西番蓮HSF基因家族的全基因組鑒定及成花期對高溫脅迫的響應(yīng)

摘""要：熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat"shock"transcription"factor，"HSF）是重要的調(diào)節(jié)因子，在植物響應(yīng)高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。高溫脅迫對西番蓮成花造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，因此研究HSF調(diào)控西番蓮耐熱性的意義重大。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)在西番蓮基因組上鑒定了26個熱激轉(zhuǎn)錄因子基因，分別命名為PeHSF1～PeHSF26。西番蓮HSF基因編碼蛋白長度為100～1589個氨基酸，分子量為11"544.9～177"157.8"g/mol，理論等電點為4.25～10.80。西番蓮26個HSF基因分布在第1、4、5、6、7、8和9染色體上，分為10個亞群。西番蓮全基因組復(fù)制事件分析結(jié)果表明，ZX01G0033270、ZX01G0052790和ZX01G0052980等5個HSF基因位于重復(fù)片段內(nèi)。西番蓮HSF基因有1～12個內(nèi)含子和2～13個外顯子，都包含HSF-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。利用RNA-seq分析黃果原生種與金陵紫果HSF基因?qū)Ω邷丨h(huán)境的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)ZX01G0002530、ZX01G0052790和ZX01G0121040等基因在花蕾中表達(dá)量差異顯著，并通過RT-qPCR驗證候選HSF基因表達(dá)水平。綜合分析，推測西番蓮響應(yīng)高溫脅迫的最理想的候選HSF基因為ZX01G0121040。這些結(jié)果有助于了解HSF在西番蓮成花期響應(yīng)高溫脅迫過程中的功能，為西番蓮耐高溫的遺傳改良提供重要基因資源和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西番蓮；高溫脅迫；熱激轉(zhuǎn)錄因子；同源基因；成花；轉(zhuǎn)錄組測序；候選基因中圖分類號：Q945.78；S667.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Genome-wide"Identification"of"HSF"Gene"Family"and"Their"Response"to"Hot"Ambient"Temperature"During"Flower"Development"in"Passion"Fruit"（Passiflora"edulis）

WU"Yanyan1*，"LIU"Jieyun1，"ZHOU"Junniu1，"TIAN"Qinglan1，"HUANG"Weihua1，"ZHU"Chenli2，"MOU"Haifei1*

1."Biotechnology"Research"Institute，"Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China;"2."Guangxi"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanning，"Guangxi"530007，"China

Abstract："Heat"shock"transcription"factor"（HSF）"is"an"important"regulatory"factor"that"plays"a"crucial"role"in"plant"response"to"hot"ambient"temperature"（HAT）."High"temperature"stress"has"a"serious"negative"impact"on"the"flowering"of"passion"fruit，"therefore，"studying"the"regulation"of"heat"tolerance"by"HSF"in"passion"fruit"is"of"great"significance."In"this"study，"we"identified"26"HSF"genes"on"the"genome"of"passion"fruit"using"bioinformatics"technology，"named"PeHSF1-"PeHSF26."The"genes"could"encode"proteins"of"100-1589"amino"acids，"with"molecular"weight"11"544.9-177"157.8"g/mol，"and"a"theoretical"isoelectric"point"of"4.25-10.80."The"26"genes"were"distributed"on"chromosomes"1，"4，"5，"6，"7，"8"and"9，"and"were"divided"into"10"subpopulations."The"analysis"of"the"whole"genome"replication"event"showed"that"ZX01G0033270，"ZX01G0052790"and"ZX01G0052980"were"located"within"the"genome"duplications."The"genes"contained"1-12"introns"and"2-13"exons，"all"contained"HSF-DNA"binding"domains."RNA-seq"analysis"of"Huangguo"original"species"and"Jinlingziguo"HSF"genes"to"HAT"revealed"that"there"were"significant"differences"in"the"expression"levels"of"genes，"including"ZX01G0002530，"ZX01G0052790"and"ZX01G0121040"in"flower"buds."The"expression"levels"of"candidate"HSF"genes"were"validated"by"RT-qPCR."Based"on"comprehensive"analysis，"it"is"supposed"that"the"most"ideal"candidate"HSF"gene"for"passion"flower"response"to"high"temperature"stress"was"ZX01G0121040."The"results"would"contribute"to"understand"the"function"of"HSF"in"response"to"high"temperature"stress"during"the"flowering"of"passion"fruit，"and"provide"important"genetic"resources"and"theoretical"basis"for"genetic"improvement"of"passion"fruit.

Keywords："passion"fruit;"hot"ambient"temperature;"heat"shock"factor;"orthologous"gene;"flowering;"RNA"sequencing;"candidate"gene

