芒果果實(shí)MiERF20基因的克隆、定位及表達(dá)分析

摘""要：芒果（Mangifera"indica"L.）是典型的呼吸躍變型水果，其成熟衰老與乙烯密切相關(guān)。ERF轉(zhuǎn)錄因子（ethylene-"responsive"factor）在植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。本研究以貴妃芒果品種為試驗(yàn)材料，克隆MiERF20基因，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行分析。結(jié)果表明：MiERF20基因全長(zhǎng)492"bp，編碼163個(gè)氨基酸；MiERF20蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白，無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)，含有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)及1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域；其二級(jí)結(jié)構(gòu)以40.49%的無(wú)規(guī)則卷曲為主，還含有33.13%的α-螺旋、16.56%的延伸鏈和9.82%的β-轉(zhuǎn)角，三級(jí)結(jié)構(gòu)符合AP2結(jié)構(gòu)域特征；MiERF20與漆樹(shù)科開(kāi)心果的ERF20蛋白同源性達(dá)83.89%。亞細(xì)胞定位顯示MiERF20位于細(xì)胞核，且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明該蛋白在原核系統(tǒng)中能被誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果顯示，MiERF20基因受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)，表明其在乙烯調(diào)控果實(shí)成熟中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步解析ERF轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)采后成熟過(guò)程中的功能和調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芒果；ERF轉(zhuǎn)錄因子；乙烯信號(hào)；基因表達(dá)；表達(dá)分析中圖分類(lèi)號(hào)：S667.7"""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning，"Localization"and"Expression"Analysis"of"MiERF20"Gene"in"Mango"Fruit

GUO"Pan1，2，"WANG"Xin1，2，"ZHANG"Shasha1，2，"MA"Dexin3，"GONG"Yan3，"SHAO"Yuanzhi1，2，"LI"Wen1，2*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China;"2."Sanya"Institute"of"Southern"Propagation，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"3."Hainan"Haiken"Cold"Chain"Development"Co.，"Ltd.，"Sanya，"Hainan"572013，"China

Abstract："Mango"（Mangifera"indica"L.），"as"a"typical"climacteric"fruit，"undergoes"ripening"and"senescence"processes"closely"related"to"ethylene."Ethylene-responsive"factors"（ERF）"play"crucial"roles"in"plant"growth，"fruit"ripening"and"ethylene"signaling"transduction."Mango"variety"Guifei"was"used，"MiERF20，"492"bp"long"and"encoding"163"amino"acids，""was"cloned"and"analyzed."Bioinformatics"analysis"revealed"that"MiERF20"was"an"unstable，"hydrophilic"protein"without"signal"peptides"or"transmembrane"regions，"containing"25"phosphorylation"sites"and"one"AP2"conserved"domain."The"secondary"structure"was"dominated"by"40.49%"irregular"coils，"33.13%"α-helices，"16.56%"extensions"and"9.82%"β-rotations."Its"secondary"structure"comprised"irregular"coils，"α-helices，"extended"chains，"and"β-turns，"consistent"with"AP2"domain"features."MiERF20"showed"83.89%"homology"with"ERF20"of"Lacertidae"pistachio."Subcellular"localization"indicated"that"MiERF20"was"located"in"the"nucleus"and"possessed"transcriptional"activation"activity."Prokaryotic"expression"assays"demonstrated"that"the"protein"could"be"inducibly"expressed"in"a"prokaryotic"system."Real-time"fluorescence"quantification"showed"that"MiERF20"was"ethylene-inducible，"suggesting"its"role"in"ethylene-regulated"fruit"ripening."This"study"would"provide"a"foundation"for"further"analysis"of"the"functions"and"regulatory"mechanisms"of"ERF"transcription"factors"during"postharvest"fruit"ripening.

Keywords："mango;"ERF"transcription"factor;"ethylene"signaling;"gene"expression;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.002

AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive"factor）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大且重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)以及激素信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。ERF基因家族成員含有高度保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，通常由約60～70個(gè)氨基酸組成，具有YRG和RAYD等特征性序列元件，這些元件是AP2/ERF家族成員結(jié)合目標(biāo)DNA位點(diǎn)的重要特征[1]。ERF基因家族不僅響應(yīng)內(nèi)源乙烯信號(hào)，還能參與植物對(duì)干旱、鹽分、低溫等多種非生物脅迫的應(yīng)答調(diào)控，且能夠與其他激素（如脫落酸、茉莉酸等）信號(hào)通路交叉作用，因此在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2-3]。ERF基因家族通常分為若干亞組，如ERF亞族、DREB亞族等。ERF亞族主要響應(yīng)乙烯和茉莉酸等激素信號(hào)，而DREB亞族通常參與非生物脅迫反應(yīng)。研究表明，這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)特定順式元件來(lái)激活或抑制其表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控[4]。

