基于糖基功能化磁性納米顆粒材料富集-熒光法快速檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌

摘要：基于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）對糖基功能化磁性納米顆粒材料特異性識別和銅綠假單胞菌分泌明膠酶的特點，誘導(dǎo)負載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC的釋放，采用熒光分光光度計測定功能化納米纖維膜的熒光強度，建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法。該方法采用糖基功能化磁性納米顆粒材料富集銅綠假單胞菌，250 mL飲用水中糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量為5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時間為6 h，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時間為30 min，檢驗時間小于8 h，方法檢出限為0.004 CFU/mL，特異性強。相較于GB 8538—2022《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》中的檢測方法，該方法縮短了檢測時間，且檢出限能夠滿足監(jiān)管需要，可作為傳統(tǒng)檢測方法的有益補充。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；糖基功能化；磁性納米顆粒材料；富集；熒光；快速檢測；包裝飲用水

中圖分類號：TS207.3" " " " "文獻標識碼：A" " " " " " "文章編號：0439-8114（2025）02-0171-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.027 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： Based on the specific recognition of glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials by Pseudomonas aeruginosa and the secretion of gelatinase by Pseudomonas aeruginosa， the release of FITC was induced from load GNP@FITC functionalized nanofiber membrane. The fluorescence intensity of functionalized nanofiber membrane was measured using a fluorescence spectrophotometer to establish a rapid detection method for Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water. This method used glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials to enrich Pseudomonas aeruginosa. The amount of glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials added to 250 mL of drinking water was 5.00 mg， and the optimal co culture time between glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials and Pseudomonas aeruginosa was 6 hours. The optimal co-culture time between load GNP@FITC functionalized nanofiber membrane and Pseudomonas aeruginosa was 30 minutes， with a test time of less than 8 hours. The detection limit of the method was 0.004 CFU/mL， indicating strong specificity. Compared with the testing method in GB 8538—2022 ‘National Food Safety Standard for Drinking Natural Mineral Water Inspection Method’， this method shortened the testing time and the detection limit could meet regulatory needs， making it a useful supplement to traditional testing methods.

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常見的水源性和食源性革蘭氏陰性條件致病菌［1-3］，對紫外線、消毒劑等具有較強的抵抗力［4-6］，嚴重危害人類的健康［7-10］。隨著人們生活節(jié)奏的加快，包裝飲用水因其方便快捷的特點成為中國發(fā)展最快的食品產(chǎn)業(yè)之一［11］，近年來，國內(nèi)外關(guān)于包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢出的報道層出不窮［12-16］。因此，急需加強監(jiān)管力度來保障居民包裝飲用水的安全性，快速且準確的檢測技術(shù)是實現(xiàn)有效監(jiān)管的重要手段。

目前實驗室對包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測主要參照GB 8538—2022《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》，根據(jù)單菌落的數(shù)量計數(shù)。該方法成熟、準確，但過程繁瑣且周期長，這不僅會加重食品行業(yè)的倉儲成本，而且難以適應(yīng)重大活動中食品安全保障的時效性要求。馮秀娟等［17］建立核酸等溫環(huán)介導(dǎo)擴增熒光法檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法，該方法具有良好的重復(fù)性，特異性較強，用時縮短至18 h，方法檢測限為103 CFU/mL。有學(xué)者基于適配體的生物傳感器技術(shù)檢測銅綠假單胞菌，其最低檢出限可達50 CFU/mL［18，19］，王芳妹等［20］針對銅綠假單胞菌pcrL和16S rRNA基因的V3～V4區(qū)保守序列設(shè)計引物和探針，建立銅綠假單胞菌的實時熒光定量PCR技術(shù)，該方法特異性好、靈敏度高，檢出限可達10 CFU/mL。劉輝等［21］建立重組酶聚合酶擴增法檢測瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌的分析方法，該方法能特異、準確、高效地檢測銅綠假單胞菌，對人工污染的水樣最低檢出限為36 CFU/mL，且重復(fù)性好。龍慧等［22］根據(jù)國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中uidA和gyrB基因序列設(shè)計引物和探針，構(gòu)建多重熒光定量PCR檢測體系，同時檢測桶裝水中的大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌，該方法檢測周期短、靈敏度高，大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌的檢測限均為102 CFU/mL。上述研究方法雖然在檢測時效上相較于傳統(tǒng)方法有了較大提升，但是方法檢出限均無法滿足現(xiàn)行監(jiān)管需求，因GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》規(guī)定包裝飲用水中不得檢出銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌濃度小于0.004 CFU/mL，視為未檢出），對于低含量銅綠假單胞菌污染的包裝飲用水，采用上述方法存在假陰性風(fēng)險，因此建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速、靈敏、滿足監(jiān)管需要的檢測方法極為重要。

