巴西橡膠樹HbPP2基因家族鑒定與表達分析

摘""要：橡膠樹膠乳代謝過程受到多種機制調(diào)控，其中泛素化修飾調(diào)控最為顯著。韌皮部蛋白PP2屬于F-box蛋白家族，在膠乳中特異性高表達，可能參與了膠乳再生調(diào)控。本研究對巴西橡膠樹基因組中鑒定到的17個F-box成員HbPP2基因進行生物信息學(xué)和表達模式分析，結(jié)果表明：橡膠樹PP2基因編碼的蛋白大多數(shù)為不穩(wěn)定親水性蛋白，分子量介于9.402～61.206"kDa之間；系統(tǒng)進化分析表明巴西橡膠樹中的17個HbPP2基因可以分為3個亞組（Ⅰ亞組，Ⅱ亞組和Ⅲ亞組），其中HbPP2成員在Ⅰ亞組中完全缺失；順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，PP2基因啟動子區(qū)域包含生長發(fā)育調(diào)控、激素響應(yīng)和光響應(yīng)等多種順勢作用元件；亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PP2蛋白主要定位在葉綠體或細胞質(zhì)中；表達分析顯示，橡膠樹HbPP2家族中除部分成員具有組織表達特異性外，多數(shù)成員在各個組織中均有表達，在膠乳中，HbPP2-B1、HbPP2-B1.1、HbPP2-B10.1、HbPP2-A13.2、HbPP2-B13和HbPP2-A15.1的表達豐度較高，但割膠處理只顯著上調(diào)HbPP2-A13.2和HbPP2-B13的表達。本研究初步揭示巴西橡膠樹HbPP2家族成員的理化特征和表達特征，為進一步研究該基因家族在橡膠樹膠乳合成代謝中的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹；基因表達分析；韌皮部蛋白2；PP2基因家族；膠乳生物合成中圖分類號：S794.1""""""文獻標(biāo)志碼：A

Identification"and"Expression"Analysis"of"HbPP2"Gene"Family"in"Hevea"brasiliensis

YANG"Na1，2，"LIN"Yuan3，"HU"Bin3，"HAO"Yuanyuan3，"HAN"Xiaofei1，"LIU"Linya2*，"LONG"Xiangyu3*

1."School"of"Life"and"Health，"Dalian"University，"Dalian，"Liaoning"116622，"China;"2."School"of"Biological"Science"and"Technology，"Liupanshui"Normal"University，"Liupanshui，"Guizhou"553004，"China;"3."Institute"of"Rubber"Research，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Rubber"Tree，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Rubber"tree"latex"metabolic"processes"are"regulated"by"a"variety"of"mechanisms，"among"which"ubiquitination"modification"is"the"most"significant."The"phloem"protein"PP2"belongs"to"the"F-box"protein"family"and"is"specifically"highly"expressed"in"latex，"which"may"be"involved"in"the"regulation"of"latex"regeneration."In"this"study，"bioinformatics"and"expression"pattern"analysis"were"conducted"on"17"F-box"members"of"the"HbPP2"gene"identified"in"the"genome"of"Hevea"brasiliensis."The"results"revealed"that"the"majority"of"proteins"encoded"by"the"rubber"tree"PP2"genes"were"unstable"hydrophilic"proteins"with"molecular"weights"ranging"from"9.402"to"61.206"kDa."Phylogenetic"analysis"showed"that"the"17"HbPP2"genes"in"the"H."brasiliensis"could"be"divided"into"three"subgroups"（Subgroup"Ⅰ，"Subgroup"Ⅱ，"Subgroup"Ⅲ），"in"which"HbPP2"members"were"completely"absent"in"subgroup"I."Analysis"of"cis-acting"elements"revealed"that"the"rubber"tree"PP2"gene"family"contained"diverse"functional"elements"involved"in"growth"and"development"regulation，"hormone"response，"and"light"response."Subcellular"localization"analysis"indicated"that"PP2"proteins"were"primarily"localized"in"chloroplasts"or"cytoplasm."Tissue"expression"analysis"showed"that，"except"for"some"members"with"tissue-specific"expression，"most"members"of"the"rubber"tree"HbPP2"family"were"expressed"in"various"tissues."In"latex，"the"expression"levels"of"six"genes，"HbPP2-B1，"HbPP2-B1.1，"HbPP2-B10.1，"HbPP2-A13.2，"HbPP2-B13"and"HbPP2-A15.1，"were"relatively"high，"but"tapping"treatment"significantly"upregulated"the"expression"of"HbPP2-A13.2"and"HbPP2-B13."This"study"would"provide"preliminary"insights"into"the"physicochemical"and"expression"characteristics"of"the"HbPP2"family"members"in"the"H."brasiliensis，"laying"a"foundation"for"further"research"on"the"functions"of"this"genes"family"in"rubber"trees"latex"synthesis"and"metabolism.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"gene"expression"analysis;"phloem"protein"2;"PP2"genes"family;"natural"rubber"biosynthesis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