不同植物中的ERF家族基因因其保守性和廣泛的生物功能而被關(guān)注。辣椒CaERF70基因在耐鹽處理下顯著表達(dá)，并具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明其可能在辣椒應(yīng)對(duì)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。西瓜中的ClERF039基因在果實(shí)早期發(fā)育階段對(duì)冷害、干旱、鹽等非生物脅迫呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控趨勢(shì)，其可能在西瓜果實(shí)發(fā)育和抗逆性方面具有潛在功能[6]。玉米ZmEREB180基因在玉米根系生長(zhǎng)和耐逆性調(diào)控中起到了積極作用，尤其在低氮和干旱脅迫下顯著上調(diào)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，表明ZmEREB180可能有助于提高作物的抗逆性[7]。在桃果實(shí)的成熟過(guò)程中，PpERF1.B基因的表達(dá)水平與果實(shí)成熟呈正相關(guān)，表明PpERF1.B基因在果實(shí)成熟過(guò)程中可能通過(guò)激活目標(biāo)基因啟動(dòng)子發(fā)揮調(diào)控作用[8]。黃瓜CsERF025L基因也在不同脅迫條件下表達(dá)，推測(cè)該基因可能在黃瓜的抗逆性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。此外，過(guò)表達(dá)水稻OsERF71基因，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出顯著的抗旱能力。研究表明，OsERF71通過(guò)編程基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，將能量?jī)?yōu)先分配至氧化反應(yīng)和DNA復(fù)制等生存相關(guān)機(jī)制，同時(shí)抑制光合作用等高能量消耗過(guò)程，這種能量?jī)?yōu)化延長(zhǎng)了水稻在干旱條件下的生存時(shí)間[10]。結(jié)縷草ZjERF10基因在水稻中過(guò)表達(dá)后，表現(xiàn)出矮化、結(jié)實(shí)率降低和耐鹽性增強(qiáng)。ZjERF10與GA信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用，表明其通過(guò)調(diào)控ABA和GA串?dāng)_信號(hào)通路，影響植物的發(fā)育和抗鹽反應(yīng)[11]。PaERF38基因在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)后，顯著增強(qiáng)了植物的耐鹽和耐滲透性，通過(guò)提高抗氧化酶的活性，從而減少活性氧積累，表明PaERF38在調(diào)控抗氧化能力方面的作用[12]。

芒果（Mangifera"indica"L.）是熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。然而，芒果作為一種典型的呼吸躍變型水果，其采后成熟過(guò)程伴隨著乙烯的釋放，易導(dǎo)致果實(shí)軟化、衰老，縮短了貨架期，影響芒果的市場(chǎng)供應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何延緩芒果的采后衰老、提高其貯藏穩(wěn)定性成為當(dāng)前重要的研究方向[13]。ERF轉(zhuǎn)錄因子作為乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵成分，在芒果的采后成熟調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。陳明敏等[14]在芒果中鑒定出多個(gè)ERF基因家族成員，其中MiERF-AP2-5、MiERF-AP2-6等在外源乙烯處理下表現(xiàn)出顯著上調(diào)趨勢(shì)，這些基因可能對(duì)乙烯的代謝起到正向調(diào)控作用。此外，竇雅琪等[15]的研究進(jìn)一步揭示了MiERF3在采后芒果果皮色澤調(diào)控中的作用，其在芒果貯藏期間的表達(dá)量呈先增后降的趨勢(shì)，其可能在芒果果實(shí)成熟和轉(zhuǎn)色過(guò)程中起到重要的正向調(diào)控作用。芒果中的其他ERF基因，如MiERF113在采后貯藏過(guò)程中的表達(dá)量逐漸增加，在果皮和果肉中均有較高的表達(dá)水平，表明其在采后成熟過(guò)程中具有重要作用，該基因可能通過(guò)響應(yīng)內(nèi)源乙烯信號(hào)，進(jìn)一步影響果實(shí)成熟相關(guān)的基因表達(dá)，延緩或加速成熟進(jìn)程[13]。此外，MiERF2基因在乙烯處理下表現(xiàn)出復(fù)雜的表達(dá)模式，不同成熟度的芒果果實(shí)對(duì)乙烯處理的響應(yīng)不同，其可能在芒果采后成熟過(guò)程中扮演雙重調(diào)控的角色[16]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的響應(yīng)逆境脅迫、果實(shí)發(fā)育成熟以及乙烯信號(hào)傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。芒果作為一種重要的熱帶水果，其采后成熟過(guò)程中乙烯釋放引發(fā)的一系列生理變化直接影響了果實(shí)的貨架期和品質(zhì)。ERF基因家族的不同成員在芒果采后成熟過(guò)程中的表達(dá)模式各異，且可能通過(guò)響應(yīng)乙烯信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)果實(shí)成熟和衰老過(guò)程的調(diào)控。因此，為進(jìn)一步解析芒果ERF家族基因在果實(shí)成熟衰老中的作用，本研究基于芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆MiERF20基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因編碼蛋白理化性質(zhì)，系統(tǒng)進(jìn)化、多序列比對(duì)等進(jìn)行分析；并通過(guò)qPCR分析MiERF20在果實(shí)貯藏期間表達(dá)水平的變化，通過(guò)酵母驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)錄激活活性，以及原核誘導(dǎo)該蛋白的表達(dá)。該研究有助于揭示芒果采后成熟調(diào)控的分子機(jī)制，并為延長(zhǎng)芒果果實(shí)的保鮮期提供理論依據(jù)。同時(shí)，利用基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)芒果ERF基因進(jìn)行改良，可望提高芒果的貯藏穩(wěn)定性，延緩衰老，為熱帶水果的保鮮技術(shù)提供新思路和新方法。