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.004

栽培種西番蓮（又名百香果）為草質(zhì)藤本植物，其果實具有芳香氣味，且富含糖類、維生素及鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)元素，營養(yǎng)價值極高，深受消費者青睞。溫度是影響植物生長、發(fā)育的重要外界因素之一。NAVE等[1]研究表明在長日照條件下西番蓮品種Passion"Dream（黃果西番蓮與紫果西番蓮的雜交種）成花最佳溫度為22"℃/"16"℃（日/夜），溫度高于28"℃環(huán)境下任何光周期改變都不會觀察到西番蓮成花。這表明西番蓮成花期對高溫環(huán)境的耐受性較差，從而造成減產(chǎn)，是影響西番蓮生產(chǎn)的重要問題。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat"shock"transcription"factor，"HSF）是一類調(diào)控植物熱激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。熱激轉(zhuǎn)錄因子基因序列由5個部分組成：（i）DNA結(jié)合區(qū)域DBD；（ii）寡聚化結(jié)構(gòu)域OD；（iii）核定位信號NLS；（iv）核輸出信號NES；（v）C末端激活結(jié)構(gòu)域AHA[2]，其中DBD是所有結(jié)構(gòu)域中最保守的區(qū)域，能夠識別熱反應(yīng)基因啟動子的順式元件[3]。PELHAM等[4]首次在酵母中鑒定了熱激轉(zhuǎn)錄因子。隨著多個物種高質(zhì)量參考基因組公布，研究人員已經(jīng)在擬南芥（21）、水稻（25）、番茄（26）、甘藍(lán)（52）、辣椒（25）、胡蘿卜（35）、葡萄（19）、柑橘（18）、蘋果（23）、草莓（17）、楊樹（31）、大豆（52）、高粱（24）、玉米（22）、小麥（61）、芝麻（30）、木薯（32）等鑒定了HSF基因[2，"5]。最近，YU等[5]利用111種植物全基因組，共鑒定了2950個HSF基因，構(gòu)建了植物HSF基因數(shù)據(jù)庫（http：//hsfdb.bio2db.com/），這為人們研究植物HSF基因功能提供了便利。前人研究表明，熱激蛋白及熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物成花過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。在擬南芥中，熱激蛋白HSP90與關(guān)鍵開花調(diào)節(jié)因子LFY、SOC1和AGL24相互作用，促進(jìn)開花[6]。熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA2與擬南芥對高溫的傳代記憶，促使植物提前開花[7]。在番茄中，熱激轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花蕾對高溫的響應(yīng)[8]。因此，利用西番蓮基因組鑒定熱激轉(zhuǎn)錄因子，揭示在高溫脅迫環(huán)境中其對成花的影響十分必要。

2021年，MA等[9]成功組裝了高質(zhì)量西番蓮基因組，本研究利用生物信息學(xué)方法從西番蓮基因組中鑒定了HSF家族成員，構(gòu)建了模式植物及重要耐熱植物的HSF系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了西番蓮HSF基因在花蕾、葉片等組織部位的表達(dá)模式，推測可能影響西番蓮成花期耐熱性基因，本研究將促進(jìn)人們對西番蓮適應(yīng)高溫環(huán)境機(jī)制的認(rèn)知，為西番蓮耐高溫育種提供重要基因資源和理論基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

2022年4月2日，高溫耐受西番蓮品種金陵紫果（ZG）和敏感品種黃果原生種（HG）種植于廣西南寧市美麗南方試驗地高溫處理設(shè)施內(nèi)。

1.2""方法

1.2.1""高溫處理""用鋼管制成長（10.0"m）×寬（2.0"m）×高（4.0"m）的生長棚框架，固定于溝面，于高溫處理開始時通過在生長棚框架四周覆蓋塑料薄膜（透光率95%以上）進(jìn)行升溫，大棚兩側(cè)上部各均勻留出20"cm高的空隙，用于氣體交換。高溫處理結(jié)束后將薄膜升起，后期管理及田間小氣候與對照一致。熱處理前將增溫棚處于全部打開狀態(tài)，與對照處于同一自然環(huán)境條件，于植株二級蔓抽出開始高溫?zé)崦{迫處理，將增溫棚頂部和側(cè)面膜放下，并實時監(jiān)測棚內(nèi)溫度，直至達(dá)到高溫設(shè)定值，即熱脅迫處理日最高溫度38～45"℃，日平均溫度30～31"℃，日溫度≥35"℃持續(xù)時間4～6"h；自然對照日最高溫度lt;37"℃，日平均溫度lt;28.5"℃，日溫度≥35"℃持續(xù)時間lt;2"h。40"d后結(jié)束熱處理。處理結(jié)束后，在中午12：00取樣，包括花蕾、卷須、葉片和莖（圖1）。

1.2.2""西番蓮"HSF"家族成員鑒定""基于熱激轉(zhuǎn)錄因子的特異氨基酸序列（Pfam："PF00447），在紫果西番蓮基因組數(shù)據(jù)庫（https：//db.cngb.org/"search/assembly/CNA0017758/）下載蛋白序列，使用PfamScan軟件將西番蓮的蛋白序列在Pfam數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，鑒定西番蓮HSF家族成員。采用相同方法，在水稻（Oryza"sativa"L."japonica，"http：//rice.uga.edu/）、擬南芥（Arabidopsis"thaliana，"https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）、番茄（Solanum"lycopersicum，"http：//plants.ensembl.org/"Solanum_lycopersicum/Info/Index）、單瓣茉莉花（Jasminum"sambac，"https：//ngdc.cncb.ac.cn/gwh/"Assembly/22882/show）、木薯（Manihot"esculenta，"https：//cbi.gxu.edu.cn/yxguo/DockingDB/download_"files/data/）、玉米（Zea"mays，"http：//plants.ensembl."org/Zea_mays/Info/Index）數(shù)據(jù)庫中鑒定6個物種的HSF家族成員。

1.2.3""西番蓮"HSF"理化性質(zhì)預(yù)測""使用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測西番蓮HSF蛋白的長度、分子量和等電點。