F-box蛋白是SCF類E3泛素連接酶的重要組成部分，通過與其他蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，完成泛素化修飾的調(diào)控，進而參與植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物脅迫和非生物脅迫等生物過程"[1-4]。已有研究表明，擬南芥（Arabidopsis"thaliana）F-box基因編碼的生長素受體蛋白和茉莉酸受體蛋白能夠和其他蛋白形成復(fù)合體從而調(diào)控植物的生長發(fā)育和逆境應(yīng)答；葡萄（Vitis"vinifera"L.）F-box基因BIG-24.1受到激素SA、ABA、MeJA和損傷脅迫的強烈誘導(dǎo)；小麥（Triticum"aestivum"L.）F-box蛋白TaFBA1通過與脅迫相關(guān)蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)其對干旱和鹽脅迫的耐受性。

韌皮部組織不僅在光合產(chǎn)物、大分子和小分子物質(zhì)的長距離運輸中起著重要的作用[5-7]，也在植物應(yīng)答各種外部刺激（機械損傷、昆蟲攻擊和真菌感染等）產(chǎn)生防御反應(yīng)的過程中發(fā)揮核心作用[8-14]。韌皮部蛋白（phloem"protein，"PP）是韌皮部中含量最為豐富的一種蛋白，分為韌皮部蛋白PP1（phloem"protein，"PP1）和韌皮部蛋白PP2（phloem"protein，"PP2）[15-17]。PP2主要存在于高等植物韌皮部中，已有研究發(fā)現(xiàn)同物種之間的PP2蛋白大小差異明顯，主要是由保守結(jié)構(gòu)域延伸的N端長度的可變性造成。如南瓜屬植物PP2基因家族由2～8個基因構(gòu)成[18]，擬南芥中發(fā)現(xiàn)30個PP2基因，編碼蛋白長度131～479個氨基酸[19]，苧麻（Boehmeria"nivea"L."Gaudich）中發(fā)現(xiàn)15個PP2基因，編碼蛋白長度為177～441個氨基酸[20]。PP2蛋白的功能較廣泛，不同植物中的PP2蛋白功能不盡相同。在南瓜（Cucurbita"moschata）的韌皮部汁液中發(fā)現(xiàn)了116個PP2蛋白與泛素介導(dǎo)的蛋白水解相關(guān)，因此研究者推測這些蛋白可能具有水解蛋白功能[21]。在擬南芥中，F(xiàn)-box蛋白韌皮部蛋白AtPP2-B11作為SCF型E3連接酶的底物受體，負調(diào)控擬南芥對干旱脅迫的應(yīng)答[22]。因此，作為F-box家族成員韌皮部蛋白PP2，參與了植物生長發(fā)育以及抗性反應(yīng)。

巴西橡膠樹（Hevea"brasiliensis）屬大戟科植物，原產(chǎn)于亞馬遜河流域[23-24]。其產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠的主要來源。天然橡膠作為四大工業(yè)基礎(chǔ)原料之一，在航空航天、醫(yī)療和軍事等領(lǐng)域具有不可替代性。天然膠乳主要儲存于韌皮部組織特化的乳管細胞中[25]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，乳管中特異性表達基因與泛素化修飾途徑相關(guān)基因均顯著上調(diào)[26]，同時橡膠樹不同組織蛋白泛素化修飾組及割膠處理膠乳蛋白修飾組的數(shù)據(jù)顯示，乳管中泛素化修飾途徑被顯著富集（數(shù)據(jù)未發(fā)表），推測泛素化修飾是乳管中天然橡膠生物合成中重要的代謝調(diào)控方式，但具體作用機制尚不清楚。通過橡膠樹不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，PP2在膠乳中特異性高表達，并受割膠強烈誘導(dǎo)，推測PP2類基因可能通過泛素化修飾途徑參與乳管中天然橡膠的生物合成調(diào)控。因此，本研究以巴西橡膠樹（熱研7-33-97）為試驗材料，在全基因組水平鑒定PP2基因家族成員，對其成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級和三級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件、系統(tǒng)進化和表達特征等方面進行分析，研究結(jié)果將拓展對橡膠樹F-box基因家族的功能認知，為深入探究HbPP2基因家族在膠乳生物合成中的功能奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