1""材料與方法

1.1""材料

供試材料為八成熟的貴妃芒果，采自海南省東方市八所鎮(zhèn)南堯村。挑選大小、顏色相對(duì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的芒果果實(shí)為試驗(yàn)材料。剪留0.5"cm果柄，用0.1%次氯酸鈉、0.05%施保功浸泡處理并晾干。將果實(shí)分為2組，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)0.5"mg/L"ETH溶液浸泡5"min，密閉存放24"h后取出，標(biāo)記為ETH處理果實(shí)；對(duì)照組（CK）果實(shí)不作任何處理，將果實(shí)裝入PE保鮮袋中，9個(gè)果實(shí)為1袋，貯藏在濕度為85%～90%，溫度為20"℃的培養(yǎng)箱中。分別在0、6、12、18、24"d取樣，3個(gè)果實(shí)為1次重復(fù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。將果肉樣品用液氮速凍，保存于–80"℃冰箱，用于后續(xù)RNA提取與基因克隆。

1.2""方法

1.2.1""RNA提取與cDNA合成""采用改良型CTAB法提取芒果果實(shí)RNA，使用Nanodrop"2000測(cè)定RNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，使用NOVA"All-in-OneFirst-Strand"Synthesis"Master"Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于–20"℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2""MiERF20克隆""從芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到MiERF20基因，通過(guò)NCBI（https：//"www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)與TBtools軟件分析MiERF20基因序列。使用Primer"5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物（表1），使用NCBI"Primer-BLAST工具檢測(cè)克隆引物特異性。對(duì)目的基因進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收492"bp大小凝膠條帶，連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，隨后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆菌液送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.3""生物信息學(xué)分析"nbsp;利用ExPASy"ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線工具分析MiERF20蛋白理化性質(zhì)；利用SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM-2.0（https：//services.healthtech."dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）、NetPhos-3.1（https：//"services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）在線工具分析MiERF20蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)以及磷酸化位點(diǎn)；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/"cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopm.html）、SWISS-MODEL（https：//www.expasy.org/"resources/swiss-model）在線工具預(yù)測(cè)MiERF20蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用DNAMAN"6.0軟件進(jìn)行多物種序列比對(duì)，探究MiERF20在不同物種中的保守性與進(jìn)化關(guān)系。使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行蛋白同源性分析。利用NCBI"Conserved"Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih."gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、MEME（https：//"meme-suite.org/meme/）在線工具預(yù)測(cè)不同物種ERF20蛋白的保守結(jié)構(gòu)域以及分析10個(gè)motif結(jié)構(gòu)，并使用TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。

1.2.4""亞細(xì)胞定位分析""利用Cell-PLoc"2.0（http：//"www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線工具預(yù)測(cè)蛋白的定位。采用洋蔥內(nèi)表皮轉(zhuǎn)化法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。首先，選用Nco"Ⅰ和Spe"Ⅰ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物GFP-MiERF20（表1），PCR擴(kuò)增出目的片段，使用限制性內(nèi)切酶切割載體和插入片段，通過(guò)T4"DNA連接酶將目的片段構(gòu)建至pCAMBIA1302-GFP（35S：：GFP）表達(dá)載體中，生成35S：：MiERF20-GFP融合表達(dá)載體。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌，挑取陽(yáng)性克隆搖至OD600=0.8，離心收集菌體，使用重懸液（10"mmol/L"MgCl2、10"mmol/L"MES、100"μmol/L"AS）重懸菌體至OD600=0.8。將洋蔥內(nèi)表皮浸泡于該重懸液10"min后，使用濾紙吸去洋蔥內(nèi)表皮過(guò)多的重懸液，轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48"h。培養(yǎng)結(jié)束后制作玻片樣本，使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察藍(lán)色、綠色熒光信號(hào)并拍照。

1.2.5""MiERF20轉(zhuǎn)錄激活活性分析""選用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物DBD-"MiERF20（表1），以測(cè)序正確的pMD19-MiERF20質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的片段，酶切片段與載體后，通過(guò)T4"DNA連接酶將目的片段插入pGBKT7載體，構(gòu)成重組質(zhì)粒。將pGBKT7-MiERF20重組質(zhì)粒與陰性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7分別轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基，28"℃培養(yǎng)2～3"d。挑取陽(yáng)性單菌落分別點(diǎn)板到SD/-Trp、SD/-Trp/-"His"、SD/-Trp/-His+X-α-gal培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，28"℃培養(yǎng)3～5"d，根據(jù)菌落長(zhǎng)勢(shì)分析結(jié)果。

1.2.6""MiERF20原核表達(dá)分析""選用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物GST-MiERF20（表1），以測(cè)序正確的pMD19-MiERF20質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的片段，酶切片段與載體后，通過(guò)T4"DNA連接酶將目的片段插入pGEX-6P-1載體，構(gòu)成GST-MiERF20重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株BL21，挑取陽(yáng)性克隆搖至OD600=0.8，取1"mL作為誘導(dǎo)前菌液，剩余菌液加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG終濃度為1"mmol/L），37"℃搖床誘導(dǎo)表達(dá)6"h，誘導(dǎo)結(jié)束后取1"mL作為誘導(dǎo)后菌液，將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后菌液離心后使用PBS重懸菌體，再次離心后加入2×Protein"Loading"Buffer，95"℃水浴10"min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后進(jìn)行染色、脫色、拍照、分析。

