番茄褪綠病毒外殼蛋白多克隆抗體的制備和應(yīng)用

摘要：為建立番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）的快速檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆病毒的主要外殼蛋白（Coat protein，CP）基因，利用Gateway技術(shù)將其重組至原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，將純化后的CP作為抗原免疫日本大耳兔制備ToCV CP多克隆抗體。間接ELISA顯示ToCV CP多克隆抗體的效價(jià)為1∶12 800；Western blot和田間試驗(yàn)結(jié)果顯示多克隆抗體有很好的特異性和靈敏度。ToCV CP多克隆抗體可用于田間ToCV的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：番茄褪綠病毒（ToCV）；外殼蛋白（CP）；原核表達(dá)；多克隆抗體；制備

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.41" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " 文章編號(hào)：0439-8114（2025）02-0197-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.031 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to establish a rapid detection technology for the tomato chlorosis virus （ToCV）， the coat protein （CP） gene of the virus was cloned by RT-PCR technology， and it was recombinant into a prokaryotic expression vector using Gateway technology. It was then transformed into Escherichia coli BL21 strain for induction of expression. The purified CP protein was used as an antigen to prepare a ToCV CP polyclonal antibody by immunizing Japanese rabbits. Indirect ELISA showed that the titer of the ToCV CP polyclonal antibody was 1∶12 800. Western blot and field experiments had shown that the ToCV CP polyclonal antibody had good specificity and sensitivity. The ToCV CP" polyclonal antibody could be used for the detection of ToCV in the field.

番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus， ToCV）是正單鏈RNA病毒，隸屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），在自然條件下主要通過(guò)煙粉虱（Bemisia tabaci）和紋翅粉虱（Trialeurodes abutilonea）等粉虱科（Aleyrodidae）昆蟲(chóng)以半持久性方式傳播［1-3］。番茄褪綠病毒粒體形態(tài)為彎曲棒狀，長(zhǎng)度800～850 nm，基因組包含2條正義RNA單鏈（RNA1和RNA2），其中RNA1鏈包含4個(gè)ORFs（Open reading frames），RNA2鏈包含9個(gè)ORFs［4-6］。RNA2含有2個(gè)重復(fù)的外殼蛋白ORFs，分別編碼主要外殼蛋白（Coat protein，CP）和次要外殼蛋白（Minor coat protein，CPm），CP的功能主要為包裹病毒核酸，CPm則與病毒粒子末端的形成相關(guān)［7-9］。

ToCV侵染番茄、煙草等寄主植物后，早期癥狀包括葉脈間的輕微泛黃，類(lèi)似營(yíng)養(yǎng)缺乏，后期整株出現(xiàn)黃化癥狀，葉片變厚變脆，直至干燥脫落［3］。染病番茄植株的果實(shí)較小、呈白色，果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)均下降，甚至絕收，給番茄的健康和安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響［10］。ToCV于20世紀(jì)90年代中期在美國(guó)佛羅里達(dá)州首次被發(fā)現(xiàn)［11］，現(xiàn)已蔓延至世界各地［12-14］。2004年中國(guó)臺(tái)灣省報(bào)道了ToCV［15］，之后該病毒快速擴(kuò)散傳播，目前已在17個(gè)省份陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。目前在中國(guó)ToCV已成為一種危害嚴(yán)重、影響范圍廣的新型流行病毒。由于缺乏針對(duì)該病毒的有效防控藥劑，所以快速診斷對(duì)其防控尤為關(guān)鍵。因此，本研究通過(guò)制備ToCV CP的多克隆抗體，建立ToCV快速檢測(cè)方法，為田間番茄褪綠病毒病的快速診斷和預(yù)報(bào)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大腸桿菌（Escherichia coli） BL21感受態(tài)細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；含ToCV的煙草葉片來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所；制備多克隆抗體所需的雄性日本大耳兔購(gòu)自湖北省荊州市中心醫(yī)院動(dòng)物研究中心。