本研究采用的實驗材料種植于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場的巴西橡膠樹熱研7-33-97。選取其不同組織（膠乳、葉片、種子、花、樹皮和莖）以及不同割次[第1刀（1）、第2刀（2）、第3刀（3）、第5刀（5）、第7刀（7）和第9刀（9）]的膠乳抽提總RNA，并進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2""方法

1.2.1""HbPP2基因家族成員鑒定及其理化性質(zhì)分析""從橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫（http：//hevea.catas.cn/"home/index）中獲取橡膠樹基因組序列、蛋白質(zhì)序列和注釋信息文件，利用Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//"pfam.xfam.org/）下載PP2結(jié)構(gòu)域（PF14299）的隱馬爾可夫模型（HMM）文件，對橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫中含有PP2結(jié)構(gòu)域的基因進行篩選，選取e值小于1e-10的蛋白序列[20]。從已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中根據(jù)結(jié)構(gòu)域搜索PP2基因，對比橡膠樹數(shù)據(jù)庫去除重復(fù)后通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm."nih.gov/）數(shù)據(jù)庫的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih."gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進行保守結(jié)構(gòu)域分析，去除不含PP2結(jié)構(gòu)域的候選序列，得到HbPP2基因家族成員。

1.2.2""HbPP2基因家族亞細胞定位及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測""利用ExPASy"ProtParam（https：//web."expasy.org/protparam/）在線分析工具進行氨基酸數(shù)量、分子量大小、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和親水系數(shù)預(yù)測。通過Plant-mPLoc（http：//www.csbio."sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）在線分析工具對橡膠樹PP2基因家族蛋白進行亞細胞定位。利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto"mat.pl？"page=npsa_sopma.html）在線分析工具分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通過SWISS-MODEL（https：//swissmodel.Expasy.org/）在線分析工具對橡膠樹PP2基因家族的蛋白質(zhì)序列進行三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測。

1.2.3""HbPP2基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件分析""根據(jù)橡膠樹基因組的注釋信息，利用NCBI"Batch"CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/"Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線分析工具搜索序列保守結(jié)構(gòu)域，利用MEME（http：//meme-suite."org/tools/meme）在線分析工具預(yù)測PP2家族基因的保守motif[3]。截取HbPP2轉(zhuǎn)錄起始位點上游2"kb的序列作為啟動子序列進行分析，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/plantcare/html/）在線分析工具預(yù)測啟動子序列的順式作用元件[27]，并通過TBtools軟件對預(yù)測的結(jié)果進行可視化展示[28]。

1.2.4""HbPP2基因家族系統(tǒng)進化分析""通過PlantTFdb（http：//planttfdb.gao-lab.org/index.php）數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、木薯（Manihot"esculenta）的PP2蛋白序列與"HbPP2組成分析蛋白序列集，通過MEGA-X軟件采用鄰接法（neighbor-joiningmethod，"NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[29]，并使用evolview（https：//www.evolgenius.info/"evolview-v2/#mytrees/SHOWCASES/showcase%2001）在線分析工具進行結(jié)果優(yōu)化。

1.2.5""HbPP2基因差異表達分析""所有RNA樣品均采用Hiseq平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，去除污染和低質(zhì)量讀長后進行基因組比對，利用RSEM軟件包對橡膠樹不同組織、不同割次膠乳的HbPP2基因家族成員進行表達分析，獲得每個基因的reads"count、FPKM及TPM值，將FPKM值取以2為底的對數(shù)，用TBtools軟件繪制熱圖。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挑選6個表達趨勢顯著的HbPP2家族成員基因，利用NCBI"Primer"3.0（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC=BlastHome）在線網(wǎng)站設(shè)計特異性引物（表1）。用TransZol"Plant"RNA提取試劑盒（ET121）分別提取5個組織（膠乳、花、莖、樹皮和葉）的總RNA和不同割膠處理（第1刀、第3刀、第5刀、第9刀）膠乳的總RNA。取1"μg總RNA用PrimeScript?"RT"reagent"Kit"with"gDNA"Eraser試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，YLS8為內(nèi)參基因，用2×Q3"SYBR"qPCR"Master"Mix（Universal）（TOLOBIO，"China）進行qPCR實驗，反應(yīng)體系和程序按照說明書進行，結(jié)果按照2–ΔΔCt法計算。