1.2.7""MiERF20表達(dá)量分析""利用Primer"5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物（表1），使用NCBI"Primer-"BLAST檢測(cè)定量引物特異性。選擇芒果MiActin7基因作為內(nèi)參，使用TOLOBIO試劑盒（2×Q3"SYBR"qPCR"Master"mix）進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，采用2–??Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制10"μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序包括：預(yù)變性3"min（95"℃），循環(huán)包括95"℃變性10"s，60"℃退火延伸30"s，40次循環(huán)，熔解曲線采用儀器默認(rèn)程序。

2""結(jié)果與分析

2.1""MiERF20基因的克隆與鑒定

以芒果果肉cDNA為模板，使用PCR-MiERF20克隆引物對(duì)MiERF20基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，克隆得到的片段與MiERF20基因片段大小一致，通過(guò)測(cè)序鑒定，結(jié)果與MiERF20基因序列一致，表明成功克隆了MiERF20基因。

2.2""MiERF20生物信息學(xué)分析

蛋白理化性質(zhì)分析顯示，MiERF20基因編碼163個(gè)氨基酸，蛋白分子式為C809H1242N220O255S7，分子量為18"354.5"Da，蛋白等電點(diǎn)為5.15，正、負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)分別為19個(gè)和22個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為62.63，親水性為–0.612，推測(cè)MiERF20蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。MiERF20蛋白無(wú)信號(hào)肽（圖2A），屬于非分泌蛋白，無(wú)跨膜區(qū)（圖2B），不屬于膜結(jié)構(gòu)蛋白。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，MiERF20分別含有Ser（15個(gè)）、Thr（5個(gè)）、Tyr（5個(gè)）共25個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖2C）。MiERF20蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其無(wú)規(guī)則卷曲為66個(gè)氨基酸（40.49"%）、α-螺旋為54個(gè)氨基酸（33.13%）、延伸鏈為27個(gè)氨基酸（16.56%），β-轉(zhuǎn)角為16個(gè)氨基酸（9.82%）（圖2D）；MiERF20蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2E）與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致，符合AP2結(jié)構(gòu)域典型的結(jié)構(gòu)特征。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他9個(gè)已知物種的ERF20蛋白序列，與MiERF20蛋白序列進(jìn)行同源性分析（圖3B），發(fā)現(xiàn)MiERF20與漆樹(shù)科多年生落葉果樹(shù)開(kāi)心果（Pistacia"vera，XP_031253116.1）的ERF20蛋白氨基酸序列同源性最高，為83.89%，表明MiERF20蛋白與開(kāi)心果ERF20蛋白親緣關(guān)系近，該基因在功能上的作用可能更為相似。此外，與柑橘（Citrus"sinensis，KAH9781553.1）、榴蓮（Durio"zibethinus，XP_022719809.1）同源性也較高，為64.78%和62.58%。與可可（Theobroma"cacao，XP_007019844.2）、雪槿（Hibiscus"syriacus，XP_039003247.1）、棉花（Gossypium"hirsutum，XP_016675456.1）、榿木（Alnus"glutinosa，XP_"062152869.1）、黑楊（Populus"nigra，XP_"061987813.1）的氨基酸序列相似性分別為61.59%、61.49%、59.15%、58.68%、55.36"%。

對(duì)以上9個(gè)物種的ERF20基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，芒果MiERF20與漆樹(shù)科開(kāi)心果PvERF20聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最近，其次與雪槿、棉花的親緣關(guān)系較近，與榿木、黑楊的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4A）。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，9個(gè)物種的ERF20蛋白均含有AP2結(jié)構(gòu)域（圖4B）。MEME軟件分析表明，芒果與親緣關(guān)系最近的開(kāi)心果的motif一致，均含有motif1、motif3、motif2、motif5、motif4、motif8、motif9。與MiERF20同源性較高的不同物種的ERF基因的motif結(jié)構(gòu)相似（圖4C），其中所有蛋白中均含有4種motif（圖4D）。以上結(jié)果表明，ERF20蛋白均含有AP2結(jié)構(gòu)域，且蛋白結(jié)構(gòu)域是由1個(gè)或幾個(gè)特定的保守元件構(gòu)成。

2.3""MiERF20亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MiERF20蛋白定位于細(xì)胞核。將構(gòu)建好的pCAMBIA1302-MiERF20載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥內(nèi)表皮進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，使用倒置熒光顯微鏡觀察，對(duì)照組35S：：GFP在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞壁上均檢測(cè)到

綠色熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)組35S：：MiERF20-GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核中出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)（圖5），結(jié)果表明芒果MiERF20蛋白定位于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞核，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子通常所具有的核定位信號(hào)特征，并在細(xì)胞核中發(fā)揮其功能。

