具脅迫“記憶”特征的白木香離體根的miRNA分析

摘""要：本研究以白木香離體根為材料，在經(jīng)過連續(xù)三代鹽脅迫處理后，使用EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒提取樣品的總RNA，利用HiSeq"2500高通量測序平臺進行測序，旨在探討miRNA在白木香三代離體根鹽脅迫中發(fā)揮的作用及可能參與調(diào)控的代謝途徑，為揭示白木香抵御鹽脅迫機制的研究提供參考。取白木香三代鹽脅迫的離體根為材料，通過使用高通量測序平臺及生物信息學(xué)技術(shù)，獲得第一代、第二代、第三代的miRNA表達譜，篩選三代離體根中的差異miRNA，對差異miRNA進行靶基因預(yù)測，之后進行靶基因分析，從而獲得可能參與白木香次生代謝產(chǎn)物及響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的miRNA。結(jié)果顯示：第一代樣品中共檢測出508個已知miRNA和764個新預(yù)測miRNA，第二代樣品中共檢測出444個已知miRNA和673個新預(yù)測miRNA，第三代樣品中共檢測出904個已知miRNA和1100個新預(yù)測miRNA。三代樣品中共獲得59個差異表達miRNA及275個靶基因，上調(diào)的miRNA靶基因主要參與類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝等信號通路，下調(diào)的miRNA靶基因則主要涉及苯丙烷類生物合成、植物激素信號傳導(dǎo)、植物病原相互作用等信號通路。選取關(guān)鍵miRNA進行NR注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR8020-x和novel-m0628-5p可能參與白木香離體根次生代謝產(chǎn)物合成；miR7494-y、miR477-y、miR5185-y、miR7757-y、miR408-z和novel-m0628-5p可能響應(yīng)白木香離體根鹽脅迫。本研究利用高通量測序得到白木香離體根鹽脅迫的miRNA表達譜，并利用生物信息學(xué)分析得到可能參與白木香次生代謝產(chǎn)物及響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的miRNA，研究結(jié)果將有助于增強對白木香在鹽脅迫條件下miRNA調(diào)控機制的認識，并為白木香次生代謝產(chǎn)物合成提供新的途徑。

關(guān)鍵詞：白木香；脅迫記憶；miRNA；HiSeq"2500高通量測序中圖分類號：S567.19""""""文獻標志碼：A

MiRNAs"Analysis"of"Aquilaria"sinensis"Vitro"Roots"with"Stress"Memory"Characteristic

ZHUANG"Tingting，"LI"Jiaxin，"ZHAN"Ruoting，"MA"Xinye*

School"of"Chinese"Materia"Medica，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"Ministry"of"Education"Key"Laboratory"of"Chinese"Medicinal"Resource"from"Lingnan，"Ministry"of"Education"/"National"Engineering"Research"Center"for"Proprietary"Chinese"Medicines"Ramp;D"Laboratory"of"Southern"Medicines，"Guangzhou，"Guangdong"510006，"China

Abstract："The"total"RNA"of"Aquilaria"sinensis"vitro"roots"was"extracted"using"the"EASYspin"Plus"Plant"Rapid"Extraction"Kit"after"three"consecutive"generations"of"salt"stress"treatment，"and"sequenced"using"the"HiSeq"2500"high-"throughput"sequencing"platform，"aiming"at"exploring"the"roles"of"miRNAs"in"the"three"generations"of"A."sinensis"vitro"roots"under"salt"stress"and"the"metabolic"pathways"that"may"be"involved"in"the"regulation，"and"providing"references"to"reveal"the"mechanisms"of"A."sinensis."The"miRNA"expression"profiles"of"the"first，"second"and"third"generations"were"obtained"by"using"the"high-throughput"sequencing"platform"and"bioinformatics"technology，"and"the"differential"miRNAs"in"the"three"generations"of"vitro"roots"were"screened，"and"the"target"genes"of"the"differential"miRNAs"were"predicted，"and"then"the"target"gene"analysis"was"performed"to"obtain"the"miRNAs"that"might"be"involved"in"the"secondary"metabolites"of"A."sinensis"and"those"that"were"related"to"the"response"to"salt"stress."The"results"showed"that"508"known"miRNAs"and"764"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"first-generation"samples;"444"known"miRNAs"and"673"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"second-generation"samples;"904"known"miRNAs"and"1100"new"predicted"miRNAs"were"detected"in"the"third-generation"samples."A"total"of"59"differentially"expressed"miRNAs"and"275"target"genes"were"obtained"from"the"three"samples."The"up-regulated"miRNA"target"genes"were"mainly"involved"in"flavonoid"biosynthesis"and"glutathione"metabolism，"while"the"down-regulated"miRNA"target"genes"were"mainly"involved"in"phenylpropanoid"biosynthesis，"Plant"hormone"signal"transduction，"plant-pathogen"interactions"and"other"signaling"pathways."The"key"miRNAs"were"selected"for"NR"annotation，"and"it"was"found"that"miR8020-x"and"novel-m0628-5p"might"be"involved"in"the"synthesis"of"secondary"metabolites"in"A."sinensis"vitro"roots，"and"miR7494-y，"miR477-y，"miR5185-y，"miR7757-y，"miR408-z，"and"novel-m0628-5p"might"be"responded"to"A."sinensis"vitro"roots"salt"stress."In"this"study，"we"used"high-throughput"sequencing"to"obtain"miRNA"expression"profiles"of"A."sinensis"vitro"roots"under"salt"stress，"and"bioinformatics"analysis"to"obtain"miRNAs"that"may"be"involved"in"secondary"metabolites"of"A."sinensis"and"those"related"to"the"response"to"salt"stress.The"results"of"the"present"study"will"help"to"enhance"the"understanding"of"the"miRNA"regulatory"mechanisms"of"A."sinensis"under"salt"stress"conditions"and"provide"a"new"pathway"for"the"synthesis"of"secondary"metabolites"of"A."sinensis.

