鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的差異表達(dá)

摘要：采用Illumina HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）根2個(gè)不同部位（根尖區(qū)和根成熟區(qū)）樣品進(jìn)行測(cè)序，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類和KEGG分析。結(jié)果表明，鐵皮石斛根的高質(zhì)量讀長(zhǎng)被組裝成136 541個(gè)單基因，平均長(zhǎng)度為982 bp。對(duì)具有編碼轉(zhuǎn)錄因子能力的基因進(jìn)行鑒定和分類統(tǒng)計(jì)，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中，共識(shí)別了148個(gè)MADS-box、737個(gè)NAC、449個(gè)WRKY、369個(gè)MYB和105個(gè)ARF等。差異表達(dá)基因的調(diào)控通路涉及很多途徑，包括苯丙烷生物合成等次生代謝途徑、植物病原體相互作用等環(huán)境應(yīng)答途徑以及植物MAPK信號(hào)通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）；根；發(fā)育；基因； 轉(zhuǎn)錄模式； 轉(zhuǎn)錄因子；差異表達(dá)

中圖分類號(hào)：S567.23" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " "文章編號(hào)：0439-8114（2025）02-0207-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.033 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The Illumina HiSeqTM4000 sequencing platform was used to sequence samples from two different parts of Dendrobium officinale roots （root tip and mature zone）， and GO clustering and KEGG analysis were performed on differentially expressed genes. The results showed that the high-quality reading length of Dendrobium officinale roots was assembled into 136 541 single genes with an average length of 982 bp. Identification and classification statistics were conducted on genes with the ability to encode transcription factors， and 2105 single genes were mapped to 55 categories of transcription factors. A total of 148 MADS boxes， 737 NACs， 449 WRKYs， 369 MYBs， and 105 ARFs were identified. The regulatory pathways of differentially expressed genes involved many pathways， including secondary metabolic pathways such as phenylpropanoid biosynthesis， environmental response pathways such as plant-pathogen interactions， and signal transduction pathways such as plant MAPK signaling pathway.

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬藥用植物。其性微寒，味甘，益胃生津，滋陰清熱，主要用于病后虛熱、熱病傷津以及口干煩渴等癥［1，2］。藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛具有促進(jìn)消化、降血糖、抗衰老和增強(qiáng)人體免疫力等作用［3］。鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較高，自然繁殖緩慢，野生資源逐漸減少，對(duì)其開(kāi)展生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究十分重要。

基于高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄模式分析在序列組裝、基因表達(dá)分析、功能聚類和調(diào)控通路預(yù)測(cè)等領(lǐng)域有明顯的優(yōu)勢(shì)［4］。利用鐵皮石斛莖測(cè)序數(shù)據(jù)，識(shí)別了36 407個(gè)組裝基因，69.97%獲得注釋，鑒定了生物堿生物合成的數(shù)個(gè)關(guān)鍵基因［5］。利用測(cè)序技術(shù)研究鐵皮石斛低溫脅迫下的基因表達(dá)和代謝變化，發(fā)現(xiàn)包括CBF和MAP3K激酶在內(nèi)的2 767個(gè)基因表達(dá)受冷脅迫調(diào)控［6］。鐵皮石斛葉轉(zhuǎn)錄組分析揭示了" "9 892個(gè)SSR位點(diǎn)及堿基組成特點(diǎn)［7］。利用鐵皮石斛2個(gè)生長(zhǎng)階段莖和葉的測(cè)序數(shù)據(jù)，識(shí)別了48個(gè)黃酮類化合物代謝相關(guān)基因［8］。蘭科菌根真菌能促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)，利用測(cè)序識(shí)別了427～749個(gè)小菇誘導(dǎo)和抑制基因［9］。通過(guò)研究鐵皮石斛早期、中期、開(kāi)放期花的轉(zhuǎn)錄模式變化和代謝差異，發(fā)現(xiàn)包括MADS家族在內(nèi)的8 019個(gè)差異表達(dá)基因和239個(gè)分化代謝產(chǎn)物［10］。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄模式研究鐵皮石斛3種不同組織中的總黃酮含量與黃酮類化合物生物合成途徑基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系［11］。利用鐵皮石斛自花授粉與雜交授粉的基因表達(dá)差異研究授粉的分子機(jī)制［12］。利用鹽脅迫下的鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄變化，鑒定參與茉莉酸生物合成途徑的基因表達(dá)水平以及參與類黃酮合成途徑的蘆丁合成基因表達(dá)模式［13］。通過(guò)比較1～4年生鐵皮石斛莖轉(zhuǎn)錄組揭示黃酮類化合物累積的分子機(jī)制［14］。利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析揭示瘤菌根菌對(duì)鐵皮石斛的促生機(jī)制，找到262條差異表達(dá)基因和瘤菌根菌促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因［15］。利用生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄模式分析識(shí)別鐵皮石斛低氮脅迫應(yīng)答基因，發(fā)現(xiàn)氮和碳代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗氧化應(yīng)激等生物過(guò)程可能與其低氮適應(yīng)密切相關(guān)［16］。