2.4""MiERF20轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為了確定MiERF20蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，將MiERF20基因重組到酵母表達(dá)載體pGBKT7中，構(gòu)成pGBKT7-MiERF20誘餌質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以空載體pGBKT7作為陰性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp平板培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單菌落分別點(diǎn)板到SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His+X-α-gal平板驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖6），2組酵母菌在SD/-Trp平板上均能正常生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化pGBKT7的陰性對(duì)照組不能在SD/-Trp/-His平板上生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化pGBKT7-MiERF20誘餌目的基因質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組可以在SD/-Trp/-His平板上正常生長(zhǎng)，并在添加X(jué)-α-gal的平板上變藍(lán)，表明MiERF20基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠特異性結(jié)合到DNA序列上，從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控基因表達(dá)，并在細(xì)胞的生理與發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.5""MiERF20原核表達(dá)分析

為了驗(yàn)證MiERF20蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，將MiERF20基因插入到pGEX-6P-1載體中，構(gòu)建GST-MiERF20重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化BL21菌株。結(jié)果顯示（圖7），1"mmol/L"IPTG誘導(dǎo)的GST-MiERF20融合蛋白在40～55"kDa處差異明顯，符合GST-"MiERF20融合蛋白的大小，表明其成功誘導(dǎo)表達(dá)。上述結(jié)果表明，MiERF20蛋白在原核系統(tǒng)中正確折疊，具備良好轉(zhuǎn)錄和翻譯適應(yīng)性，為研究其功能和在植物中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.6""MiERF20相對(duì)表達(dá)量分析

芒果果實(shí)貯藏過(guò)程中，MiERF20基因的表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)（圖8）。乙烯利處理能夠顯著提高M(jìn)iERF20基因的表達(dá)水平，且于12"d達(dá)到峰值，與0"d相比其表達(dá)量升高了6.14倍，且處理組MiERF20基因的表達(dá)水平在整個(gè)貯藏期中始終高于對(duì)照組。表明MiERF20基因可能響應(yīng)乙烯信號(hào)，并在芒果采后成熟與衰老過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。

3""討論

果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的生理和生化過(guò)程，涉及多種植物激素和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。乙烯作為一種關(guān)鍵的植物激素，在更年期果實(shí)的成熟過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。果實(shí)成熟過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷一系列變化，包括色素積累、質(zhì)地軟化、糖分積累和風(fēng)味形成[17-19]。這些變化不僅影響果實(shí)的感官品質(zhì)，還直接影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)接受度。乙烯通過(guò)與其信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子相互作用，調(diào)節(jié)這些成熟相關(guān)的生理過(guò)程[20-22]。

乙烯反應(yīng)因子（ERF）家族是乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要組成部分，參與調(diào)控果實(shí)成熟。在不同物種中，ERF基因表現(xiàn)出多樣的功能。番茄中的SlERF.D7通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素和乙烯信號(hào)的串?dāng)_，促進(jìn)果實(shí)成熟[23-24]。甜瓜中CmERF024被證明是乙烯介導(dǎo)的果實(shí)成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其缺失會(huì)導(dǎo)致成熟延遲[25]。與這些物種相比，芒果中的ERF基因家族尚未得到全面研究。已有的研究表明，芒果MiERF4在應(yīng)對(duì)病原菌侵染時(shí)發(fā)揮重要作用，并可能參與乙烯和茉莉酸信號(hào)通路[26]。MiERF113在采后貯藏過(guò)程中的表達(dá)量逐漸增加，表明其可能通過(guò)響應(yīng)內(nèi)源乙烯信號(hào)，影響果實(shí)成熟相關(guān)的基因表達(dá)，并延緩或加速成熟進(jìn)程[13]。以上研究表明芒果ERF基因可能在果實(shí)成熟和抗病方面扮演雙重角色。

ERF基因作為乙烯信號(hào)傳導(dǎo)的下游因子，直接參與果實(shí)成熟的調(diào)控。研究表明，ERF基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶基因（如ACS和ACO）影響果實(shí)成熟進(jìn)程[1，"27]。在番茄中，ERF4通過(guò)與TPL4的相互作用抑制乙烯的產(chǎn)生，從而影響果實(shí)硬度[28]。類(lèi)似的機(jī)制在無(wú)花果和桃子中也被發(fā)現(xiàn)，這些ERF基因通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子的相互作用，調(diào)控果實(shí)成熟的多個(gè)方面[1，"29]。ERF基因在采后果實(shí)成熟過(guò)程中具有顯著的調(diào)控潛力，通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)，影響果實(shí)的軟化、色素積累和風(fēng)味形成等關(guān)鍵品質(zhì)[30-32]。在蘋(píng)果中，ERF4的突變影響了果實(shí)的硬度和乙烯產(chǎn)生，從而改變了果實(shí)的保鮮期和品質(zhì)[28]；在芒果中，盡管對(duì)ERF基因的研究仍處于初步階段，但猜測(cè)其可能通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制影響果實(shí)的采后成熟和保鮮。