1.2.4""西番蓮與6個物種的HSF系統(tǒng)進(jìn)化樹分析""將西番蓮、水稻、擬南芥、番茄、單瓣茉莉花、木薯（單倍型A和B基因組）和玉米的HSF成員的蛋白序列合并輸入到MUSCLE進(jìn)行全局比對，比對結(jié)果使用"MEGA"7"程序構(gòu)建"maximal"likelihood似然樹，設(shè)置bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次，最后輸入iTOL在線軟件（https：//itol.embl.de/）進(jìn)行美化。

1.2.5""西番蓮"HSF"基因結(jié)構(gòu)與共線性分析""基因結(jié)構(gòu)：從GFF文件中提取HSF基因的外顯子、內(nèi)含子位置信息，從Pfam注釋結(jié)果中提取motif信息，使用GSDS程序繪制如下基因結(jié)構(gòu)及motif分布圖。共線性分析：首先BLAST比對所有蛋白序列，設(shè)定閾值Elt;1e-5，最小覆蓋度大于40%。比對結(jié)果輸入MCScanX程序，參數(shù)默認(rèn)，輸出全基因組范圍內(nèi)的共線性區(qū)塊，并標(biāo)注位于這些共線性區(qū)塊內(nèi)的目標(biāo)基因家族。最后，用Circos在線軟件（https：//circos.ca/intro/tabularvisualiza tion/）繪圖。

1.2.6""mRNA提取""利用TRIzol?"Reagent試劑盒提取total"RNA（Invitrogen，"USA），具體流程按照說明書操作。OligodT富集mRNA，片段化mRNA，反轉(zhuǎn)合成cDNA和連接adaptor參照前期發(fā)表文獻(xiàn)的試驗操作進(jìn)行[10]。

1.2.7""轉(zhuǎn)錄組測序""采用Illumina"NovaSeq6000測序平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建Illumina"PE文庫進(jìn)行2×150"bp測序，通過fastp軟件對獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，包括：（1）堿基錯誤率分布統(tǒng)計；（2）堿基含量分布統(tǒng)計。將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)，即clean"data（reads），利用Hisat2軟件與參考基因組比對，參考基因組來自https：//db."cngb.org/search/assembly/CNA0017758/。隨后，獲得mapped"reads，同時利用RSeQC-2.3.6軟件對轉(zhuǎn)錄組測序的比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估，主要包括測序飽和度、基因覆蓋度、reads在參考基因組不同區(qū)域分布以及reads在不同染色體分布分析。使用StringTie軟件對每個樣本進(jìn)行拼接，最終合并在一起。

1.2.8""轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析""使用RSEM軟件（http：//"deweylab.github.io/RSEM/）分別對基因/轉(zhuǎn)錄本的整體表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，以便后續(xù)分析不同樣本間基因/轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)情況，定量指標(biāo)為TPM（transcripts"per"million"reads）?；虮磉_(dá)量分析獲得基因/轉(zhuǎn)錄本的read"counts數(shù)量后，采用DESeq2對多樣本項目進(jìn)行樣本間或組間基因/轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析，鑒定出差異表達(dá)的基因/轉(zhuǎn)錄本，設(shè)置參數(shù)：P"adjustlt;0.05并且|log2FC|≥1。

利用聚類熱圖在線軟件（https：//cloud."oebiotech.cn/task/detail/heatmap/）展示西番蓮HSF基因的表達(dá)量及相關(guān)性，數(shù)據(jù)歸一化方式為row。

1.2.9""RT-qPCR分析""采用Trizol法提取金陵紫果和黃果原生種花蕾的總RNA，利用HiScript"Ⅱ"Q"RT"SuperMix"for"qPCR（+gDNA"wiper）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR反應(yīng)采用Universal"SYBR"qPCR"Master法，反應(yīng)體系（20"μL）：10"μL"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix，0.5"μL上游引物，0.5"μL下游引物，1"μL"cDNA，8"μL"ddH2O。反應(yīng)條件為94"℃預(yù)變性3"min；94"℃變性15"s，58"℃退火15"s，72"℃延伸20"s，40個循環(huán)；設(shè)置3個重復(fù)。熒光定量PCR相關(guān)引物見表1。

2""結(jié)果與分析

2.1""西番蓮及6種植物的"HSF"基因家族成員鑒定

基于HSF保守結(jié)構(gòu)域（PF00447）氨基酸序列信息，利用PfamScan軟件在西番蓮、擬南芥、水稻、番茄、單瓣茉莉花、木薯和玉米中分別檢測到26、24、25、26、23、63個（單倍型A基因組32個，單倍型B基因組31個）、玉米26個。西番蓮HSF基因分布在第1、4、5、6、7、8、9染色體上，其中第1染色體上的HSF基因數(shù)量最多，為9個，而第2和3染色體上未鑒定出HSF基因，說明HSF基因在西番蓮基因組上分布不均勻。西番蓮的26個HSF基因平均長度為3062"bp，其中ZX06G0012300長度最小，為1073"bp；ZX01G0121040的長度最大，為12"613"bp；13個HSF基因分布在正義鏈上，13個在反義鏈上（表2）。依據(jù)西番蓮26個HSF基因在基因組上的位置，將其命名為PeHSF1～PeHSF26。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，西番蓮HSF基因編碼的氨基酸數(shù)量為100～1589，分子量為11"544.9～177"157.8"g/mol，預(yù)測等電點為4.25～10.80（表2）。