2""結(jié)果與分析

2.1""HbPP2基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

基于橡膠樹數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對篩選結(jié)果，共得到17個PP2蛋白編碼基因。通過CDD數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PP2含有保守結(jié)構(gòu)域，命名如表2所示。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HbPP2蛋白之間差異較大，蛋白分子量介于9.402～61.206"kDa之間，等電點介于5.14～9.64之間，其中10個為酸性蛋

白，7個為堿性蛋白（表2）。根據(jù)蛋白親疏水性指標(biāo)，大部分HbPP2基因編碼的蛋白親水性平均系數(shù)在-0.608～-0.178之間，屬于親水性蛋白，HbPP2-B11的親水性平均系數(shù)為正值，屬于疏水性蛋白。HbPP2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)介于31.82～55.04之間，其中HbPP2-B1、HbPP2-A12、HbPP2-A13.2和HbPP2-B11的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白，其余13個均為不穩(wěn)定蛋白。

2.2""HbPP2蛋白亞細胞定位及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對HbPP2基因家族編碼蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示有5個家族成員定位于葉綠體，6個成員定位于細胞核，3個成員定位于胞質(zhì)，2個成員定位于細胞膜和葉綠體，1個成員定位于葉綠體和胞質(zhì)（表3）。對HbPP2蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，有82%蛋白成員的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，18%成員的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成（表3），與17個家族成員的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致（圖1）。

2.3""HbPP2基因結(jié)構(gòu)分析

對橡膠樹17個PP2基因進行多重序列比對并進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示17個基因被劃分為2類。為進一步研究HbPP2基因結(jié)構(gòu)特征，利用MEME軟件對HbPP2家族成員進行保守基序分析。結(jié)果顯示，在Ⅰ亞組中，除了HbPP2-A12缺失motif3和motif5，其余7個成員都包含了motif1～motif6；在Ⅱ亞組中，分別含有2～10個motif，多數(shù)都含有motif7、motif10、motif8和motif9；HbPP2-B13和HbPP2-B11相對其他成員缺失motif7、motif8和motif9，且與Ⅰ亞組成員極少有相同motif（圖2A）。為了更加直觀地呈現(xiàn)HbPP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及其分布，通過NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫分析所有HbPP2家族成員氨基酸序列，結(jié)果顯示HbPP2家族成員均含有PP2結(jié)構(gòu)域（圖2B）。F-box結(jié)構(gòu)域位于HbPP2-A15、HbPP2-A15.1、HbPP2A14、HbPP2A13.2、HbPP2A13、HbPP2A13.1、HbPP2-A13.1、HbPP2-A12.1和HbPP2-B10.1靠近N端的位置（圖2B）。通過橡膠樹基因組注釋文件和HbPP2氨基酸序列對17個家族成員進行基因結(jié)構(gòu)（外顯子和內(nèi)含子）分析，結(jié)果表明，所有成員含有外顯子數(shù)目在1～7個不等，不同基因序列長短存在差異，內(nèi)含子和外顯子的位置也存在差異。其中，HbPP2.A15.1基因序列最長，包含3個外顯子；HbPP2-B15基因包含最多的外顯子數(shù)，且基因兩端均不含UTR區(qū)（圖2C）。

2.4""HbPP2基因啟動子順式作用元件分析

為進一步探究HbPP2基因家族的功能，分別截取17個HbPP2基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000"bp序列作為啟動子區(qū)，利用PlantCARE在線工具對啟動子區(qū)進行順式作用元件預(yù)測，共鑒定到21種啟動子順式作用元件（圖3）。這些作用元件包含198個光響應(yīng)元件、52個甲基茉莉酸響應(yīng)元件、26個脫落酸響應(yīng)元件、22個厭氧誘導(dǎo)元件、16個干旱誘導(dǎo)元件、13個生長素響應(yīng)元件、12個赤霉素應(yīng)答元件、6個分生組織表達元件、5個水楊酸響應(yīng)元件和4個防御和脅迫應(yīng)答元件。HbPP2-B1基因中只存在1個MYBhv1"binging"site非生物脅迫響應(yīng)元件。此外，部分家族成員還包含少數(shù)幾個調(diào)控元件，如玉米素代謝調(diào)控元件、分生組織表達調(diào)控元件和晝夜節(jié)律調(diào)控元件等。

