"X進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)邊合成邊測(cè)序的方法進(jìn)行雙端測(cè)序。

對(duì)所測(cè)讀序（read）進(jìn)行過(guò)濾，然后組裝轉(zhuǎn)錄本，所用程序?yàn)門(mén)rinity，主要參數(shù)為“min_kmer_"cov2”，最后將最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本指定為元基因（unigene）。采用DESeq"R包（1.10.1）分析2組間的差異表達(dá)，|log2（Fold"Change）|gt;1且P-valuelt;"0.05視為差異表達(dá)基因（differential"expression"genes，"DEGs）。RNA-seq的原始數(shù)據(jù)以以下ID號(hào)提交給NCBI：PRJNA1084918和PRJNA1142089。

1.2.3""qRT-PCR分析""首先，用天根RNA試劑盒提取1.1的樣品RNA；接著使用天根FastKing"gDNA"Dispelling"RT"SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成"cDNA；以酯類(lèi)合成關(guān)途徑基因脂肪酸脫氫酶（fatty"acid"desaturase，"FAD）、酯酰輔酶A氧化酶（acyl-CoA"oxidase，"ACX）、脂氧合酶（lipoxyge na se，"LOX）、?環(huán)氧化物水解酶（?epoxide"hydrolase，"EHL）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyltransferase，"AAT）基因?yàn)槟康幕颍褂肞rimer"3.0（https：//primer3.ut."ee/）軟件設(shè)計(jì)基因的qPCR引物（表1），然后通過(guò)ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（20"μL）：2×ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix"10"μL，primer1"0.4"μL，primer2"0.4"μL，cDNA"2"μL，ddH2O"7.2"μL。反應(yīng)程序：95"℃"15"min；95"℃"10"s，60"℃"30"s，72"℃"30"s，40個(gè)循環(huán)。以桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白（Actin）為內(nèi)參基因[16]。按照2?ΔΔCt方法計(jì)算。

1.3""數(shù)據(jù)處理

本研究主要使用TBtools軟件[17]和邁維云平臺(tái)（https：//cloud.metware.cn）進(jìn)行熱圖繪制和數(shù)據(jù)分析。采用SPSS"27.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P-valuelt;0.05和P-valuelt;0.01被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并使用“*”和“**”表示。

2""結(jié)果與分析

2.1""白長(zhǎng)果桑和紅長(zhǎng)果桑成熟果實(shí)代謝組分析

白長(zhǎng)果桑和紅長(zhǎng)果桑的成熟果實(shí)如圖1A所示。在2個(gè)種類(lèi)的桑葚成熟果實(shí)中共鑒定出661種揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，分為15個(gè)種類(lèi)，其中萜烯類(lèi)（terpenoids）數(shù)量最多，為133個(gè)，占全部揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類(lèi)的20.12%，其次為酯類(lèi)（ester）和雜環(huán)化合物（heterocyclic"compound），分別占總量的16.79%和15.89%，其余為含氮化合物（nitrogen"compounds）、醛類(lèi)（aldehyde）、酮類(lèi)（ketone）、醇類(lèi)（alcohol）、烴類(lèi)（hydrocarbons）、芳烴（aromatics）、酸類(lèi)（acid）、苯酚（phenol）、鹵代烴（halogenated"hydrocarbons）、胺類(lèi)（amine）、硫化合物（sulfur"compounds）等成分（圖1B）。有47種揮發(fā)性代謝物僅在白長(zhǎng)果桑中被檢測(cè)出，表明其香氣成分可能更豐富。主成分分析（PCA）顯示，同一桑葚種類(lèi)之間的3個(gè)重復(fù)相互靠攏，表明樣品的重復(fù)性良好；2組之間呈明顯的分離趨勢(shì)，表明2個(gè)品種的VOCs差異較大；其中第一主成分決定了64.40%的變異率，第二主成分決定了29.14%的變異率（圖1C）。

2.2""差異揮發(fā)性代謝物分析

2個(gè)桑葚品種共鑒定出312種差異代謝物。相比于白長(zhǎng)果桑，紅長(zhǎng)果桑多數(shù)差異代謝物（290種）下調(diào)，僅有22種差異代謝物上調(diào)，這可能是白長(zhǎng)果桑更有特色香氣成分的成因。根據(jù)感官體驗(yàn)，白長(zhǎng)果桑具有香味，而紅長(zhǎng)果桑不含香味，所以影響白長(zhǎng)果桑香味的關(guān)鍵代謝物很可能屬于下調(diào)差異代謝物（圖2A）。通過(guò)對(duì)2個(gè)品種桑葚的差異代謝物進(jìn)行感官風(fēng)味特征注釋，發(fā)現(xiàn)青香（green）、辛辣香（spicy）、木香（woody）、花香（floral）、清香（fresh）、草香（herbal）、蠟香（waxy）、脂肪香（fatty）、果味（fruity）、甜味（sweet）為排名前十的差異代謝物感官風(fēng)味，其中青香、甜味、果味、脂肪香4種感官風(fēng)味中含有的差異代謝物數(shù)量最多（圖2B）。