2.2""西番蓮及6種植物的"HSF"基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于西番蓮的26個HSF蛋白的氨基酸序列，利用MUSCLE軟件進(jìn)行全局比對，比對結(jié)果輸入MEGA"7構(gòu)建最大似然樹。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，將26個HSF基因分為10個亞群體，其中亞群Ⅱ包含5個HSF基因，亞群Ⅲ僅有1個HSF基因（圖2A）。為了解不同物種間HSF基因的進(jìn)化關(guān)系，基于西番蓮等7個物種213個HSF蛋白構(gòu)建了進(jìn)化樹，共分為11個亞群（圖2B）。木薯是熱帶地區(qū)廣泛種植的作物，其基因組大小為687"Mb[11]，包含32個HSF基因。單瓣茉莉花是一種常綠植物，在夏季38"℃以上的高溫也可開花[12]，因此，了解茉莉花耐高溫脅迫分子機(jī)有助于預(yù)測西番蓮HSF基因的功能。

2.3""西番蓮基因組復(fù)制事件分析

利用26個HSF基因分析片段重復(fù)事件，結(jié)果表明有4個大的基因組重復(fù)區(qū)，包含5個HSF基因，分別為ZX01G0033270、ZX01G0052790、ZX01G0052980、ZX01G0116590和ZX08G0017710。具體信息是：（i）第1染色體上37"846"331～37"847"969"bp對應(yīng)第1染色體上222"639"747～222"641"414"bp；（ii）第1染色體上52"338"517～52"340"350"bp對應(yīng)第1染色體上52"437"222～52"439"067"bp；（iii）第1染色體上37"846"331～37"847"969"bp對應(yīng)第8染色體上47"243"875～47"247"554"bp；（iv）第1染色體上222"639"747～222"641"414"bp對應(yīng)第8染色體上47"243"875～47"247"554"bp（表3，圖3）。

由于西番蓮基因組共線性區(qū)域的HSF僅有5個，無法推測全基因組復(fù)制（whole"genome"duplication，"WGD）事件，因此使用MCScanX軟件鑒定處于基因組共線性區(qū)塊內(nèi)4對同源基因，計算每個同源基因?qū)Φ腒a、Ks、Ka/Ks值，Ks值越高表明基因組復(fù)制速度越快。一般認(rèn)為Ks=1.5處為雙子葉植物共同經(jīng)歷的六倍化事件（距今約110百萬年），隨后西番蓮經(jīng)過2次獨立的全基因組復(fù)制事件WGD-1和WGD-2（圖4）。

2.4""西番蓮HSF基因的結(jié)構(gòu)及保守基序

通過基因結(jié)構(gòu)分析可以了解西番蓮HSF基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系。本研究對26個HSF基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，從內(nèi)含子-外顯子組成來看，PeHSF基因有1～12個內(nèi)含子和2～13個外顯子（圖5）。26個西番蓮HSF基因均含有DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，這與前人研究結(jié)果一致[3]。ZX01G0121040除了含有DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域之外，還有SNARE、Syntaxin"2、PPR、PPR1、PPR2結(jié)構(gòu)域，ZX05G0014520還含有RCCR結(jié)構(gòu)域，ZX04G0002290含有SurE結(jié)構(gòu)域。

2.5""西番蓮HSF基因在成花期對高溫的反應(yīng)

由于高溫敏感品種黃果原生種和高溫耐受品種金陵紫果在夏天高溫環(huán)境中成花差異（圖6），因此，可以2個品種的葉片（leaf，L）、卷須（tendril，T）、花蕾（flower，F(xiàn)）和莖（stem，S）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，找出影響西番蓮耐熱差異的基因。

將高溫處理后采集的24個樣品測序，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后有效讀長（clean"reads）數(shù)為41"725"898～52"997"150條，有效堿基數(shù)為6"058"511"181～7"620"631"463"bp，測序堿基正確率在99.9%（Q30）以上的堿基占總堿基的百分比為92.34%～93.70%（附表1）。

將質(zhì)控后有效讀長與西番蓮參考基因組比對（https：//db.cngb.org/search/assembly/CNA0017758/），能定位到基因組上的有效讀長數(shù)為30"464"977～"41"566"866，"比對率為72.47%～78.63%，平均比對率為76.72%；在參考序列上有多個比對位置的有效讀長數(shù)為1"706"379～3"969"640，比對率為3.75%～9.31%；在參考序列上有唯一比對位置的clean"reads數(shù)目為28"682"624～37"830"849，比對率為67.86%～72.20%（附表2）。

利用RSEM軟件分別對基因和新轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，定量指標(biāo)為TPM（transcripts"per"million），24個樣品的基因表達(dá)量見附表3?；诨虮磉_(dá)量，分析24個樣本間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示樣本生物學(xué)重復(fù)性好。通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)重復(fù)間的樣本間相似性高（圖7）。

采用DESeq2軟件進(jìn)行組間基因表達(dá)量差異分析，獲得2組間發(fā)生差異表達(dá)的基因（DEGs）。在接種0"h時，HG與ZG的花蕾間的差異表達(dá)基因共有6077個，其中3363個上調(diào)基因，2714個下調(diào)基因；卷須間的差異表達(dá)基因共有1923個，其中1091個上調(diào)基因，832個下調(diào)基因；莖稈間的差異表達(dá)基因共有1833個，其中1023個上調(diào)基因，860個下調(diào)基因；葉片間的差異表達(dá)基因共有1592個，其中848個上調(diào)基因，744個下調(diào)基因（圖8，附表4）。