2.5""HbPP2基因家族進化分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫和PlantTFdb數(shù)據(jù)庫分別搜索模式植物擬南芥（30個）和木薯（19個）PP2

氨基酸序列，與橡膠樹17個PP2氨基酸序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。如圖4所示，PP2家族可以分為3個亞組，其中擬南芥PP2的AtPP2-A成員分布于Ⅰ和Ⅱ亞組中，AtPP2-B成員僅分布在Ⅲ亞組，而橡膠樹HbPP2家族成員僅分布在Ⅱ亞組和Ⅲ亞組中，分別與擬南芥的AtPP2-A和AtPP2-B聚集在一起。另外HbPP2大多數(shù)成員均與木薯聚集在Ⅱ亞組和Ⅲ亞組中的同一分支，表明其親緣關(guān)系與木薯更為接近，這與物種進化上橡膠樹與木薯親緣關(guān)系最近相一致[30]。

2.6""HbPP2基因家族成員表達分析

對橡膠樹不同組織（花、莖、膠乳、樹皮、葉片和種子）和不同割膠刀次（1、2、3、5、7、9）膠乳中的HbPP2基因表達水平進行分析（圖5）。結(jié)果表明該基因家族成員具有顯著的組織表達特異性。HbPP2-B15.1、HbPP2-B15、HbPP2-B10和HbPP2-A12.1在葉片中表達量較高，在膠乳中不表達或者低表達，且不受割膠處理誘導(dǎo)。HbPP2-A14.1、HbPP2-A14、HbPP2-A15和HbPP2-B11基因在莖中的表達量較高，但隨著割膠刀次的增加，變化并不明顯。在花組織中沒有明顯高表達的HbPP2基因。HbPP2-A13、HbPP2-A13.1和HbPP2-A12在樹皮中呈現(xiàn)高表達趨勢，但在割膠實驗中的變化趨勢恰好相反。在種子中表達量較高的基因HbPP2-B1.1、HbPP2-B1、HbPP2-B10.1和HbPP2-A13.2，在膠乳中同樣也表現(xiàn)出高表達的趨勢，但隨著連續(xù)的割膠處理，只有HbPP2-B1.1和HbPP2-A13.2的表達水平在不斷升高，HbPP2-B1和HbPP2-B10.1基本上保持著相似的表達趨勢。另外HbPP2-B13和HbPP2-A15.1也在膠乳中特異表達，且HbPP2-B13的表達受割膠誘導(dǎo)。

鑒于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中HbPP2在橡膠樹不同組織割膠處理中均有顯著的表達差異，本研究選擇了6個表達趨勢較為顯著的HbPP2家族成員基因設(shè)計引物，以橡膠樹不同組織（膠乳、葉片、樹皮、花和莖）與不同割次（1、3、5、9）處理的膠乳RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行RT-qPCR分析，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖6、7所示，HbPP2-A13.2、HbPP2-B13、HbPP2-B1.1和HbPP2-B10.1和HbPP2-A14.1在不同組織中的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)高度一致，雖然HbPP2-A15.1在不同組織中的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不完全一致，但整體的表達趨勢一致。HbPP2-A13.2、HbPP2-B13和HbPP2-B1.1在不同割膠處理下均有1個上調(diào)表達的趨勢，HbPP2-B10.1、HbPP2-A15.1和HbPP2-A14.1的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不完全一致，但在不同割膠處理下依舊無顯著變化。綜上所述，RT-qPCR實驗結(jié)果驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3""討論