2.3""香氣成分的關(guān)鍵差異代謝物篩選

通過(guò)繪制感官風(fēng)味網(wǎng)絡(luò)圖確定每種感官風(fēng)味的關(guān)鍵差異代謝物（圖3A）。甜味、蠟香、椰子油（coconut"oily）幾種感官風(fēng)味與白長(zhǎng)果桑的嗅覺(jué)體驗(yàn)一致，基于這4種感官風(fēng)味，共篩選出73種相關(guān)聯(lián)的差異代謝物。白長(zhǎng)果桑在嗅覺(jué)感官上有較為濃郁的奶香味，因此，白長(zhǎng)果桑中與香味相關(guān)的關(guān)鍵差異代謝物的相對(duì)含量更高。5-乙基-3-羥基-4-甲基-2（5H）-呋喃酮[2（5H）-Furanone，"5-ethyl-3-hydroxy-4-methyl-]、trans，"cis-2，6-Non ad i en-1-ol、1-Nonanol三種物質(zhì)的含量在紅長(zhǎng)果桑中更高，表明其不是形成白長(zhǎng)果桑香味的關(guān)鍵物質(zhì)，而其余70種差異代謝物在白長(zhǎng)果桑中相對(duì)含量更高，可能是造成2個(gè)種類(lèi)桑葚果實(shí)香味差異的候選關(guān)鍵代謝物質(zhì)（圖3B）。

2.4""相對(duì)氣味活度值（rOAV）分析

相對(duì)氣味活度值（rOAV）可以闡明每種香氣化合物對(duì)果實(shí)整體香氣特征的貢獻(xiàn)，與差異代謝物的含量結(jié)合分析，可以進(jìn)一步尋找到造成白長(zhǎng)果桑和紅長(zhǎng)果桑香味存在差異的關(guān)鍵物質(zhì)。由圖4可知，對(duì)白長(zhǎng)果桑香味影響最大的4種物質(zhì)分別是1-對(duì)孟烯-8-硫醇（3-Cyclohexene-1-m etha ne thiol，.alpha.，.alpha.，4-trimethyl-）、5-乙基-3-羥基-4-甲基-2（5H）-呋喃酮、3-巰基-3-甲基丁基甲酸酯[3-Mercapto-3-methylbutyl"formate"（ester）]、γ-葵內(nèi)酯[2（3H）-Furanone5-hexyldihydro-]。其中5-乙基-3-羥基-4-甲基-2（5H）-呋喃酮、3-巰基-3-甲基丁基甲酸酯的rOAV值在紅長(zhǎng)果桑中高，而在白長(zhǎng)果桑中低，與白長(zhǎng)果桑香味濃郁而紅長(zhǎng)果桑無(wú)明顯香味的嗅覺(jué)感官體驗(yàn)不相符。因此，推測(cè)這2種物質(zhì)不是造成2個(gè)桑葚品種香味差異的關(guān)鍵物質(zhì)。1-對(duì)孟烯-8-硫醇的氣味注釋為硫磺味、芳香味、柚子味、樹(shù)脂味和木頭味，與白長(zhǎng)果桑實(shí)際的奶香味嗅覺(jué)感受相差甚遠(yuǎn)。綜合分析，推測(cè)γ-葵內(nèi)酯為白長(zhǎng)果桑奶香味來(lái)源的主要物質(zhì)，也是形成2種桑葚氣味差異的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。

2.5""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異基因分析

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，6個(gè)桑葚果實(shí)樣品分別獲得42"731"000～51"231"176個(gè)raw"reads，過(guò)濾后分別得到41"862"788～49"701"590個(gè)clean"reads和6.28～7.46"Gb的clean"base。所有樣品的錯(cuò)誤率均為0.02%，Q20含量在98.06%～98.14%之間，Q30含量在94.42%～94.76%之間，GC含量在46.3%～"47.04%之間。相關(guān)性分析顯示樣品重復(fù)性較好（圖5A）。差異分析顯示，在BC"vs"HC比較組中，有1823個(gè)基因上調(diào)，2352個(gè)基因下調(diào)（圖5B）。