Keywords："Aquilaria"sinensis;"stress"memory;"miRNAs;"HiSeq"2500"high-throughput"sequencing

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.005

鹽脅迫作為一種嚴重影響植物生長發(fā)育的環(huán)境脅迫，可引發(fā)植物體內(nèi)產(chǎn)生離子和滲透脅迫，進而影響植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累或減少[1-2]。多項研究表明，不同植物在應(yīng)對鹽脅迫時展現(xiàn)出獨特的生理適應(yīng)機制，如胡椒（Piper"Nigrum）[3]、連錢草（Glechoma"longtituba）[4]和杠柳（Periploca"sepium"Bunge）[5]在鹽脅迫下某些次生代謝產(chǎn)物增加，而藏紅花（Crocus"sativus）[6]和荊芥（Schizonepeta"tenuifolia）[7]中次生代謝產(chǎn)物則呈現(xiàn)出不同程度的減少。近年來的研究表明，MicroRNA（miRNA）在植物鹽脅迫響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，并通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達影響植物耐鹽性及次生代謝物合成[8-9]。在擬南芥（Arabidopsis"thaliana）中，MA等[10]發(fā)現(xiàn)miR171在鹽脅迫下調(diào)控靶基因GRAS，通過改變植株根系miRNA的表達來提高植物的耐鹽性。水稻（Oryza"sativa）中，特定miRNA（miR1841）的過表達顯著減輕了鹽脅迫[11]。這些研究成果為深入理解植物在鹽脅迫下的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

白木香[Aquilaria"sinensis"（Lour.）"Gilg]為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria"L.）常綠喬木，其含樹脂心材沉香，具有極高的藥用價值，同時也是名貴香料，在醫(yī)藥、香料等行業(yè)有著廣泛應(yīng)用[12]。然而，自然環(huán)境下，野生沉香屬植物受損后通常需要數(shù)十年時間才能形成沉香木[13]，這極大地限制了沉香的供應(yīng)，導(dǎo)致其市場需求與自然產(chǎn)出之間存在巨大差距。沉香木（結(jié)香）的形成是樹體在環(huán)境脅迫下逐漸積累次生代謝物的過程，因此，許多研究者致力于尋找有效的誘導(dǎo)方法來加速沉香的形成。鹽脅迫作為一種化學(xué)誘導(dǎo)手段逐漸受到重視，因其能夠誘導(dǎo)白木香愈傷組織產(chǎn)生2-（2-苯乙基）色酮類化合物[14]，且白木香離體根在多代的鹽脅迫下表現(xiàn)出“脅迫記憶”特征[15]，這表明著鹽脅迫可能在白木香結(jié)香過程中扮演著重要角色。目前關(guān)于白木香中鹽脅迫與miRNA的關(guān)系研究尚處于起步階段。尤其是miRNA在鹽脅迫下如何調(diào)控白木香次生代謝產(chǎn)物積累以促進結(jié)香的機制仍不清楚。鑒于此，本研究將對白木香三代離體根進行Small"RNA測序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選出差異表達的miRNA及其靶基因。一方面，旨在揭示miRNA在白木香適應(yīng)鹽脅迫過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為全面理解白木香抗逆機制提供關(guān)鍵依據(jù)；另一方面，通過分析與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的miRNA，探索其在促進白木香結(jié)香相關(guān)次生代謝過程中的潛在作用。盡管目前尚未有直接證據(jù)表明鹽脅迫下白木香的結(jié)香時間、產(chǎn)量或質(zhì)量會發(fā)生改變，但本研究有望為后續(xù)研究提供重要線索，從而為推動白木香抗逆性研究及促進沉香產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐和新的研究思路。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""本研究所采用的白木香種子來源于廣東省化州市維國沉香種植開發(fā)專業(yè)合作社，廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心的詹若挺教授通過參考《中國植物志》[16]《中華人民共和國藥典》[17]鑒定其為白木香[Aquilariasinensis"（Lour.）"Gilg]種子。