1.2 主要試劑

Trizol試劑、2×HiFi Taq PCR StarMix、反轉(zhuǎn)錄酶以及純化所需的金屬鎳高流速瓊脂糖親和介質(zhì)（NTA）均購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DL 2000 DNA Marker、Protein Marker、T4 DNA Ligase均購(gòu)自Takara公司；ECL顯色液、Protein Ladder、PVDF膜、酶標(biāo)板均購(gòu)自Thermo Scientific公司；TMB顯色液（組化或膜HRP顯色用）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；Gateway系統(tǒng)載體pDONR221和pDEST17、BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix均購(gòu)自Invitrogen公司；特異性引物由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 ToCV CP基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用Trizol試劑從感染ToCV的煙草葉片中提取總RNA，利用特異引物（表1）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×HiFi Taq PCR StarMix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，去離子水10.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃" " " " 5 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。隨后根據(jù)Invitrogen公司BP Clonase Enzyme Mix說(shuō)明書(shū)將純化回收到的片段連接到載體pDONR221上并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆并送往武漢華大基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)序列鑒定正確的克隆子pDONR221-CP進(jìn)行過(guò)夜搖菌并提取質(zhì)粒。利用LR Clonase Enzyme Mix將pDONR221-CP中CP片段重組到原核表達(dá)載體pDEST17上，經(jīng)氨芐霉素篩選陽(yáng)性克隆pDEST7-CP，并提取質(zhì)粒備用。

1.3.2 pDEST17-ToCV CP的原核表達(dá)

將質(zhì)粒pDEST17-CP轉(zhuǎn)入Escherichia coil BL21感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)菌落PCR挑選陽(yáng)性克隆子；將驗(yàn)證正確的克隆子菌液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.6～0.8，然后加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使培養(yǎng)液IPTG的終濃度為1 mmol/L，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；離心收集菌體，采用1×PBS緩沖液重懸菌體后進(jìn)行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳。

1.3.3 CP可溶性分析及純化復(fù)性

誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體并加入10 mL細(xì)胞裂解液，于37 ℃培養(yǎng)箱裂解30 min，使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎后離心，分別取沉淀、上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)抗原的可溶性，選擇上清液或沉淀，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后通過(guò)Ni2+-NTA層析柱，經(jīng)不同濃度（20、40、80 mmol/L）咪唑洗脫液純化獲得抗原CP。

將層析后得到的CP進(jìn)行透析復(fù)性，在透析結(jié)束后收集透析液并將其置于-80 ℃環(huán)境中冷凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純化的CP。

1.3.4 ToCV CP多克隆抗體的制備及其效價(jià)測(cè)定

用純化的CP作為免疫原免疫成年雄性日本大耳兔來(lái)制備ToCV CP多克隆抗體。將300 μg純化CP和完全弗氏佐劑（初次免疫）或不完全弗氏佐劑（增強(qiáng)免疫）等量混合均勻，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。共進(jìn)行4次免疫，每次免疫間隔7 d，第4次免疫2周后取全血，37 ℃靜置1 h，4 ℃靜置過(guò)夜，離心收集上清液，得到含ToCV CP多克隆抗體的血清。分別以染病、健康本氏煙作為抗原，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，采用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。

1.3.5 Western blot檢測(cè)多克隆抗體的特異性和靈敏度

多克隆抗體特異性檢測(cè)參考文獻(xiàn)［16］的方法。提取攜帶ToCV的本氏煙及健康的本氏煙總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)以抗原蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。采用濕轉(zhuǎn)方法（250 mA，120 min）將總蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以制備的ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，顯色檢測(cè)表達(dá)的重組CP。

多克隆抗體的靈敏度檢測(cè)參考李雨珈等［17］的方法。將抗原蛋白從0.5 mg溶于1 mL PBS開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)静∪~片0.1 g溶于1 mL PBS開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)M(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.3.6 利用ToCV CP多克隆抗體進(jìn)行番茄褪綠病毒的田間檢測(cè)