本研究為進(jìn)一步解析ERF20轉(zhuǎn)錄因子在采后芒果果實(shí)成熟與衰老方面的作用，對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化、轉(zhuǎn)錄激活活性、原核誘導(dǎo)表達(dá)和采后貯藏期間的表達(dá)模式進(jìn)行分析。生物信息學(xué)分析顯示，MiERF20基因全長(zhǎng)492"bp，編碼163個(gè)氨基酸，與克隆及原核誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的結(jié)果一致。MiERF20蛋白無(wú)信號(hào)肽與跨膜區(qū)，含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域（65個(gè)氨基酸），屬于AP2/ERF家族成員。進(jìn)化樹(shù)與蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)，MiERF20與漆樹(shù)科多年生落葉果樹(shù)開(kāi)心果PvERF20蛋白氨基酸序列同源性最高，為83.89%，且芒果MiERF20與漆樹(shù)科開(kāi)心果PvERF20聚為一類(lèi)，表明MiERF20蛋白與開(kāi)心果ERF20蛋白親緣關(guān)系近，該基因在功能上的作用可能更為相似，這與已報(bào)道的MiERF2、MiERF3等的結(jié)果一致[12-13]。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，芒果MiERF20蛋白定位于細(xì)胞核，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子通常所具有的核定位信號(hào)特征，并在細(xì)胞核中發(fā)揮其功能。轉(zhuǎn)錄激活活性實(shí)驗(yàn)表明MiERF20基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可能通過(guò)特異性結(jié)合DNA序列，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控基因表達(dá)。此外，qPCR結(jié)果表明，MiERF20基因可能響應(yīng)乙烯介導(dǎo)，乙烯信號(hào)通路被激活，通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與芒果采后成熟衰老與抵抗逆境的過(guò)程。

綜上所述，ERF基因通過(guò)調(diào)控乙烯信號(hào)傳導(dǎo)和與其他激素的交互作用，影響果實(shí)的成熟過(guò)程。MiERF20在采后芒果果實(shí)成熟過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步揭示芒果中ERF基因的具體功能及其在果實(shí)采后成熟中的調(diào)控機(jī)制，以期為芒果的采后保鮮技術(shù)提供新的分子靶點(diǎn)和策略。

參考文獻(xiàn)