1.1.2""主要試劑""MS培養(yǎng)基（Murashige"amp;"Skoog"Medium）購自Duchefa公司；蔗糖、瓊脂購自BioFroxx公司；IBA（Indole-3-Butytric"acid）購自Sigma公司；NaCl購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2""方法

1.2.1""材料的獲取""白木香的離體根獲取過程涉及連續(xù)三代繼代培養(yǎng)，每次繼代均分為2個階段：培養(yǎng)階段和鹽脅迫階段。培養(yǎng)階段：首先通過無菌條件培育白木香組培苗，篩選出長勢良好的無菌苗根，剪去根尖，并剪成大約2.0"cm的根段。將根段置于含1.0"mg/L"IBA的1/2MS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7"d后，將根段轉(zhuǎn)移至不含IBA的1/2MS培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)42"d（期間每7"d更換1次培養(yǎng)基），從而獲得初始的離體根材料。接下來，進行第一次繼代。鹽脅迫階段：將離體根材料置于含150"mmol/L"NaCl的1/2MS液體培養(yǎng)基中，在（25±1）℃的溫度下，以110"r/min的速度震蕩培養(yǎng)3"d，之后從數(shù)瓶中取出離體根，剪下側(cè)根并將其標記為第一代（G1），立即放入液氮速凍，并儲存在–80"℃的冰箱中。剩余的離體根則繼續(xù)剪下側(cè)根，置于新的培養(yǎng)基中進行下一代的培養(yǎng)階段，即在不含NaCl的1/2MS中繼續(xù)培養(yǎng)，為后續(xù)鹽脅迫做準備。同樣的過程重復(fù)進行2次，分別獲得第二代（G2）和第三代（G3）的鹽脅迫側(cè)根材料。每次繼代都遵循先培養(yǎng)后脅迫模式，確保每代側(cè)根都經(jīng)歷相同的處理流程。最后，將G1、G2、G3用于Small"RNA"測序。

1.2.2""Small"RNA文庫構(gòu)建與HiSeq2500測序""采用EASYspin"Plus植物快速提取試劑盒提取經(jīng)過脅迫處理的白木香離體根樣品的總RNA。隨后，將提取的高質(zhì)量RNA樣本送至廣州基迪奧生物科技有限公司，構(gòu)建文庫。文庫構(gòu)建完成后，采用Illumina"HiSeq"2500測序平臺進行測序。

1.2.3""基因表達量分析""對測序得到的raw"data文件進行數(shù)據(jù)過濾，剔除低質(zhì)量的reads、不帶有3?接頭的reads及含有5'接頭的reads，最后得到"Small"RNA的tag序列。接著，利用GenBank和Rfam（11.0）數(shù)據(jù)庫來對這些tag序列進行注釋，盡可能地識別并剔除樣本中可能存在的rRNA，scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA。將最終得到的tag序列同miRBase中已知的植物或動物miRNA進行比對，鑒定到的miRNA即為已知miRNA。去除鑒定為已知的miRNA，挑選出能夠比對上基因組的tag，使用軟件MIREAP"v0.2預(yù)測miRNA特殊的二級結(jié)構(gòu)，找出可能存在的新的miRNA。對各個樣品鑒定的miRNA進行匯總，并依據(jù)TPM（tags"per"million）公式計算每個miRNA的表達量，TPM=T×106/N[T表示miRNA的tags，N表示總miRNA的tags（已存在+已存在編輯+已知+新預(yù)測miRNA"counts數(shù)之和）]。通過這一過程，獲得所有樣品的全部miRNA的表達譜。

1.2.4""miRNA的靶基因預(yù)測及靶基因富集分析""使用patmatch"v1.2軟件對樣本中的miRNA和靶基因進行互補配對分析，并設(shè)定嚴格的篩選標準預(yù)測最終結(jié)果。篩選標準包括：整個互補關(guān)系中最多允許4個錯配（其中G-U配對視為0.5個錯配），且不允許連續(xù)錯配；miRNA的5'端第2～12位及miRNA與靶基因的第10～11位必須完全匹配，不允許錯配；miRNA與靶基因的5'端1～12位置內(nèi)，最多允許2.5個錯配；同時，miRNA與靶基因的最小自由能（MFE）需達到或超過完美匹配時MFE的60%。完成預(yù)測后，將所得的靶基因與GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，以進行功能上的注釋及分類處理，從而獲取有關(guān)這些靶基因的詳細注釋信息。