鐵皮石斛是根器官生長(zhǎng)發(fā)育分子機(jī)制研究的理想材料。本研究對(duì)鐵皮石斛根不同部位樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄模式對(duì)比，鑒定差異表達(dá)基因，識(shí)別調(diào)控通路。同時(shí)，利用鐵皮石斛根測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)MADS、NAC、WRKY、MYB和ARF等代表性轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行識(shí)別，列舉顯著差異表達(dá)的家族成員。為進(jìn)一步深入研究鐵皮石斛根發(fā)育機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，栽培基質(zhì)為碎松樹(shù)皮，人工氣候室（22 ℃，光照14 h/d）。取300株生長(zhǎng)一致的鐵皮石斛，分為6組。仔細(xì)沖洗去除基質(zhì)，取根尖區(qū)（前端0.5 cm）和根成熟區(qū)（中部0.5 cm）2個(gè)部位（圖1）。設(shè)置3次重復(fù)，分別記為根尖區(qū)1、根尖區(qū)2、根尖區(qū)3和根成熟區(qū)1、根成熟區(qū)2、根成熟區(qū)3，液氮冷凍用于測(cè)序。

1.2 測(cè)序與過(guò)濾

利用華大公司的Illumina HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。利用SOAPnuke（v1.5.2）過(guò)濾原始數(shù)據(jù)，包括刪除“污染”讀長(zhǎng)（Reads）；刪除未知堿基超過(guò)10%的讀長(zhǎng)；刪除低質(zhì)量堿基超過(guò)50%的讀長(zhǎng)，以FASTQ格式存儲(chǔ)。

1.3 組裝與注釋

利用Trinity（v2.0.6）從頭組裝，利用BUSCO檢測(cè)組裝質(zhì)量；利用Transdecoder（v3.0.1）對(duì)單基因（Unigene）進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測(cè)；利用Nr、Nt、GO、Kog、Swissprot、Kegg、Orthology和Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。

1.4 表達(dá)量與差異表達(dá)分析

利用RSEM（v1.2.8）計(jì)算Unigene表達(dá)量，利用DESeq進(jìn)行組內(nèi)差異表達(dá)計(jì)算，以Fold Change（FC）大于2倍且P≤0.05作為判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)GO和KEGG注釋和分類，對(duì)基因聚類分析，Q≤0.05作為候選基因進(jìn)行顯著富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序與注釋

對(duì)鐵皮石斛根2個(gè)部位共6個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，獲得讀長(zhǎng)（Reads）數(shù)據(jù)，所有樣本過(guò)濾后讀長(zhǎng)Q20均大于97.00%，Q30均大于93.00%（表1）。各樣本從頭組裝，合并數(shù)據(jù)后共獲得136 541個(gè)長(zhǎng)的、非冗余單基因（Unigene），平均長(zhǎng)度982 nt（圖2）。對(duì)具有編碼轉(zhuǎn)錄因子（TF）能力的基因進(jìn)行鑒定和分類統(tǒng)計(jì)，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中，包括bHLH（887個(gè)）、MYB（823個(gè)）、NAC（737個(gè)）、ERF（571個(gè)）、C2H2（551個(gè)）、G2-like（461個(gè)）、WRKY（449個(gè)）、C3H（383個(gè)）、MYB（369個(gè)）、FAR1（365個(gè)）、bZIP（355個(gè)）、ARF（105個(gè)）、MADS-box（148個(gè)）和B3（336個(gè)）等。

2.2 差異表達(dá)基因

本試驗(yàn)獲得了鐵皮石斛根2個(gè)部位之間的差異表達(dá)基因（Differentially expressed gene，DEG）。相校于根尖區(qū)，根成熟區(qū)有上調(diào)基因245個(gè)，下調(diào)基因563個(gè)。表2分別為上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)量排前10的基因。圖3為差異表達(dá)基因的火山圖和聚類熱圖，表明鐵皮石斛根2個(gè)部位基因表達(dá)存在顯著差異。

2.3 基因功能聚類和調(diào)控通路分析

對(duì)鐵皮石斛根2個(gè)部位的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類，分析顯著富集程度較高的功能聚類。表3為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能中較典型的5個(gè)功能聚類。同時(shí)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG調(diào)控通路分析（圖4），結(jié)果表明，差異表達(dá)基因的調(diào)控通路涉及很多途徑，包括苯丙烷生物合成等次生代謝途徑、植物病原體相互作用等環(huán)境應(yīng)答途徑以及植物MAPK信號(hào)通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子（TF）差異表達(dá)分析