GO分析將差異基因歸類(lèi)與生物過(guò)程（biolog ic al"process"BP）、細(xì)胞組成（cellular"component"CC）和分子功能（molecular"function"MF）3個(gè)條目，在3個(gè)比較組合中，生物過(guò)程中注釋基因數(shù)量最多的為細(xì)胞過(guò)程（cellular"process）（基因數(shù)目為2063個(gè)），細(xì)胞組成中注釋基因數(shù)量最多的為cellular"anatomical"entity"（基因數(shù)目為2689個(gè)），分子功能中注釋基因數(shù)量最多的為binding（基因數(shù)目為1932個(gè)）（圖5C）。KEGG分析將差異基因被富集到多個(gè)代謝通路，包括biosynthesis"of"secondary"metabolites、metabolic"pathways、flavone"and"flavonol"biosynthesis、alpha-

2.6""桑葚發(fā)育過(guò)程中Lactones（內(nèi)脂）合成途徑基因表達(dá)情況

本研究從差異基因中篩選了與酯類(lèi)合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，包括1個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因AAT（M.alba_G0004770）、1個(gè)酯酰輔酶A氧化酶ACX（M.alba_G0004521）、3個(gè)乙醛脫氫酶ALDH（M.alba_G0000606、M.alba_G0019840和M.alba_G0013314）、4個(gè)細(xì)胞色素P450酶CYP（novel.128、M.alba_G0014072、M.alba_G0006952和M.alba_G0003440）、4個(gè)環(huán)氧化物水解酶EHL（M.alba_G0008184、M.alba_G0005973、M.alba_G0000938和M.alba_G0010612）、3個(gè)脂肪酸脫氫酶FAD（novel.4905、M.alba_G0000805和M.alba_G0009644）、1個(gè)裂解酶HPL（M.alba_"G0002152）和2個(gè)脂氧合酶LOX（M.alba_"G0015824和M.alba_G0014496）。在這些結(jié)構(gòu)基因中，多數(shù)成員在白長(zhǎng)果品種中高表達(dá)，少部分在紅長(zhǎng)果品種中高表達(dá)（附表1）。如相較于紅長(zhǎng)果桑，M.alba_G0000606（ALDH）在白長(zhǎng)果桑中的表達(dá)上調(diào)了14.50倍，M.alba_G0014072（CYP）上調(diào)11.14倍，M.alba_G0004521（ACX）上調(diào)了7.06倍，M.alba_G0004770（AAT）上調(diào)了2.71倍等（圖6）。這些基因可能是白長(zhǎng)果桑獨(dú)特香氣成分形成的關(guān)鍵因素。qPCR驗(yàn)證基因表達(dá)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢(shì)一致（圖7）。

3""討論

香味是衡量水果品質(zhì)重要的標(biāo)準(zhǔn)之一，它影響著水果的價(jià)格及銷(xiāo)量，一些能散發(fā)出迷人香氣的新品種水果往往更容易得到消費(fèi)者的偏愛(ài)[18-19]。香味不僅對(duì)鮮食水果有著深遠(yuǎn)的影響，對(duì)其后續(xù)加工制品，如果酒、罐頭、水果凍干、果醬等生產(chǎn)同樣意義重大[20-21]。部分香味物質(zhì)如內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)，還可以用于制作香水、食用香精或藥品等[22]。果實(shí)的香氣通常由VOCs的種類(lèi)、不同含量和各組分的氣味閾值共同決定[23]。水果中的VOCs以其中萜類(lèi)、酯類(lèi)和脂肪酸衍生物最為常見(jiàn)[24]。ZHU等[25]對(duì)3個(gè)栽培品種桑葚（Morus"nigra，"Morus"macroura，"Morus"alba）香氣成分的研究顯示，Hex anal、（E）-2-Hexenal、Benzaldehyde、Methyl"benzo ate、Ethyl"benzoate、Ethyl"acetate、Ethyl"butanoate、E thyl"hexanoate、methional、3-mercapt ohexyl"acetate等是桑葚香氣形成的主要物質(zhì)。然而，至今還無(wú)相關(guān)研究報(bào)道存在明顯奶油香味的桑葚品種。本研究以白長(zhǎng)果桑和紅長(zhǎng)果桑2個(gè)種類(lèi)桑葚為樣本，共檢測(cè)到661種VOCs，其中包括大量的酯類(lèi)、萜類(lèi)、醛類(lèi)和雜環(huán)化合物，這和前人研究是相似的。然而γ-葵內(nèi)酯僅在白長(zhǎng)果桑中具有較高的相對(duì)含量，在其他品種中未見(jiàn)報(bào)道，顯示了其在香氣組分上的特殊性，具有較大的潛在市場(chǎng)價(jià)值[26-27]。