• ZHOU"H，"ZHAO"L，"YANG"Q"R，"AMAR"M"H，"OGUTU"C，"PENG"Q，"LIAO"L，"ZHANG"J"Y，"HAN"Y"P."Identification"of"EIL"and"ERF"genes"related"to"fruit"ripening"in"peach[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2020，"21（8）："2846.
• LIU"J"T，"ZHONG"H"F，"CAO"C"J，"WANG"Y"Q，"ZHANG"Q"R，"WEN"Q"F，"ZHU"H"S，"LI"Z"L."Identification"of"AP2/ERF"transcription"factors"and"characterization"of"AP2/ERF"genes"related"to"low-temperature"stress"response"and"fruit"development"in"luffa[J]."Agronomy，"2024，"14（11）："2509.
• XU"J，"LIU"S"D，"CAI"L"C，"WANG"L"Y，"DONG"Y"F，"QI"Z"Y，"YU"J"Q，"ZHOU"Y"H."SPINDLY"interacts"with"EIN2"to"facilitate"ethylene"signalling‐mediated"fruit"ripening"in"tomato[J]."Plant"Biotechnology"Journal，"2023，"21（1）："219-231.
• RITONGA"F"N，"NGATIA"Jnbsp;N，"WANG"Y"R，"KHOSO"M"A，"FAROOQ"U，"CHEN"S."AP2/ERF，"an"important"cold"stress-related"transcription"factor"family"in"plants："a"review[J]."Physiology"and"Molecular"Biology"of"Plants，"2021，"27（9）："1953-1968.
• 張余，"金明偉，"任麗，"章毅穎，"趙洪，"劉昆，"鄧姍，"褚云霞，"李壽國(guó)，"張靖立，"黃靜艷，"陳海榮."辣椒CaERF70的表達(dá)特征和轉(zhuǎn)錄自激活活性分析[J]."浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2024，"36（10）："2247-2256."ZHANG"Y，"JIN"M"W，"REN"L，"ZHANG"Y"Y，"ZHAO"H，"LIU"K，"DENG"S，"CHU"Y"X，"LI"S"G，"ZHANG"J"L，"HUANG"J"Y，"CHEN"H"R."Expression"characterization"and"transcriptional"self-activation"activity"of"CaERF70"in"Capsicum"annuum[J]."Acta"Agriculture"zhejiangensis"2024，"36（10）："2247-2256."（in"Chinese）
• 尹萌萌，"黃戰(zhàn)，"胡金祥，"于穎珊，"葛佳瑞，"張銳敏."西瓜ClERF039基因的克隆、表達(dá)分析及功能預(yù)測(cè)[J]."分子植物育種，"（2024-09-19）[2024-11-10]."http：//kns.cnki.net/kcms/"detail/46.1068.s.20240918.1047.002.html.YIN"M"M，"HUANG"Z，"HU"J"X，"YU"Y"S，"GE"J"R，"ZHANG"R"M."Cloning，"expression"analysis"and"functional"prediction"of"watermelon"ClERF039"gene[J]."Molecular"Plant"Breeding，"（2024-09-19）[2024-11-10]."http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46."1068.s.20240918.1047.002.html."（in"Chinese）
• 劉宸銘，"趙克勇，"悅曼芳，"趙延明，"吳忠義，"張春."玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmEREB180調(diào)控根系生長(zhǎng)發(fā)育及耐逆的功能研究[J]."作物學(xué)報(bào)，"2024，"50（8）："1920-1933."LIU"C"M，"ZHAO"K"Y，"YUE"M"F，"ZHAO"Y"M，"WU"Z"Y，"ZHANG"C."Functional"studies"on"the"maize"transcription"factor"ZmEREB180"regulating"root"growth"and"development"and"stress"tolerance[J]."Acta"Agronomica"sinica，"2024，"50（8）："1920-"1933."（in"Chinese）
• 郭正兵，"韓柏明，"趙瑞，"儲(chǔ)睿."桃PpERF1.B基因的克隆與表達(dá)分析[J]."分子植物育種，"（2024-04-17）[2024-11-10]."http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20240415.1451.008.html.GUO"Z"B，"HAN"B"M，"ZHAO"R，"CHU"R."Cloning"and"expression"analysis"of"peach"PpERF1.B"gene[J]."Molecular"Plant"Breeding，"（2024-04-17）[2024-11-10]."http：//kns.cnki.net/"kcms/detail/46.1068.S.20240415.1451.008.html."（in"Chinese）
• 肖雅茹，"賈婷婷，"羅丹，"武喆，"李麗霞."黃瓜CsERF025L轉(zhuǎn)錄因子的克隆及表達(dá)分析[J]."生物技術(shù)通報(bào)，"2024，"40（4）："159-166.XIAO"Y"R，"JIA"T"T，"LUO"D，"WU"Z，"LI"L"X."Cloning"and"expression"analysis"of"CsERF025L"transcription"factor"in"cucumber[J]."Biotechnology"Bulletin，"2024，"40（4）："159-166."（in"Chinese）
• AHN"H，"JUNG"I，"SHIN"S"J，"PARK"J，"RHEE"S，"KIM"J"K，"JUNG"W，"KWON"H"B，"KIM"S."Transcriptional"network"analysis"reveals"drought"resistance"mechanisms"of"AP2/ERF"transgenic"rice[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2017，"8："1044.
• GUO"T，"WANG"S"M，"FAN"B，"ZOU"S"H，"CHEN"S，"LIU"W，"WANG"S，"AI"L"J，"HAN"L"B."Overexpression"of"the"Zoysia"japonica"ZjABR1/ERF10"regulates"plant"growth"and"salt"tolerance"in"transgenic"Oryza"sativa[J]."Environmental"and"Experimental"Botany，"2023，"206："105171.
• CHENG"Z"H，"ZHANG"X"M，"ZHAO"K，"YAO"W"J，"LI"R"H，"ZHOU"B"R，"JIANG"T"B."Over-expression"of"ERF38"gene"enhances"salt"and"osmotic"tolerance"in"transgenic"poplar[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2019，"10："1375.
• 易萍，"黃方，"李麗，"孫健，"胡美姣，"畢金峰，"滕建文."芒果乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子MiERF113基因的克隆及表達(dá)分析[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2022，"43（9）："1751-1758.YI"P，"HUANG"F，"LI"L，"SUN"J，"HU"M"J，"BI"J"F，"TENG"J"W."Cloning"and"expression"analysis"of"the"ethylene-responsive"transcription"factor"MiERF113"gene"in"mango[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2022，"43（9）："1751-1758."（in"Chinese）
• 陳明敏，"王麗榮，"邵遠(yuǎn)志，"李蕊，"李雯."芒果ERF基因家族鑒定及外源乙烯誘導(dǎo)下MiERF-AP2的基因表達(dá)分析[J]."分子植物育種，"2022，"20（15）："4958-4966.CHEN"M"M，"WANG"L"R，"SHAO"Y"Z，"LI"R，"LI"W."Identification"of"ERF"gene"family"and"gene"expression"analysis"of"MiERF-AP2"in"mango"induced"by"exogenous"ethylene[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2022，"20（15）："4958-4966."（in"Chinese）