2""結(jié)果與分析

2.1""所有樣本中miRNA圖譜概述

高通量測序結(jié)果顯示，白木香離體根鹽脅迫樣品（G1-1、G1-2、G1-3、G2-1、G2-2、G2-3、G3-1、G3-2和G3-3）miRNA文庫中，所有樣品的clean"tags均大于85%（表1），表明所得miRNA數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。miRNA測序得到的tag序列長度主要分布在21"nt和24"nt（圖1），與植物中miRNA的分布相符合?；趍iRBase和參考基因組對miRNA進行鑒定，在白木香樣品G1-1、G1-2、G1-3、G2-1、G2-2、G2-3、G3-1、G3-2、G3-3中分別發(fā)現(xiàn)了282、119、107、94、230、120、365、278、261個已知miRNA，421、149、194、106、424、143、435、284、381個新miRNA，"共鑒定出1476個miRNA（圖2）。G3代樣品中已知miRNA和新miRNA的數(shù)量明顯多于G1和G2代，表明隨著鹽脅迫代數(shù)的增加，白木香離體根的miRNA表達調(diào)控更加復(fù)雜，可能涉及更多的基因表達調(diào)控過程。

2.2""鹽脅迫下miRNA的表達量分析

所有樣品中共鑒定出1476個miRNA，包括794個已知miRNA和682個新預(yù)測miRNA。在已知miRNA中，miR166-y的表達量最高，在G3樣本中其表達量達到6"264"167.887，其次是miR396-x和miR156-x；在新預(yù)測miRNA中，novel-m0109-3p的表達量最高，在G3樣本中其表達量為30"391.845，其次是novel-m0497-3p和novel-m0108-3p（表2）。進一步分析3個樣品中miRNA的差異表達，發(fā)現(xiàn)miR166-y、miR396-x和novel-m0109-3p在G3中的表達占優(yōu)勢，novel-m0224-3p和novel-m0213-5p在G2中的表達量較高，novel-m0497-3p在G1中表達量較高。

2.3""鹽脅迫下miRNA差異表達分析

使用edgeR軟件（默認參數(shù)）對miRNA進行差異分析（圖3A）。差異miRNA是以表達量變化2倍以上，并且P值小于0.05作為篩選標準。在鑒定出的1465個miRNA中有59個miRNA差異表達（21個上調(diào)，38個下調(diào)）。在G1"vs"G2檢測出3個差異表達miRNA（1個上調(diào)和2個下調(diào)）；在G1"vs"G3中檢測出26個差異表達miRNA（7個上調(diào)和19個下調(diào)）；在G2"vs"G3中檢測出30個差異表達miRNA（13個上調(diào)和17個下調(diào)）。為了更清晰地揭示3組中差異基因的表達趨勢，篩選并整理每組中排名前10的上調(diào)/下調(diào)miRNA（表3）。在G1"vs"G3中，novel-m0141-5p和novel-"m0098-3p是顯著上調(diào)的差異miRNA，而novel-"m0561-3p和miR7757-y則顯著下調(diào)；G2"vs"G3中，novel-m0098-3p和miR7494-y呈顯著性上調(diào)，而novel-m0628-5p和miR5185-y則顯著下調(diào)。結(jié)合韋恩圖分析（圖3B），得出G1"vs"G2和G1"vs"G3兩組間共有1個差異miRNA，G1"vs"G2和G2"vs"G3兩組間共有1個差異miRNA，G1"vs"G3和G2"vs"G3兩組間共有10個差異miRNA。在G1"vs"G2、G1"vs"G3和G2"vs"G3三組中分別有1、15、19個差異miRNA特異性表達。3個比較組中沒有共同的差異表達miRNA。

2.4""差異靶基因GO功能注釋

為了篩選出白木香三代離體根中與鹽脅迫應(yīng)答及次生代謝物產(chǎn)生相關(guān)的miRNA，使用PatMatch軟件對白木香一代、二代和三代鹽脅迫下離體根的全部miRNA基因進行預(yù)測，共得到靶基因13"617個，靶基因位點23"504個。其中，已知miRNA預(yù)測到的靶基因有13"276個，靶基因位點22"285個；而預(yù)測到的新miRNA靶基因有935個，靶基因位點1"219個。差異表達miRNA通過改變其靶基因的表達模式參與植物脅迫應(yīng)答[18]。因此，對篩選得到的275個差異miRNA靶基因進行GO功能注釋，其按照生物學(xué)過程、分子功能和細胞組分分為3類（圖4），其中生物學(xué)過程涉及的GO條目最多，有19個；分子功能和細胞組分涉及的條目分別為8個和9個。在生物學(xué)過程中主要富集在細胞過程（cellular"process）、代謝過程（metabolic"process）和單一有機體過程（single"organism"process），相關(guān)的靶基因數(shù)目分別為91、88和64；在分子功能方面主要富集在催化活性（catalytic"activity）和結(jié)合（binding），相關(guān)的靶基因數(shù)目分別為81和56；在細胞組成部分主要富集在細胞部分（cell"part）、細胞（cell）和細胞器（organelle），相關(guān)的靶基因數(shù)目分別為44、44和40。