在植物中MADS-box、NAC、WRKY、MYB和生長(zhǎng)素應(yīng)答因子（Auxin response factor，ARF）等轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答等方面起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。為了推斷這些轉(zhuǎn)錄因子在鐵皮石斛根發(fā)育中的作用，在基因組范圍內(nèi)識(shí)別了這些編碼序列。鐵皮石斛根共識(shí)別了148個(gè)MADS-box、737個(gè)NAC、449個(gè)WRKY、369個(gè)MYB和105個(gè)ARF等。表4為MADS-box、NAC、WRKY、MYB和ARF轉(zhuǎn)錄因子的FPKM和差異表達(dá)，結(jié)果表明，很多基因呈現(xiàn)明顯的差異表達(dá)特征，如MADS基因家族的Unigene25348-S6（注釋為鳥(niǎo)苷核苷酸二磷酸解離抑制劑At5g09550亞型X3），在根尖區(qū)相對(duì)表達(dá)量為0.36，而在根成熟區(qū)相對(duì)表達(dá)量為11.11，發(fā)生了顯著上調(diào)；而WRKY基因家族的Unigene32640-S1（注釋為內(nèi)切葡聚糖酶19），在根尖區(qū)相對(duì)表達(dá)量為13.47，而在根成熟區(qū)相對(duì)表達(dá)量為0.96，發(fā)生了顯著下調(diào)。

3 小結(jié)與討論

3.1 鐵皮石斛測(cè)序

基于高通量RNA測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在序列組裝、基因識(shí)別與表達(dá)、基因功能聚類和基因調(diào)控通路預(yù)測(cè)等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。鐵皮石斛是珍稀藥用植物，利用高通量測(cè)序研究，產(chǎn)生了553 084個(gè)平均長(zhǎng)度為417個(gè)堿基的EST。將EST組裝成36 407個(gè)獨(dú)特的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄本，其中69.97%獲得注釋，推測(cè)生物堿生物合成途徑，鑒定生物堿生物合成的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)參與生物堿生物合成的5個(gè)關(guān)鍵酶編碼基因在鐵皮石斛葉片中的表達(dá)水平高于莖［5］。隨后，基于高通量RNA測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析方法對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行深入研究。如使用鐵皮石斛莖（生長(zhǎng)期和成熟期）和葉（生長(zhǎng)期和成熟期）作為試驗(yàn)材料，利用Illumina HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)開(kāi)展高通量測(cè)序，組裝后共獲得43 085條單基因，根據(jù)Pathway分析代謝通路以及鐵皮石斛黃酮類成分?jǐn)?shù)據(jù)，推測(cè)其黃酮類化合物的生物合成途徑，識(shí)別出48個(gè)黃酮類化合物代謝關(guān)鍵基因［8］。本研究對(duì)鐵皮石斛根不同部位進(jìn)行測(cè)序，組裝后獲得136 541個(gè)單基因。

3.2 鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式

根是植物的重要營(yíng)養(yǎng)器官，根的發(fā)育對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)、抗逆與藥效物質(zhì)積累具有顯著促進(jìn)作用。為探究鐵皮石斛根發(fā)育的轉(zhuǎn)錄模式，本試驗(yàn)對(duì)鐵皮石斛根不同發(fā)育程度的2個(gè)部位進(jìn)行分析，獲得差異表達(dá)基因。在研究中，相較于根尖區(qū)，根成熟區(qū)有上調(diào)基因245個(gè)，下調(diào)基因563個(gè)，表明鐵皮石斛根2個(gè)部位之間基因表達(dá)存在顯著差異，這些表達(dá)上有差異的基因成為根發(fā)育研究的重要候選基因。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的差異表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，能與基因5′端上游特定序列專一性結(jié)合。本研究利用基因的注釋比對(duì)，20 105個(gè)單基因被映射到55類轉(zhuǎn)錄因子中。其中，NAC、WRKY、MADS、MYB和ARF是有代表性的轉(zhuǎn)錄因子。這類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆等方面具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。WANG等［17］利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定茶的NAC轉(zhuǎn)錄因子，包括45個(gè)編碼蛋白的CsNAC基因，并分為17個(gè)亞組，研究這些基因在不同組織（根、莖、成熟葉、幼葉和芽）以及不同環(huán)境脅迫（干旱、鹽、熱、冷和脫落酸）下的表達(dá)模式，預(yù)測(cè)基因可能具有的功能。GOYAL等［18］利用甘草轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定了147個(gè)全長(zhǎng)WRKY基因，識(shí)別了啟動(dòng)子區(qū)和誘導(dǎo)因子?；谵D(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要功能，本研究利用鐵皮石斛根的測(cè)序數(shù)據(jù)，識(shí)別了MADS-box、NAC、WRKY、MYB和ARF等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量差異，并推測(cè)這些基因在鐵皮石斛根器官中的功能，為今后克隆關(guān)鍵基因和系統(tǒng)研究根發(fā)育分子機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-04-12

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)課題研究資助項(xiàng)目（QZYY-2024-115）；貴州省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK［2022］一般481）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（貴中醫(yī)博士啟動(dòng)［2019］076號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：陳宏宇（1981-），男，黑龍江齊齊哈爾人，講師，博士，主要從事藥用植物學(xué)研究，（電話）18745117417（電子信箱）chy810501@163.com。