• 竇雅琪，"王倩，"Muhammad"Muzammal"Aslam，"邵遠(yuǎn)志，"李雯."芒果MiERF3基因的克隆及表達(dá)分析[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2024，"45（10）："2044-2053."DOU"Y"Q，"WANG"Q，"ASLAM"M"M，"SHAO"Y"Z，"LI"W."Cloning"and"expression"analysis"of"MiERF3"gene"in"mango[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2024，"45（10）："2044-2053."（in"Chinese）
• 魏玲，"寇明睿，"李雯."芒果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子MiERF2基因的克隆及表達(dá)分析[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2024，"45（1）："1-9.WEI"L，"KOU"M"R，"LI"W."Cloning"and"expression"analysis"of"the"AP2/ERF"transcription"factor"MiERF2"gene"in"mango[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2024，"45（1）："1-9."（in"Chinese）
• LIU"M"C，"GOMES"B"L，"MILA"I，"PURGATTO"E，"PERES"L"E"P，"FRASSE"P，"MAZA"E，"ZOUINE"M，"ROUSTAN"J"P，"BOUZAYEN"M，"PIRRELLO"J."Comprehensive"profiling"of"ethylene"response"factor"expression"identifies"ripening-"associated"ERF"genes"and"their"link"to"key"regulators"of"fruit"ripening"in"tomato[J]."Plant"Physiology，"2016，"170（3）："1732-"1744.
• LIU"Y"D，"TANG"M"F，"LIU"M"C，"SU"D"D，"CHEN"J，"GAO"Y"S，"BOUZAYEN"M，"LI"Z"G."The"molecular"regulation"of"ethylene"in"fruit"ripening[J]."Small"Methods，"2020，"4（8）："1900485.
• LIU"B"D，"XIN"Q，"ZHANG"M，"CHEN"J"H，"LU"Q"C，"ZHIU"X"Q，"LI"X"X，"ZHANG"W"L，"FENG"W，"PEI"H"S，"SUN"J."Research"progress"on"mango"post-harvest"ripening"physiology"and"the"regulatory"technologies[J]."Foods，"2022，"12（1）："173.
• LIU"M"C，"DIRETTO"G，"PIRRELLO"J，"ROUSTAN"J"P，"LI"Z"G，"GIULIANO"G，"REGAD"F，"BOUZAYEN"M."The"chimeric"repressor"version"of"an"Ethylene"Response"Factor"（ERF）"family"member，"Sl‐ERF.B3，"shows"contrasting"effects"on"tomato"fruit"ripening[J]."New"Phytologist，"2014，"203（1）："206-218.
• ALONSO-SALINAS"R，"LóPEZ-MIRANDA"S，"PéREZ-"LóPEZ"A"J，"ACOSTA-MOTOS"J"R."Strategies"to"delay"ethylene-mediated"ripening"in"climacteric"fruits："implications"for"shelf"life"extension"and"postharvest"quality[J]."Horticulturae，"2024，"10（8）："840.
• GARCíA-SALINAS"C，"RAMOS-PARRA"P"A，"DíAZ"DE"LA"GARZA"R"I."Ethylene"treatment"induces"changes"in"folate"profiles"in"climacteric"fruit"during"postharvest"ripening[J]."Postharvest"Biology"and"Technology，"2016，"118："43-50.
• GAMBHIR"P，"SINGH"V，"PARIDA"A，"RAGHUVANSHI"U，"KUMAR"R，"SHARMA"A"K."Ethylene"response"factor"ERF.D7"activates"auxin"response"factor"2"paralogs"to"regulate"tomato"fruit"ripening[J]."Plant"Physiology，"2022，"190（4）："2775-2796.
• GAMBHIR"P，"PARIDA"A"P，"SINGH"V，"RAGHUVANSHI"U，"KUMAR"R，"SHARMA"A"K."A"ripening-associated"ethylene"response"factor"ERF.D7"activates"ARF2"orthologs"to"regulate"tomato"fruit"ripening[J]."Plant"Biology，"2022，"190（4）："2775-2796.
• SANTO"DOMINGO"M，"ORDU?A"L，"NAVARRO"D，"MAYOBRE"C，"SANTIAGO"A，"VALVERDE"L，"ALEXIOU"K"G，"MATUS"J"T，"PUJOL"M，"GARCIA-MAS"J."The"ethylene‐responsive"transcription"factor"ERF024"is"a"novel"regulator"of"climacteric"fruit"ripening"in"melon[J]."The"Plant"Journal，"2024，"119（4）："1844-1858.
• LEI"C，"DANG"Z"G，"ZHU"M，"ZHANG"M"T，"WANG"H"L，"CHEN"Y"Y，"ZHANG"H."Identification"of"the"ERF"gene"family"of"Mangifera"indica"and"the"defense"response"of"MiERF4"to"Xanthomonas"campestris"pv."mangiferaeindicae[J]."Gene，"2024，"912："148382.
• ZHANG"Z，"LI"X"G."Genome-wide"identification"of"AP2/ERF"superfamily"genes"and"their"expression"during"fruit"ripening"of"Chinese"jujube[J]."Scientific"Reports，"2018，"8（1）："15612.
• HU"Y"N，"HAN"Z"Y，"SUN"Y"Q，"WANG"S，"WANG"T，"WANG"Y，"XU"K"N，"ZHANG"X"Z，"XU"X"F，"HAN"Z"H，"WU"T."ERF4"affects"fruit"firmness"through"TPL4"by"reducing"ethylene"production[J]."The"Plant"Journal，"2020，"103（3）："937-950.
• ZHAI"Y"L，"FAN"Z"Y，"CUI"Y"Y，"GU"X"J，"CHEN"S"W，"MA"H"Q."APETALA2/ethylene"responsive"factor"in"fruit"ripening："roles，"interactions"and"expression"regulation[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2022，"13："979348.
• HUANG"W，"HU"N，"XIAO"Z"N，"QIU"Y，"YANG"Y，"YANG"J，"MAO"X，"WANG"Y"C，"LI"Z"G，"GUO"H"W."A"molecular"framework"of"ethylene-mediated"fruit"growth"and"ripening"processes"in"tomato[J]."The"Plant"Cell，"2022，"34（9）："3280-"3300.
• WANG"M"M，"ZHU"Q"G，"DENG"C"L，"LUO"Z"R，"SUN"N"J，"GRIERSON"D，"YIN"X"R，"CHEN"K"S."Hypoxia-responsive"ERF"s"involved"in"postdeastringency"softening"of"persimmon"fruit[J]."Plant"Biotechnology"Journal，"2017，"15（11）："1409-"1419.

[32]"YIN"X"R，"ALLAN"A"C，"CHEN"K"S，"FERGUSON"I"B."Kiwifruit"EIL"and"ERF"Genes"involved"in"regulating"fruit"ripening[J]."Plant"Physiology，"2010，"153（3）："1280-1292.