近年來，隨著橡膠樹基因組的測定，橡膠樹基因家族的研究也得到了迅速發(fā)展，然而對橡膠樹PP2基因家族的研究尚未見報道。早期的研究表明，葫蘆屬中PP2是一個小家族，包含2～8個基因[18]，而WANG等[31]認為PP2蛋白是由較多基因家族成員編碼。本研究中，在擬南芥數(shù)據(jù)庫中共搜索到30個PP2基因，木薯中搜索到19個PP2基因，橡膠樹基因組共鑒定到17個PP2基因，相比較擬南芥而言，數(shù)量差異較大，這表明不同物種之間PP2數(shù)量差異明顯，可能預(yù)示PP2基因隨著物種演化發(fā)生獨立進化?；跀M南芥PP2結(jié)構(gòu)聚類分析顯示該家族分為3個亞組，橡膠樹PP2成員只分布在2個亞組中，在橡膠樹中缺失擬南芥AtPP2-A1～AtPP2-A10"10個同源基因，且木薯的PP2基因在I亞組中僅有4個，進一步預(yù)示大戟科植物在進化過程中該亞組中的基因發(fā)生了變化。另外，根據(jù)已有的研究結(jié)果以及橡膠樹HbPP2在I亞組的缺失現(xiàn)象[20，"32-33]，推測橡膠樹中響應(yīng)生物/非生物脅迫的功能在亞組之間出現(xiàn)了分化。

本研究對橡膠樹基因組鑒定到的17個HbPP2基因進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)橡膠樹PP2家族成員編碼的蛋白中無規(guī)則卷曲和延伸鏈占比較大，而無規(guī)則卷曲一般與酶活性和特異性功能的形成有關(guān)[34]，這表明HbPP2基因可能進化出不一樣的功能。擬南芥AtPP2"II亞群蛋白通過F-box結(jié)構(gòu)域與其他蛋白結(jié)合從而參與調(diào)控許多重要的生物學(xué)過程[19，"35]。在橡膠樹中，11個HbPP2蛋白中含有F-box結(jié)構(gòu)域，其中HbPP2-"A13.2在膠乳中特異性表達并受割膠誘導(dǎo)，表明含有F-box結(jié)構(gòu)域的HbPP2-A13.2蛋白在割膠過程中發(fā)揮作用。HbPP2-B13雖然不包含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域，但在割膠過程中隨著割膠刀次的增加其表達逐漸增強。同樣HbPP2-B10.1和HbPP2-B1在膠乳中特異性表達，在割膠過程中保持一個較高的表達水平，這些蛋白是否具有類似F-box泛素連接酶的作用通過介導(dǎo)其他蛋白的穩(wěn)定性或發(fā)揮凝集素作用來應(yīng)答割膠刺激而參與橡膠樹膠乳合成還需進一步探究。順式作用元件及表達模式分析結(jié)果表明，在膠乳中特異表達的HbPP2-A13.2和HbPP2-B13蛋白含有多個激素誘導(dǎo)元件和抗性應(yīng)答元件并在割膠過程中表達水平逐漸增強，推測HbPP2-A13.2和HbPP2-B13蛋白可能與激素受體蛋白或響應(yīng)脅迫相關(guān)蛋白形成復(fù)合蛋白繼而參與植物激素傳導(dǎo)和應(yīng)答生物/非生物脅迫。HbPP2-"B10.1在種子中也表現(xiàn)出較高表達豐度，可能在合成并儲存營養(yǎng)物質(zhì)上同樣發(fā)揮作用[35-36]。HbPP2-B10、HbPP2-B15和HbPP2-B15.1在發(fā)育組織葉片和莖中表現(xiàn)出較高表達水平并含有大量光響應(yīng)元件和分生組織表達調(diào)控元件，且不受割膠刺激的影響，推測這3個基因可能在植物生長、維持形態(tài)和光合作用物質(zhì)輸送方面發(fā)揮重要作用。HbPP2-A12、HbPP2-A13和HbPP2-A13.1在樹皮中表現(xiàn)較高表達水平，但不受割膠誘導(dǎo)，說明這3個基因可能只參與了樹皮的生長發(fā)育過程。HbPP2-A15.1不僅在膠乳中也在樹皮中表現(xiàn)出較高的表達水平，在割膠過程中也出現(xiàn)1個上調(diào)的趨勢，說明該基因在割膠傷害過程中會啟動應(yīng)答機制。綜上，不同HbPP2基因家族在不同組織中的表達水平出現(xiàn)明顯的差異，表明橡膠樹HbPP2基因家族在組織表達特異性及功能特異性上具有分化差異。

本研究首次從巴西橡膠樹中鑒定出HbPP2基因，并從基因家族成員鑒定、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件和表達模式等方面對HbPP2家族成員進行全面分析，對不同組織和不同割膠刀次膠乳中HbPP2家族成員表達模式進行分析，從中篩選出膠乳特異表達的HbPP2基因。本研究為進一步探索PP2基因家族在橡膠樹膠乳合成代謝調(diào)控中的功能提供了理論基礎(chǔ)。

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