分析26個HSF基因在紫果和黃果原生種中的表達(dá)量（TPM），結(jié)果表明ZX01G0002530、ZX01G0052790、ZX01G0052980、ZX01G0121040、ZX05G0014510、ZX05G0014520、ZX06G0002180、ZX07G0010660在花蕾的表達(dá)量差異顯著（表4，圖9）。與黃果原生種相比，ZX05G0014520、ZX08G0002060、ZX01G0002530在金陵紫果的葉片、卷須和莖稈中表達(dá)量上調(diào)；雖然ZX07G0010660、ZX01G0121040和ZX01G0052790在葉片、花蕾和莖稈中表達(dá)量下調(diào)，但是僅在花蕾中達(dá)到顯著性差異，且ZX01G0121040基因的表達(dá)水平高（表4）。

由于ZX01G0052980和ZX01G0055790之間以及ZX05G0014510和ZX05G0014520之間的序列高度相似，不利于設(shè)計引物，本研究利用RT-"qPCR技術(shù)檢測ZX01G0002530、ZX01G0052790、ZX01G1G0121040、ZX04G0012630、ZX05G0104150、ZX006G0002180、ZX09G0012300、ZX07G0010660、ZX08G00002060和ZX08G0024160在黃果原生種和金陵紫果花蕾的表達(dá)量（圖10）。RT-qPCR分析結(jié)果表明，10個HSF基因在黃果原生種與金陵紫果的表達(dá)水平與RNA-seq分析的結(jié)果一致。值得注意的是，僅有ZX06G0012300在金陵紫果的表達(dá)水平高于黃果原生種。

3""討論

熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子是植物熱脅迫防御響應(yīng)中的中心調(diào)節(jié)子。目前，研究人員在水稻、擬南芥和番茄中發(fā)現(xiàn)"HSF"基因參與調(diào)控高溫環(huán)境響應(yīng)。GUO等[13]在擬南芥和水稻基因組中分別鑒定出21個和25個HSF基因，YANG等[14]在番茄（Solanum"lycopersicum）中鑒定出26個HSF基因。本研究中，在擬南芥、水稻和番茄基因組中分別鑒定到24、25、26個HSF基因，與GUO等[13]鑒定的擬南芥HSF基因數(shù)量有差異。YU等[5]構(gòu)建了111種植物HSF耐熱基因數(shù)據(jù)庫，其中擬南芥基因組含有24個HSF基因，這與本研究結(jié)果一致。根據(jù)Ensembl"Plants數(shù)據(jù)庫收錄的信息，水稻、擬南芥和番茄基因組大小分別為373.8、119.7、827.4"Mb。雖然番茄基因組大小是擬南芥的6.9倍，但它們的HSF基因數(shù)量僅相差2個，這表明HSF基因可能在植物適應(yīng)高溫環(huán)境中功能保守。因此，借鑒水稻、擬南芥和番茄的HSF基因功能，推測西番蓮HSF基因作用。

在擬南芥中，熱激轉(zhuǎn)錄因子基因HsfA1a（At4g17750）是響應(yīng)熱脅迫的主要調(diào)控因子[15-16]。在本研究中，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明西番蓮ZX01G0121040與HsfA1a親緣關(guān)系較近，屬于亞群Ⅳ。此外，該亞群還包括擬南芥其他4個HSF基因，分別為At1g67970、At1g32330、At3g02990和At5g16820。At1g32330（HSFA1d）和At5g16820（HSFA1b）屬于HSFA1s亞家族，它們是擬南芥熱形態(tài)建成所必需的[17]，而AT3G02990（HSFA1e）似乎對熱響應(yīng)不那么重要[16]。此外，LOC_Os03g12370（OsHsfA9）和LOC_Os03g63750（OsHsfA1a）也屬于亞群Ⅳ，在水稻熱脅迫時表達(dá)量顯著上調(diào)[18]。

我們發(fā)現(xiàn)西番蓮經(jīng)歷3次全基因組復(fù)制事件，這與ZHENG等[19]的研究結(jié)果一致。在西番蓮基因組中，有5個HSF基因位于基因組復(fù)制區(qū)域，其中ZX01G0033270、ZX01G0116590和ZX08G0017710聚類在亞群Ⅲ。亞群Ⅲ含有擬南芥HSF基因：At3g51910（HSFA7a）、At3g63350（HSFA7b）和At3g22830，研究表明NAC019結(jié)合HSFA1b、HSFA6b、HSFA7a和HSFC1的啟動子而增強(qiáng)了擬南芥耐熱性[20]。HSFA7b通過調(diào)節(jié)擬南芥中乙烯的生物合成和信號傳導(dǎo)來控制莖尖分生組織的溫度變化[21]。此外，亞群Ⅲ還包含水稻HSF基因LOC_Os03g58160、LOC_Os07g08140、LOC_"Os03g53320、LOC_Os03g53340、LOC_Os10g28340、LOC_Os03g06630（HTG3），其中HTG3通過調(diào)節(jié)JAZ參與水稻的耐熱性[22]。ZX01G0052790和ZX01G0052980聚類在一起，屬于亞群Ⅺ，該亞群包含有2個擬南芥基因：At2g41690（HSFB3）和At4g36990（HsfB1）。研究表明，RCF3正調(diào)控HSFA1e，HSFA3、HSFA9、HSFB3和DREB2C的表達(dá)增加擬南芥的耐熱性[23]。雖然HsfB1和HsfB2b抑制HsfA2、HsfA7a、HsfB1和HsfB2b表達(dá)，但是正調(diào)控擬南芥的耐熱性[24]。