γ-葵內(nèi)酯的氣味被認(rèn)為具有濃郁的奶油、堅(jiān)果和焦糖的香氣，是對(duì)桃子香氣貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性物質(zhì)，它使得桃子區(qū)別于其他水果[28-29]。然而，就感官而言，白長(zhǎng)果桑散發(fā)的香氣濃郁而獨(dú)特，與桃子并不相同，這可能是由于二者其他成分的VOCs組成與含量不同所導(dǎo)致的。王娟等[30]研究了8個(gè)草莓品系的香氣成分，發(fā)現(xiàn)γ-葵內(nèi)酯對(duì)京桃香草莓的獨(dú)特香味形成有決定性作用。γ-葵內(nèi)酯除了是水果香味的重要組成成分之外，還是香料和食品工業(yè)中最廣泛使用的內(nèi)酯之一[31]。

酯在植物中的合成途徑尚未被完全解析，脂肪酸（FAs）被認(rèn)為是酯類(lèi)合成的主要前體，香蕉、草莓、甜瓜（Cucumis"melo）果實(shí)的香氣主要由脂肪酸衍生物導(dǎo)致[10，"32]。目前已經(jīng)有報(bào)道了一些脂肪酸途徑的關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基因，包括脂肪酸去飽和酶（FAD）、醇脫氫酶（ADH）、脂氧合酶（LOX）和乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAT）等[33]。百香果（Passiflora"edulis）上的研究顯示脂肪酸通路中的ACX13/14/"15/20、ADH13/26/33、ALDH1/4/21、HPL4/6、FAD13/50/52/53/55、PeLOX5/18、PeFAE6、PeFAH2、PeCYP7/13、PeEHL13/15、PeACP-AP1/"5/6/7、PeAAT3可能參與酯類(lèi)合成的調(diào)控[14]。AdFAD1、AdALDH2、AdAAT17參與了獼猴桃（Actinidia"deliciosa）成熟過(guò)程中酯類(lèi)合成的調(diào)控[34]。1-MCP顯著調(diào)控梨酯類(lèi)和VOCs的釋放，調(diào)控AATs和LOX的表達(dá)[35]。AAT催化了酯生物合成的最后一步，通常果實(shí)的成熟水平和酯類(lèi)含量同步增加[36]。杏（Prunus"armeniaca）、木瓜（Carica"papaya）、獼猴桃、葡萄（Vitis"vinifera）和草莓等多種水果種的AATs已被克隆和功能驗(yàn)證[9，"37-40]。PENG等[41]利用產(chǎn)油酵母表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)了PpAAT1能催化γ-葵內(nèi)酯的合成。本研究中，多數(shù)脂肪酸途徑的結(jié)構(gòu)基因在白長(zhǎng)果桑果實(shí)中高表達(dá)，其中也包含1個(gè)AAT（M.alba_G0004770）。這些基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致了白長(zhǎng)果桑擁有更復(fù)雜的香氣組成和獨(dú)特香味。

關(guān)于揮發(fā)性酯類(lèi)的調(diào)控，多數(shù)集中在轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脂肪酸途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上。ZHANG等[34]通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)證明了AdNAC5和AdDof4分別激活和抑制了AdFAD1啟動(dòng)子活性，進(jìn)而調(diào)控獼猴桃酯類(lèi)的合成。NAC轉(zhuǎn)錄因子可以激活A(yù)AT表達(dá)，催化多種果實(shí)中揮發(fā)性酯類(lèi)的形成，如桃中PpNAC1激活PpAAT1的表達(dá)，蘋(píng)果中MdNAC5激活MdAAT1的表達(dá)。CAO等[36]的研究表明這種調(diào)控受到表觀遺傳的調(diào)控，與果樹(shù)成熟過(guò)程中抑制標(biāo)記H3K27me3的去除密切相關(guān)。關(guān)于桑葚中γ-葵內(nèi)酯合成的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

4""結(jié)論

本研究利用HS-SPME萃取和GC-MS技術(shù)檢測(cè)白長(zhǎng)果桑和紅長(zhǎng)果桑的揮發(fā)性代謝物，并通過(guò)RNA-seq篩選影響白長(zhǎng)果桑香氣形成的關(guān)鍵基因。從代謝組中共檢測(cè)出661中揮發(fā)性代謝物，其中47種為白長(zhǎng)果桑特有，共篩選到312種為差異代謝物，結(jié)合其相對(duì)含量、感官注釋和rOAV分析，最終確定了γ-葵內(nèi)酯為白長(zhǎng)果桑特殊香氣形成的關(guān)鍵VOC。通過(guò)RNA-seq，鑒定了19個(gè)與酯類(lèi)合成相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，包括AAT、ACX、ALDH、CYP、EHL、FAD、HPL和LOX，這些結(jié)構(gòu)基因在白長(zhǎng)果桑果實(shí)中的高表達(dá)，可能是形成其特殊奶油香味的主要因素。本研究為不同種類(lèi)桑葚的香氣差異研究提供了依據(jù)，為后續(xù)桑葚的品種改良提供了新思路。

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