細菌的凝集素（碳水化合物結(jié)合蛋白）與宿主組織上的聚糖特異性相互作用。銅綠假單胞菌的LecA是特異性靶向半乳糖的凝集素，可以促進細菌內(nèi)化至細胞［23］。銅綠假單胞菌的LecB可以強烈結(jié)合巖藻糖和含巖藻糖的寡糖，有助于細菌粘附到氣道上皮細胞［24］。在體外和體內(nèi)研究中，銅綠假單胞菌的生物膜形成被LecA和LecB抑制［25］。本研究基于銅綠假單胞菌對半乳糖和巖藻糖及其衍生物的特異性識別［26］，實現(xiàn)雙糖磁性納米粒子對銅綠假單胞菌的特異性富集吸附，同時利用銅綠假單胞菌代謝明膠酶的特征，誘導(dǎo)負載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC（異硫氰酸熒光素）的釋放，通過功能化納米纖維膜熒光強度的變化實現(xiàn)對包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS7-H550-Pro型磁力攪拌器（武漢科爾儀器設(shè)備有限公司）；TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀（濟南上地電子科技有限公司）；GeminiSEM 300型發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國ZEISS公司）；LakeShore7404型磁滯回線（天津研塔科技有限公司）；TG209F1型熱重分析儀［耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有限公司］；F97pro型熒光分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；DSA30S型接觸角測量儀（德國克呂士公司）；ZEN3600型馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；UV-2700型紫外可見分光光度計（島津儀器有限公司）。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）和大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922）購自南京樂珍生物科技有限公司；糞鏈球菌（Streptococcus faecalis BNCC337174）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens BNCC317723）購自ATCC美國菌種保藏中心；明膠（藥用級，膠強度約240 g Bloom）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）購自上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛水溶液（20%）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；糖基功能化磁性納米顆粒、負載異硫氰酸熒光素包裹的明膠納米粒子（GNP@FITC）功能化納米纖維膜均由武漢紡織大學(xué)提供。

1.2 包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測

稱取5 mg糖基功能化磁性納米顆粒置于250 mL包裝飲用水中，于160 r/min的搖床中，37 ℃條件下振蕩30 min，用磁鐵將糖基功能化磁性納米顆粒材料吸附至底部，倒掉上層菌液，然后加入20 mL液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)6 h。將負載GNP@FITC功能化納米纖維膜置于培養(yǎng)基中，30 min后用熒光分光光度計測定納米纖維膜熒光強度，如圖1所示。通過I與I0的比值（I/I0）是否小于0.7來確定該包裝飲用水中是否含有銅綠假單胞菌（I為培養(yǎng)30 min后負載GNP@FITC功能化納米纖維膜的熒光強度，I0為培養(yǎng)0 min時負載GNP@FITC功能化納米纖維膜的熒光強度）。

1.3 條件試驗方法

每250 mL體系中糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量為0.05、0.50、5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時間為0、2、4、6、8、10 h，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與吸附細菌共培養(yǎng)時間為0、15、30、60 min，分析得出最優(yōu)試驗條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基功能化磁性納米顆粒的表征

基于銅綠假單胞菌對半乳糖和巖藻糖及其衍生物具有特異性識別的特點［26］，在磁性四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒表面接枝半乳糖和巖藻糖單體，實現(xiàn)對銅綠假單胞菌的特異性識別。圖2a為糖基功能化磁性納米顆粒材料的FTIR光譜。糖基功能化磁性納米顆粒材料的Si—O—Si伸縮振動峰出現(xiàn)在1 098 cm-1處，表明裸露的Fe3O4表面成功包裹了二氧化硅；糖基功能化磁性納米顆粒材料的N—C=O伸縮振動峰出現(xiàn)在1 655 cm-1處；糖單體的—COOR伸縮振動峰出現(xiàn)在1 727 cm-1處，表明半乳糖和巖藻糖單體成功接枝到糖基功能化磁性納米顆粒材料上。圖2b為糖基功能化磁性納米顆粒材料質(zhì)量損失隨溫度變化的曲線。在溫度低于100 ℃時質(zhì)量損失主要歸結(jié)于物理吸附水的蒸發(fā)，在溫度250 ℃～450 ℃時質(zhì)量損失主要歸結(jié)于二氧化硅和有機物的分解，在溫度大于450 ℃時質(zhì)量損失主要歸結(jié)于硅與氮氣在高溫下發(fā)生反應(yīng)，生成氮化硅和Si3N4。圖2c顯示了在27 ℃下糖基功能化磁性納米顆粒材料磁化強度的磁場依賴性，在27 ℃下沒有觀察到滯后行為，這表明該糖基功能化磁性納米顆粒材料的超順磁性，對捕獲細菌后進行磁分離提供了可能性。糖基功能化磁性納米顆粒材料均為球形（圖2d），直徑約為245 nm，具有高比表面積的優(yōu)點。