2.5""差異靶基因KEGG富集分析

為了進一步了解差異靶基因的生物學(xué)功能，本研究對各組間差異表達的miRNA的靶基因進行富集分析（圖5）。結(jié)果表明，顯著富集的通路有40條，涉及57條差異表達的miRNA靶基因。其中，涉及代謝通路、植物次生代謝和植物激素信號傳導(dǎo)途徑的靶基因較多，分別是16、11和5個。將參與關(guān)鍵代謝途徑中富集的靶基因與對應(yīng)的miRNA進行聯(lián)合分析及NR注釋（表4），發(fā)現(xiàn)富集到的代謝通路共涉及了6個下調(diào)和4個上調(diào)的差異miRNA。其中下調(diào)的miRNA包括miR477-y、miR5185-y、novel-m0161-3p、novel-"m0628-5p、miR408-z和miR7757-y，而上調(diào)的miRNA包括miR7494-y、novel-m0098-3p、novel-"m0320-3p和miR8020-x。這些miRNA在特定的比較組中具有特異性表達：miR477-y、miR408-z、miR7757-y、novel-m0161-3p在G1"vs"G3中特異性表達，而miR5185-y、miR7494-y、novel-m0628-5p、novel-m0320-3p和miR8020-x則在G2"vs"G3中特異性表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的miRNA靶基因主要涉及糖酵解/糖異生成、苯丙烷類生物合成、植物激素信號傳導(dǎo)、植物病原相互作用等信號通路。而上調(diào)的miRNA靶基因則主要參與類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝等信號通路。

NR注釋結(jié)果顯示，miR8020-x的靶基因與查爾酮黃酮異構(gòu)酶有關(guān)；miR7494-y的2個靶基因分別可能與谷胱甘肽過氧化物酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶有關(guān)；miR5185-y的靶基因與含F(xiàn)-box/WD重復(fù)蛋白相關(guān)；miR477-y的靶基因與lysM"結(jié)構(gòu)域受體樣激酶3相關(guān)；miR7757-y的靶基因與生長因子B3家族蛋白/輔助因子AUX/IAA相關(guān)同工酶1相關(guān)；miR408-z與類生長素反應(yīng)蛋白IAA6相關(guān)；novel-m0628-5p與有絲分裂原活化蛋白激酶2同工酶X1有關(guān)。

3""討論

3.1""可能參與白木香離體根次生代謝產(chǎn)物有關(guān)的miRNA

結(jié)合GO功能注釋、KEGG富集分析及差異miRNA的NR注釋，發(fā)現(xiàn)靶基因主要在細胞過程、代謝過程和催化活化等功能和植物激素信號傳導(dǎo)代謝途徑富集。部分miRNA靶基因可能與白木香次生代謝產(chǎn)物有關(guān)，而另一些miRNA靶基因則可能與白木香離體根響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)。在三代鹽脅迫處理的離體根中共獲得59個差異miRNA，其中，在G1"vs"G2、G1"vs"G3、G2"vs"G3三個比較組中分別有1、7、13個上調(diào)的差異miRNA，有2、19、17個下調(diào)的差異miRNA。上調(diào)差異miRNA隨著脅迫代數(shù)的增加逐漸增加，在G1"vs"G3和G2"vs"G3兩個比較組過渡中下調(diào)差異miRNA反而減少了，這暗示了白木香在連續(xù)多代鹽脅迫下，其基因表達調(diào)控發(fā)生了復(fù)雜的變化。

查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）的表達可以促進植物體內(nèi)黃酮類次生代謝物的合成[19]。本研究中miR8020-x預(yù)測的靶基因evm.model.Scaffold446."31與查爾酮異構(gòu)酶相關(guān)。因此，推測miR8020-x可能通過影響靶基因表達水平來調(diào)節(jié)次生代謝途徑中查爾酮異構(gòu)酶的活性，從而影響類黃酮次生代謝物的合成，但這還需要進一步的實驗驗證。此外，差異基因novel-m0628-5p的靶基因evm."model.Scaffold139.25和evm.model.Scaffold43.133分別與CBSX3和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）相關(guān)，而CBSXs參與擬南芥的組織發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程[20]，MAPKK可能參與沉香中2-苯乙基色酮的生物合成[21]。因此，本研究推測差異基因novel-m0628-5p不僅響應(yīng)白木香離體根鹽脅迫，還可能參與白木香中2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)的合成。