利用制備的ToCV CP多克隆抗體通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)試驗(yàn)田的66株煙草植株（已經(jīng)通過(guò)RT-PCR確診病原），用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm，記錄后分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ToCV CP基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

從染病的本氏煙葉片中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得大小約774 bp的片段，該片段大小符合預(yù)期（圖1a）。利用Gateway重組獲得重組載體pDONR221-CP，菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆子經(jīng)武漢華大基因有限公司測(cè)序證實(shí)插入的序列以及讀框碼正確，同時(shí)經(jīng)LR重組酶進(jìn)行LR重組反應(yīng)獲得重組原核表達(dá)載體pDEST17-CP，提取陽(yáng)性克隆子的質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定獲得符合預(yù)期大小約774 bp的片段（圖1b）。

2.2 CP可溶性分析及純化

采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將破碎細(xì)胞的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。與上清液樣品的泳道相比，沉淀樣品所在的泳道存在一條明顯的目的條帶（圖2a），可見(jiàn)沉淀中所含目的蛋白含量遠(yuǎn)高于上清液，CP主要以包涵體形式存在。接著采用Ni2+-NTA層析柱對(duì)CP進(jìn)行純化，泳道2和3均有單一且大小與預(yù)期一致的條帶，表明CP純化成功（圖2b）。

2.3 間接ELISA檢測(cè)抗體的效價(jià)

分別以染病、健康本氏煙作為抗原，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，采用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，以陽(yáng)性O(shè)D450 nm/陰性O(shè)D450 nmgt;2為判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果（圖3）表明，濃度為0.100 g/mL的染病本氏煙汁液可以與稀釋12 800倍的ToCV CP多克隆抗體產(chǎn)生陽(yáng)性免疫反應(yīng)，說(shuō)明ToCV CP多克隆抗體的效價(jià)為1∶12 800。

2.4 Western blot檢測(cè)多克隆抗體的特異性和靈敏度

2.4.1 Western blot檢測(cè)多克隆抗體的特異性

以染病本氏煙植株和健康本氏煙植株提取的總蛋白為樣品，純化的抗原蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，ToCV CP多克隆抗體能特異性識(shí)別染病植株中CP（28.70 ku左右），陽(yáng)性對(duì)照也能檢測(cè)到31.30 ku左右的蛋白，但健康本氏煙樣品沒(méi)有檢測(cè)到該蛋白（圖4），說(shuō)明獲得的ToCV CP多克隆抗體具有很好的特異性。

2.4.2 Western blot檢測(cè)ToCV CP多克隆抗體的靈敏度

以0.100 g/mL的染病本氏煙汁液為起始濃度，按1∶10進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)琖estern blot檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果（圖5a）顯示，ToCV CP多克隆抗體能檢測(cè)到的染病本氏煙汁液濃度為0.010 g/mL；同時(shí)以0.5 mg/mL抗原蛋白作為起始濃度按1∶10進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)静煵莶《荆ń】禑煵荩￤estern blot檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果（圖5b）顯示，ToCV CP多克隆抗體能檢測(cè)到的抗原蛋白濃度為0.005 0 mg/mL。

2.5 利用多克隆抗體進(jìn)行番茄褪綠病毒的田間檢測(cè)

使用制備的ToCV CP多克隆抗體對(duì)試驗(yàn)田中通過(guò)RT-PCR檢測(cè)的66株煙草樣品（包括辣椒脈斑駁病毒病株21株，馬鈴薯Y病毒病株18株，煙草花葉病毒病株14株，番茄褪綠病毒病株6株，健康植株7株）進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表2、表3所示，有6株煙草樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，該結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明制備的ToCV CP多克隆抗體有較強(qiáng)的特異性，能用于田間樣品的檢測(cè)。

3 討論與小結(jié)