利用RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)有12個HSF基因在黃果原生種和金陵紫果花蕾的表達(dá)量差異顯著，進(jìn)化樹分析表明ZX01G0121040與擬南芥的HsfA1a基因親緣關(guān)系較近，HsfA1a正調(diào)控?zé)崦{迫[15-16]。ZX01G0002530、ZX01G0052790、ZX01G0052980、ZX05G0014510和ZX05G0014520屬于亞群Ⅺ，且ZX01G0052790和ZX05G0014510表達(dá)模式相似。雖然ZX01G0052790和ZX01G0052980基因序列具有共線性，但是它們在西番蓮花蕾響應(yīng)高溫時的表達(dá)量趨勢相反。HSFB3和HsfB1位于亞群Ⅺ內(nèi)，均與擬南芥的耐熱性相關(guān)[23-24]。ZX04G0012630、ZX06G0002180和ZX08G0024160屬于亞群Ⅶ，該亞群中At4g18870參與調(diào)控擬南芥的耐熱性[25]。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，ZX06G0002180與At4g18870的親緣關(guān)系更近。ZX07G0010660屬于亞群Ⅹ，同源基因At4g11660（HsfB2b）正調(diào)控擬南芥的耐熱性[24]。ZX08G0002060屬于亞群Ⅳ，其同源基因At3g22830（HSFA6b）參與ABA介導(dǎo)的耐熱性[26]，另一同源基因HSFA7A可能參與了擬南芥對高溫的適應(yīng)[20，"24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，西番蓮HSF基因除了含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外，ZX01G0121040還包含有PPR、Syntaxin"2和SNARE等結(jié)構(gòu)域。PPR（pentatr icopeptide"repeat）是一種三角狀五肽重復(fù)蛋白，屬于植物中最大的核編碼蛋白家族。PPR蛋白參與植物生長發(fā)育和響應(yīng)脅迫反應(yīng)[27-28]。Qa-SNARE最早在哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)，命名為突觸融合蛋白（syntaxin），其在與植物體生長發(fā)育、抗病反應(yīng)和非生物脅迫中起著重要功能[29-30]。此外，ZX05G0014520還含有RCCR結(jié)構(gòu)域，RCCR是催化葉綠素降解代謝反應(yīng)的主要酶類[31]。這些研究結(jié)果表明，西番蓮HSF基因可能在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中也具有重要功能。

4""結(jié)論

高溫脅迫嚴(yán)重影響了西番蓮的成花，鑒定耐熱基因是提高西番蓮適應(yīng)極端溫度的一個有效方法。在本研究中，我們在西番蓮基因組中鑒定了26個HSF基因，并分析了HSF成員的理化性質(zhì)、進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)、共線性和全基因組復(fù)制事件。利用RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)ZX01G0002530、ZX01G0052790、ZX01G0052980、ZX01G0121040、ZX04G0012630、ZX05G0014510、ZX05G0014520、ZX06G0002180、ZX06G0012300、ZX07G0010660、ZX08G0002060、ZX08G0024160在金陵紫果與黃果原生種花蕾的表達(dá)量差異顯著，RT-qPCR分析結(jié)果驗證了RNA-seq的結(jié)果，并推測ZX01G0121040是西番蓮成花期響應(yīng)高溫脅迫的重要基因。本研究結(jié)果將為西番蓮成花耐熱性的遺傳改良提供重要的基因資源和理論技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

[1]"NAVE"N，"KATZ"E，"CHAYUT"N，"GAZIT"S，"SAMACH"A."Flower"development"in"the"passion"fruit"Passiflora"edulis"requires"a"photoperiod-induced"systemic"graft-transmissible"signal[J]."Plant"Cell"Environ，"2010，"33（12）："2065-2083.

[2]"田尉婧，"殷學(xué)仁，"李鮮，"陳昆松．熱激轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物逆境響應(yīng)研究進(jìn)展[J]."園藝學(xué)報，"2017，"44（1）："179-192.TIAN"Y"J，"YIN"X"R，"LI"X，"CHEN"K"S."Regulation"of"stress"responses"by"heat"stress"transcription"factors"（Hsfs）"in"plants[J]."Acta"Horticulturae"Sinica，"2017，"44（1）："179-192."（in"Chinese）

• GOMEZ-PASTOR"R，"BURCHFIEL"E"T，"THIELE"D"J."Regulation"of"heat"shock"transcription"factors"and"their"roles"in"physiology"and"disease[J]."Nature"Reviews"Molecular"Cell"Biology，"2018，"19（1）："4-19.
• PELHAM"H"R，"SORGER"P"K."Yeast"heat"shock"factor"is"an"essential"DNA-binding"protein"that"exhibits"temperature-"dependent"phosphorylation[J]."Cell，"1988，"54（6）："855-"864.
• YU"T，"BAI"Y，"LIU"Z，"WANG"Z"Y，"YANG"Q"H，"WU"T，"FENG"S"Y，"ZHANG"Y，"SHEN"S"Q，"LI"Q，"GU"L"Q，"SONG"X"M."Large-scale"analyses"of"heat"shock"transcription"factors"and"database"construction"based"on"whole-genome"genes"in"horticultural"and"representative"plants[J]."Horticulture"Research，"2022，"9："uhac035.
• MARGARITOPOULOU"T，"KRYOVRYSANAKI"N，"MEGKOULA"P，"PRASSINOS"C，"SAMAKOVLI"D，"MILIONI"D，"HATZOPOULOS"P."HSP90"canonical"content"organizes"a"molecular"scaffold"mechanism"to"progress"flowering[J]."The"Plant"Journal，"2016，"87（2）："174-187.