3.2""可能參與白木香離體根抵御鹽脅迫有關(guān)的miRNA

在鹽脅迫環(huán)境下，胡楊（Populus"euphratica）能夠上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶的表達，維持總體抗氧化活性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，特定miRNA如miR7494-y的靶基因evm.model.Scaffold195.28與谷胱甘肽過氧化物酶2相關(guān)，并參與過氧化物酶活性（GO：0004601）、毒素代謝過程（GO：0009404）、激素介導(dǎo)的信號通路（GO：0009755）等過程；其靶基因evm.model.scaffold7.53調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，參與植物信號傳導(dǎo)通路。因此，推測miR7494-y通過調(diào)控靶基因evm.model."Scaffold195.28和靶基因evm.model.scaffold7.53的表達，增強白木香離體根在鹽脅迫下的抗氧化能力和信號傳導(dǎo)，從而提高其耐鹽性。本研究中，差異miR5185-y預(yù)測的靶基因evm.model."Scaffold140.3與F-box相關(guān)，而F-box蛋白家族成員也廣泛參與植物逆境響應(yīng)[23]。因此，本研究推測miR5185-y參與離體根響應(yīng)鹽脅迫。

miR477在茶樹（Camellia"sinensis）中對逆境（如干旱、鹽等）的響應(yīng)起著重要的調(diào)控作用[24]。miR7757參與小麥（Triticum"aestivum）種子萌發(fā)過程[25]。在擬南芥中的研究表明，miR408的過表達能增強其對鹽度、寒冷及氧化應(yīng)激耐受，但提高了對干旱和滲透脅迫敏感性[26]。在本研究中，miR477-y，miR7757-y和miR408-z呈現(xiàn)出差異表達，說明這些miRNA可能與白木香響應(yīng)鹽脅迫有著重要的相關(guān)作用。已知LysM類受體激酶在植物抗逆及防御機制中起關(guān)鍵作用，并且，在戰(zhàn)明慧[27]的研究中，發(fā)現(xiàn)蘋果（Malus"pumila）中的LysM類受體激酶MdLYK15負調(diào)控蘋果對腐皮鐮孢菌的抗性。而本研究發(fā)現(xiàn)，miR477-y的靶基因evm.model.Scaffold8.140與含有l(wèi)ysM結(jié)構(gòu)域的受體樣激酶相關(guān)，該基因參與植物病原體相互作用，并可能通過調(diào)控離體根來增強對鹽脅迫的抵御能力。此外，CBSXs蛋白和AUX/IAA蛋白等也被證實參與植物的脅迫響應(yīng)過程[20，"28]。本研究發(fā)現(xiàn)，差異表達基因miR7757-y的靶基因evm."model.Scaffold24.124調(diào)控植物激素信號傳導(dǎo)中的AUX/IAA蛋白，而miR408-z的靶基因evm.model."Scaffold403.11則調(diào)控生長素反應(yīng)蛋白IAA6，這些調(diào)控作用共同影響了白木香離體根的生長和對鹽脅迫的適應(yīng)能力。綜上所述，本研究推測miR"8020-x和novel-m0628-5p可能參與白木香離體根次生代謝產(chǎn)物的合成，而miR7494-y、miR477-y、miR5185-y、miR7757-y、miR408-z和novel-m0628-"5p則可能參與白木香離體根對鹽脅迫的響應(yīng)。然而，本研究尚未對這些miRNA進行功能驗證及開展深入的作用機制研究。特別是在分析過程中，尚未獲得直接證據(jù)來證實分析中的差異miRNA與“記憶”相關(guān)。因此，后續(xù)將聚焦于對這些差異miRNA的功能驗證，旨在明確它們在鹽脅迫過程中的具體作用機制，并進一步探索它們與脅迫“記憶”特征之間的潛在聯(lián)系。

參考文獻

[1]"ZHAO"S"S，"ZHANG"Q"K，"LIU"M"Y，"ZHOU"H"P，"MA"C"L，"WANG"P"P."Regulation"of"plant"responses"to"salt"stress[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2021，"22（9）："4609.

[2]"MAHAJAN"S，"TUTEJA"N."Cold，"salinity"and"droughtstresses："an"overview[J]."Archives"of"Biochemistry"and"Biophysics，"2005，"444（2）："139-58.

[3]"NAVARRO"J"M，"FLORES"P，"GARRIDO"C，"MARTINEZ"V."Changes"in"the"contents"of"antioxidant"compounds"in"pepper"fruits"at"ripening"stages，"as"affected"by"salinity[J]."Food"Chemistry，"2006，"96："66-73.

[4]"宋方帥."鹽脅迫對連錢草藥效成分累積影響的研究[D]."恩施："湖北民族大學(xué)，"2020.SONG"F"S."Effects"of"salt"stress"on"the"accumulation"of"medicinal"ingredients"of"Glechoma"longituba"（Nakai）"Kupr.[D]."Enshi："Hubei"Minzu"University，"2020."（in"Chinese）

[5]"韓翠婷，"李先寬，"王廣蘋，"馬琳，"張堅."鹽脅迫對杠柳幼苗生長及次生代謝產(chǎn)物積累的影響[J]."西北植物學(xué)報，"2024，"44（2）："280-287.HAN"C"T，""LI"X"K，"WANG"G"P，"MA"L，"ZHANG"J."Growth"and"accumulation"of"the"secondary"metabolites"in"Periploca"sepium"Bunge"seedlings"under"salt"stress[J]."Acta"Botanica"Boreali-Occidentalia"Sinica，"2024，"44（2）："280-287."（in"Chinese）

[6]"MOSLEMI"F"S，"VAZIRI"A，"SHARIFI"G，"GHARECHAHI"J."The"effect"of"salt"stress"on"the"production"of"apocarotenoids"and"the"expression"of"genes"related"to"their"biosynthesis"in"saffron[J]."Molecular"Biology"Reports，"2021，"48（2）："1707-"1715.