3.1 討論

植物病毒病被稱(chēng)為“植物癌癥”，是僅次于真菌病害的第二大植物病害，能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)重危害［18-20］。自1988年美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)ToCV以來(lái)，世界多地均陸續(xù)報(bào)道了ToCV侵染植物的記錄。ToCV不僅可以侵染茄科（Solanaceae）、菊科（Compositae）、藜科（Chenopodiaceae）、夾竹桃科（Chenopodiaceae）等多科不同屬的植物［21-23］，包括經(jīng)濟(jì)作物、觀賞植物，還可以侵染如苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）等常見(jiàn)雜草［24］。2020年中國(guó)報(bào)道了ToCV侵染黃瓜（Cucumis sativus）的記錄［25］，隨著ToCV變異株的增多，未來(lái)ToCV的寄主范圍可能會(huì)變得更加廣泛。為有效預(yù)防ToCV的傳播，迫切需要開(kāi)發(fā)出一種快速、高效、靈敏的病毒檢測(cè)技術(shù)。目前，檢測(cè)ToCV的方法主要是RT-PCR技術(shù)。RT-PCR技術(shù)是通過(guò)病毒的核酸來(lái)檢測(cè)病毒，該技術(shù)特異性強(qiáng)且可用于檢測(cè)更低數(shù)量級(jí)的病毒，但它有成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)儀器的依賴(lài)度高等缺點(diǎn)。因此，具有操作簡(jiǎn)便、迅速、可批量檢測(cè)樣品的血清學(xué)方法被廣泛運(yùn)用于病毒檢測(cè)［26-28］，但ToCV的血清學(xué)檢測(cè)方法鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)克隆ToCV中保守性高且在病毒侵染時(shí)不可缺少的CP基因來(lái)制備多克隆抗體，從而建立檢測(cè)ToCV的血清學(xué)方法。

3.2 小結(jié)

本研究采用了與傳統(tǒng)基因克隆方法不同的Gateway重組技術(shù)將目的基因重組到表達(dá)載體上，一方面Gateway重組技術(shù)操作更簡(jiǎn)便快速，可極大提高試驗(yàn)效率；另一方面利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)更容易得到大量的高純度抗原蛋白［29-32］。本研究首先利用ToCV特異性引物對(duì)CP基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，接著采用Gateway重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化至Escherichia coil BL21細(xì)胞中，菌落PCR驗(yàn)證及陽(yáng)性克隆測(cè)序。選取序列正確的菌株， IPTG誘導(dǎo)Escherichia coil BL21表達(dá)CP，將成功表達(dá)CP的菌株進(jìn)行裂解、破碎以及SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)等一系列操作后確認(rèn)CP為包涵體蛋白。進(jìn)而采用Ni2+-NTA層析柱獲得大量純化的CP，將純化的CP作為抗原免疫日本大耳兔制備ToCV CP多克隆抗體。間接ELISA和Western blot檢測(cè)結(jié)果可知制備的ToCV CP多克隆抗體效價(jià)為1∶12 800，且具有很好的特異性和靈敏度。此外，田間病株的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果也顯示ToCV CP多克隆抗體能夠特異性檢測(cè)ToCV病株。這表明本研究制備的ToCV CP多克隆抗體可用于田間番茄褪綠病毒的檢測(cè)，同時(shí)也為研究病毒外殼蛋白的功能及其與寄主間互作奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-03-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31972243）；廣西作物病蟲(chóng)害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目（22-035-31-22KF03）

作者簡(jiǎn)介：伍維蘭（1999-），女，重慶梁平人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)椴《颈O(jiān)測(cè)與分子病毒學(xué)，（電話）17302361878（電子信箱）weilan_wu@163.com；通信作者，郭靈芳（1977-），女，湖北黃梅人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事化學(xué)生物學(xué)研究，（電子信箱）glf0498104@163.com；共同通信作者，章松柏（1978-），男，湖北黃梅人，教授，主要從事病毒監(jiān)測(cè)與分子病毒學(xué)研究，（電子信箱）yangtze2008@126.com。