[7]"LIU"J"Z，"FENG"L"F，"GU"X"T，"DENG"X，"QIU"Q，"LI"Q，"ZHANG"Y"Y，"WANG"M"Y，"DENG"Y"W，"WANG"E"T，"HE"Y"K，"B?URLE"I，"LI"J"M，"CAO"X"F，"HE"Z"H."An"H3K27me3"demethylase-HSFA2"regulatory"loop"orchestrates"transgenerational"thermomemory"in"Arabidopsis[J]."Cell"Research，"2019，"29（5）："379-390.

[8]"LI"H"W，"LIU"Y，"LI"Y"Y，"YANG"Q"Q，"YANG"T"L，"ZHOU"Z，"LI"Y"F，"ZHANG"N，"LYU"Y"Q，"ZHU"Y"F，"LIN"T."Heat"shock"transcription"factors"regulate"thermotolerance"gene"networks"in"tomato"（Solanum"lycopersicum）"flower"buds[J]."Horticultural"Plant"Journal，"2025，"11（1）："199-210.

[9]nbsp;MA"D"N，"DONG"S"S，"ZHANG"S"C，"WEI"X"Q，"XIE"Q"J，"DING"Q"S，"XIA"R，"ZHANG"X"T."Chromosome-level"reference"genome"assembly"provides"insights"into"aroma"biosynthesis"in"passion"fruit"（Passiflora"edulis）[J]."Molecular"Ecology"Resources，"2021，"21（3）："955-968.

[10]"WU"Y"Y，"HUANG"W"H，"TIAN"Q"L，"LIU"J"Y，"XIA"X"Z，"YANG"X"H，"MOU"H"F."Comparative"transcriptomic"analysis"reveals"the"cold"acclimation"during"chilling"stress"in"sensitive"and"resistant"passion"fruit"（Passiflora"edulis）"cultivars[J]."PeerJ，"2021，"9："e10977.

[11]"XU"X"D，"ZHAO"R"P，"XIAO"L，"LU"L，"GAO"M，"LUO"Y"H，"ZHOU"Z"W，"YE"S"Y，"QIAN"Y"Q，"FAN"B"L，"SHANG"X，"SHI"P，"ZENG"W，"CAO"S，"WU"Z，"YAN"H，"CHEN"L"L，"SONG"J"M."Telomere-to-telomere"assembly"of"cassava"genome"reveals"the"evolution"of"cassava"and"divergence"of"allelic"expression[J]."Horticulture"Research，"2023，"10（11）："uhad200.

[12]"QI"X"Y，"WANG"H"D，"CHEN"S"S，"FENG"J，"CHEN"H"J，"QIN"Z，"BLILOU"I，"DENG"Y"M."The"genome"of"single-petal"jasmine"（Jasminum"sambac）"provides"insights"into"heat"stress"tolerance"and"aroma"compound"biosynthesis[J]."Front"Plant"Science，"2022，"13："1045194.

[13]"GUO"J"K，"WU"J，"JI"Q，"WANG"C，"LUO"L，"YUAN"Y，"WANG"Y"H，"WANG"J."Genome-wide"analysis"of"heat"shock"transcription"factor"families"in"rice"and"Arabidopsis[J]."Journal"of"Genetics"and"Genomics，"2008，"35（2）："105-118.

[14]"YANG"X"D，"ZHU"W"M，"ZHANG"H，"LIU"N，"TIAN"S"B."Heat"shock"factors"in"tomatoes："genome-wide"identification，"phylogenetic"analysis"and"expression"profiling"under"development"and"heat"stress[J]."PeerJ，"2016，"4："e1961.

[15]"YOSHIDA"T，"OHAMA"N，"NAKAJIMA"J，"KIDOKORO"S，"MIZOI"J，"NAKASHIMA"K，"MARUYAMA"K，"KIM"J"M，"SEKI"M，"TODAKA"D，"OSAKABE"Y，"SAKUMA"Y，"SCH?FFL"F，"SHINOZAKI"K，"YAMAGUCHI-SHINOZAKI"K."Arabidopsis"HsfA1"transcription"factors"function"as"the"main"positive"regulators"in"heat"shock-responsive"gene"expression[J]."Molecular"Genetics"and"Genomics，"2011，"286（5/6）："321-332.

[16]"LIU"H"C，"LIAO"H"T，"CHARNG"Y"Y."The"role"of"class"A1"heat"shock"factors"（HSFA1s）"in"response"to"heat"and"other"stresses"in"Arabidopsis[J]."Plant，"Cell"amp;"Environment，"2011，"34（5）："738-751.

[17]"TAN"W"R，"CHEN"J"H，"YUE"X"L，"CHAI"S"L，"LIU"W，"LI"C"L，"YANG"F，"GAO"Y"F，"GUTIéRREZ"RODRíGUEZ"L，"RESCO"D"V，"ZHANG"D"W，"YAO"Y"N."The"heat"response"regulators"HSFA1s"promote"Arabidopsis"thermomorphogenesis"via"stabilizing"PIF4"during"the"day[J]."Science"Advances，"2023，"9（44）："eadh1738.

[18]"MITTAL"D，"CHAKRABARTI"S，"SARKAR"A，"SINGH"A，"GROVER"A."Heat"shock"factor"gene"family"in"rice："genomic"organization"and"transcript"expression"profiling"in"response"to"high"temperature，"low"temperature"and"oxidative"stresses[J]."Plant"Physiology"and"Biochemistry，"2009，"47（9）："785-795.