[7]"周瑩."鹽脅迫對荊芥生長生理及次生代謝的影響[D]."南京："南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2019.ZHOU"Y."Effects"of"salt"stress"on"the"growth，"physiology"and"secondary"metabolism"of"Schizonepeta"tenuifolia"Briq.[D]."Nanjing："Nanjing"Agricultural"University，"2019."（in"Chinese）

[8]"MORO"B，"CHOROSTECKI"U，"ARIKIT"S，"SUAREZ"I"P，"H?BARTNER"C，"RASIA"R"M，"MEYERS"B"C，"PALATNIK"J"F."Efficiency"and"precision"of"microRNA"biogenesis"modes"in"plants[J]."Nucleic"Acids"Research，"2018，"46（20）："10709-"10723.

[9]"楊航，"李航，"高崎."MicroRNA調(diào)控藥用植物帖類生物合成研究進展[J]."中國現(xiàn)代中藥，"2023，"25（2）："403-412.YANG"H，"LI"H，"GAO"Q."Biosynthesis"and"regulation"of"terpene"metabolites"in"medicinal"plants"by"MicroRNA[J]."Modern"Chinese"Medicine，"2023，"25（2）："403-412."（in"Chinese）

[10]"MA"H"S，"LIANG"D，"SHUAI"P，"XIA"X"L，"YIN"W"L."The"salt-and"drought-inducible"poplar"GRAS"protein"SCL7"confers"salt"and"drought"tolerance"in"Arabidopsis"thaliana[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2010，"61（14）："4011-4019.

• AI"B，"CHEN"Y，"ZHAO"M，"DING"G，"XIE"J，"ZHANG"F."Overexpression"of"miR1861h"increases"tolerance"to"salt"stress"in"rice"（Oryza"sativa"L.）[J]."Genetic"Resources"and"Crop"Evolution，"2021，"68："87-92
• 戴好富，"梅文莉."沉香實用栽培和人工結(jié)香技術(shù)[M]."北京："中國農(nóng)業(yè)出版社，"2015.DAI"H"F，"MEI"W"L."Technology"of"agarwood"trees"cultivation"and"agarwood"artificial"formation[M]."Beijing："China"Agricultural"Press，"2015."（in"Chinese）
• SHIVANAND"P，"ARBIE"N"F，"KRISHNAMOORTHYS，"AHMAD"N."Agatwood-the"fragrant"molecules"of"a"wounded"tree[J]."Molecules，"2022，"27（11）："3386.
• WANG"X，"GAO"B，"LIU"X，"DONG"X，"ZHANG"Z，"FAN"H，"ZHANG"L，"WANG"J，"SHI"S，"TU"P."Salinity"stress"induces"the"production"of"2-（2-phenylethyl）"chromones"and"regulates"novel"classes"of"responsive"genesinvolved"in"signal"transduction"in"Aquilaria"sinensis"calli[J]."BMC"Plant"Biology，"2016，"16（1）："119.
• 李文月."白木香連續(xù)三代離體根鹽脅迫處理及轉(zhuǎn)錄組初步研究[D]."廣州："廣州中醫(yī)藥大學(xué)，"2018.LI"W"Y."The"study"of"NaCl"stress"treatment"and"transcriptome"in"three"consecutive"generations"of"Aquilaria"sinensis"vitro"roots[D]."Guangzhou："Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine，"2018."（in"Chinese）
• 中國科學(xué)院中國植物志委員會."中國植物志："第51卷[M]."北京："科學(xué)出版社，"1995.Chinese"Flora"Committee，"Chinese"Academy"of"Sciences."Flora"of"China："volume"51[M]."Beijing：nbsp;Sciences"Press，"1995."（in"Chinese）
• 國家藥典委員會."中華人民共和國藥典（2015年版）："一部[S]."北京："中國醫(yī)藥科技出版社，"2015："130.Chinese"Pharmacopoeia"Commission."Pharmacopoeia"of"the"People’s"Republic"of"China"（2015）："volume"I[M]."Beijing："China"Medical"Science"Press，"2015："130."（in"Chinese）
• 陳曉婷，"劉軍，"孫翠霞，"林桂芳."草酸脅迫下擬南芥三個差異表達microRNA的分析[J]."農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，"2014，"22（4）："432-439.CHEN"X"T，"LIU"J，"SUN"C"X，"LIN"G"F."Three"differentially"expressed"MicroRNAs"in"Arabidopsis"thaliana"under"the"stress"of"oxalic"acid[J]."Journal"of"Agricultural"Biotechnology，"2014，"22（4）："432-439."（in"Chinese）