[19]"ZHENG"Y"Y，"CHEN"L"H，"FAN"B"L，"XU"Z，"WANG"Q，"ZHAO"B"Y，"GAO"M，"YUAN"M"H，"TAHIR"U"M，"JIANG"Y，"YANG"L，"WANG"L，"LI"W，"CAI"W，"MA"C，"LU"L，"SONG"J"M，"CHEN"L"L."Integrative"multi-omics"profiling"of"passion"fruit"reveals"the"genetic"basis"for"fruit"color"and"aroma[J]."Plant"Physiology，"2024，"194（4）："2491-2510.

[20]"GUAN"Q"M，"YUE"X"L，"ZENG"H"T，"ZHU"J"H."The"protein"phosphatase"RCF2"and"its"interacting"partner"NAC019"are"critical"for"heat"stress-responsive"gene"regulation"and"thermotolerance"in"Arabidopsis[J]."Plant"Cell，"2014，"26（1）："438-453.

[21]"JOHN"S，"APELT"F，"KUMAR"A，"ACOSTA"I"F，"BENTS"D，"ANNUNZIATA"M"G，"FICHTNER"F，"GUTJAHR"C，"MUELLER-ROEBER"B，"OLAS"J"J."The"transcription"factor"HSFA7b"controls"thermomemory"at"the"shoot"apical"meristem"by"regulating"ethylene"biosynthesis"and"signaling"in"Arabidopsis[J]."Plant"Communications，"2024，"5（3）："100743.

[22]"RICE"A"I."A"mite"variation-associated"heat-inducible"isoform"of"a"heat-shock"factor"confers"heat"tolerance"through"regulation"of"jasmonate"ZIM-domain"genes"in"rice[J]."New"Phytologist，"2022，"234（4）："1315-1331.

[23]"GUAN"M"Q，"WEN"C"L，"ZENG"H"T，"ZHU"J"H."A"KH"domain-containing"putative"RNA-binding"protein"is"critical"for"heat"stress-responsive"gene"regulation"and"thermotolerance"in"Arabidopsis[J]."Molecular"Plant，"2013，"6（2）："386-395.

[24]"IKEDA"M，"MITSUDA"N，"OHME-TAKAGI"M."Arabidopsis"HsfB1"and"HsfB2b"act"as"repressors"of"the"expression"of"heat-inducible"Hsfs"but"positively"regulate"the"acquired"thermotolerance[J]."Plant"Physiology，"2011，"157（3）："1243-"1254.

[25]"ANDRáSI"N，"RIGó"G，"ZSIGMOND"L，"PéREZ-SALAMó"I，"PAPDI"C，"KLEMENT"E，"PETTKó-SZANDTNER"A，"Baba"A"I，"AYAYDIN"F，"DASARI"R"á"C，"SZABADOS"L."The"mitogen-activated"protein"kinase"4-phosphorylated"heat"shock"factor"A4A"regulates"responses"to"combined"salt"and"heat"stresses[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2019，"70（18）："4903-4918.

[26]"HUANG"Y"C，"NIU"C"Y，"YANG"C"R，"JINN"T"L."The"heat"stress"factor"HSFA6b"connects"ABA"signaling"and"ABA-"mediated"heat"responses[J]."Plant"Physiology，"2016，"172（2）："1182-1199.

[27]"李程，"路凱，"王才林，"張亞東."PPR蛋白響應(yīng)植物非生物脅迫的研究進(jìn)展[J]."中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2023，"56（24）："4801-4813.LI"C，"LU"K，"WANG"C"L，"ZHANG"Y"D."Research"progress"of"PPR"protein"in"plant"abiotic"stress"response[J]."Scientia"Agricultura"Sinica，"2023，"56（24）："4801-4813."（in"Chinese）

[28]"王婉珍，"任育軍，"繆穎."PPR蛋白在植物生長發(fā)育中的作用[J]."熱帶亞熱帶植物學(xué)報，"2019，"27（2）："225-234."WANG"W"Z，"REN"Y"J，"MIAO"Y."Roles"of"PPR"proteins"in"plant"growth"and"development[J]."Journal"of"Tropical"and"Subtropical"Botany，"2019，"27（2）："225-234."（in"Chinese）

[29]"KUZUYA"M，"HOSOYA"K，"YASHIRO"K，"TOMITA"K，"EZURA"H."Powdery"mildew"（Sphaerotheca"fuliginea）"resistance"in"melon"is"selectable"at"the"haploid"level[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2003，"54（384）："1069-1074.

[30]"HAMAJI"K，"NAGIRA"M，"YOSHIDA"K，"OHNISHI"M，"ODA"Y，"UEMURA"T，"GOH"T，"SATO"M"H，"MORITA"M"T，"TASAKA"M，"HASEZAWA"S，"NAKANO"A，"HARA-"NISHIMURA"I，"MAESHIMA"M，"FUKAKI"H，"MIMURA"T."Dynamic"aspects"of"ion"accumulation"by"vesicle"traffic"under"salt"stress"in"Arabidopsis[J]."Plant"and"Cellnbsp;Physiology，"2009，"50（12）："2023-2033.

[31]"WEI"Y，"JIN"J"T，"XU"Y"X，"LIU"W"T，"YANG"G"X，"BU"H"D，"LI"T，"WANG"A"D."Ethylene-activated"MdPUB24"mediates"ubiquitination"of"MdBEL7"to"promote"chlorophyll"degradation"in"apple"fruit[J]."The"Plant"Journal，"2021，"108（1）："169-182.