[19]"周明，"沈勇根，"朱麗琴，"艾嘯威，"曾璟，"楊洪燁."植物黃酮化合物生物合成、積累及調(diào)控的研究進展[J]."食品研究與開發(fā)，"2016，"37（18）："216-221.ZHOU"M，"SHEN"Y"G，"ZHU"L"Q，"AI"X"W，"ZHEN"J，"YANG"H"Y."Research"progress"on"biosynthesis，"accumulation"and"regulation"of"flavonoids"in"plants[J]."Food"Research"and"Development，"2016，"37（18）："216-221."（in"Chinese）

[20]"OK"S"H，"YOO"K"S，"SHIN"J"S."CBSXs"are"sensor"relay"proteins"sensing"adenosine-containing"1igands"in"Arabidopsis[J]."Plant"Signaling"Behavior，"2012，"7（6）："664-667.

[21]"董先娟."H2O2、MAPKs蛋白激酶對白木香愈傷中2-苯乙基色酮含成的影響[D]."北京："北京中醫(yī)藥大學(xué)，"2018.DONG"X"J."Effects"of"H2O2"and"MAPKs"protein"kinase"on"the"content"of"2-（2-phenylethyl）"chromones"in"the"healing"wounds"of"Aquilaria"sinensis[D]."Beijing："Beijing"University"of"Chinese"Medicine，"2018."（in"Chinese）

[22]"王菲菲，"丁明全，"鄧澍榮，"王美娟，"孫健，"候佩臣，"馬旭君，"張玉紅，"趙楠，"沈昕，"陳少良."胡楊谷胱甘肽過氧化物酶PeGPX基因的克隆及轉(zhuǎn)化植株耐鹽性分析[J]."基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，"2012，"31（3）："231-239.WANG"F"F，"DING"M"Q，"DENG"S"R，"WANG"M"J，"SUN"J，"HOU"P"C，"MA"X"J，"ZHANG"Y"H，"ZHAO"N，"SHEN"X，"CHEN"S"L."Cloning"of"glutathione"peroxidase"gene"PeGPX"from"Populus"euphratica"and"the"salt"tolerance"of"the"transformed"plants[J]."Genomics"and"Applied"Biology，"2012，"31（3）："231-239."（in"Chinese）

[23]"JIA"Q，"XIAO"Z"X，"WONG"F"L，"SUN"S，"LIANG"K"J，"LAM"H"M."Genome-wide"analyses"of"the"soybeanf-box"gene"family"in"response"to"salt"stress[J]."Intemational"Joumal"of"Molecular"Sciences，"2017，"18（4）："818.

[24]"GUO"Y，"ZHAO"S，"ZHU"C，"CHANG"X，"YUE"C，"WANG"Z，"LIN"Y，"LAI"Z."Identification"of"drought-responsive"miRNAs"and"physiological"characterization"of"tea"plant"（Camellia"sinensis"L.）"under"drought"stress[J]."BMC"Plant"Biology，"2017，"17（1）："211.

[25]"趙婷."不同穗發(fā)芽抗性小麥品種種子萌發(fā)過程中miRNAs的鑒定與比較分析[D]."武漢："華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，"2023.ZHANG"T."Identification"and"comparative"analysis"of"miRNAs"during"seed"germination"of"wheat"varieties"with"different"pre-harvest"sprouting"resistance[D]."Wuhan："Huazhong"Agricultural"University，"2023."（in"Chinese）

[26]"MA"C，"BURD"S，"LERS"A."miR408"is"involved"in"abioticstress"responses"in"Arabidopsis[J]."Plant"Journal，"2015，"84（1）："169-"87.

[27]"戰(zhàn)明慧."蘋果LysM類受體激酶基因MdLYK15對腐皮鐮孢菌的響應(yīng)和表達調(diào)控研究[D]."楊凌："西北農(nóng)林科技大學(xué)，"2022."（in"Chinese）ZHAN"M"H."Functional"analysis"and"transcriptional"regulation"of"apple"LysM"receptor-like"kinase"gene"MdLYK15"in"response"to"Fusarium"solani[D]."Yangling："Northwest"Agriculture"and"Forestry"University，"2022."（in"Chinese）

[28]"LI"Y，"WANG"L，"YU"B，"GUO"J，"ZHAO"Y，"ZHU"Y."Expres sion"analysis"of"AUX/IAA"family"genes"in"apple"under"salt"stress[J]."Biochemical"Genetics，"2022，"60（4）："1205-1221.