2.2 負載GNP@FITC功能化納米纖維膜的測試表征

以高比表面積的納米纖維膜為基材［27］，將GNP@FITC吸附到納米纖維膜上，得到負載GNP@FITC功能化納米纖維膜。由于銅綠假單胞菌能分泌明膠酶［28］，因此能分解納米纖維膜表面的明膠粒子，釋放FITC，膜表面熒光強度減弱，實現(xiàn)對銅綠假單胞菌的檢測。如圖3所示，GNP@FITC的粒徑大約為526 nm，分散性系數(shù)PDI為0.067，說明GNP@FITC具有良好的穩(wěn)定性；GNP@FITC在溶液中電位約為-16.5 mV，具有較高的電負性，使得明膠納米粒子在溶液中更加穩(wěn)定。如圖4所示，納米纖維膜上負載的GNP@FITC均勻平整，明膠粒子緊密堆積，增加了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。如圖5所示，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與空白納米纖維膜相比，納米纖維膜負載GNP@FITC后，在2 917 cm-1處C—H的不對稱伸縮振動峰減弱，同時出現(xiàn)了2組新的吸收峰，分別為1 631 cm-1處酰胺I帶的C=O伸縮振動和1 534 cm-1處酰胺II帶的C=O伸縮振動，表明GNP@FITC成功負載到納米纖維膜表面。如圖6所示，負載GNP@FITC后的納米纖維膜表面熒光顯著提高。如圖7所示，空白組納米纖維膜的接觸角為47°，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜的接觸角為73°，這表明在納米纖維膜上負載GNP@FITC后，膜表面的疏水性能會得到提高。

2.3 糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量的確定

使用不同添加量的糖基功能化磁性納米顆粒材料對銅綠假單胞菌進行捕獲。糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量分別為0.05、0.50、5.00 mg時（圖8），捕獲銅綠假單胞菌的效率分別為5.1%、31.4%、81.7%（圖9）。隨著糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量的增大，捕獲銅綠假單胞菌的效率也逐漸升高，添加量為5.00 mg時，捕獲效率最高，因此選擇添加5.00 mg糖基功能化磁性納米顆粒材料用以捕獲銅綠假單胞菌。

2.4 糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時間的確定

由圖10可知，隨著糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時間的增加，銅綠假單胞菌分泌明膠酶的量也增加，糖基功能化磁性納米顆粒材料上明膠納米粒子分解量增加，膜表面的熒光逐漸減弱。當共培養(yǎng)時間為0～6 h時，銅綠假單胞菌生長速度較快，分泌的明膠酶較多，因此糖基功能化磁性納米顆粒材料表面熒光強度下降的速度較快；當共培養(yǎng)時間為6～10 h時，銅綠假單胞菌生長速度減弱，分泌的明膠酶減少，膜表面熒光強度下降速率減弱。糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時間為6 h。

2.5 負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時間的確定

由圖11可知，隨著負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時間的增加，膜表面GNP@FITC被分解的越多，膜表面熒光強度越弱。當共培養(yǎng)時間為0～30 min時，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強度下降較快；當共培養(yǎng)30 min時，熒光強度比值降至0.70以下，30 min后膜表面的熒光強度下降速率減弱，可能是由于菌液中明膠酶對明膠的分解作用進入滯遲期造成的。因此GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時間為30 min。

2.6 方法特異性

銅綠假單胞菌是造成飲用水污染的主要細菌［29］，GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》對包裝飲用水中銅綠假單胞菌和大腸桿菌" " "2種微生物做了限量要求，本研究基于實際情況對大腸桿菌、糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌3種微生物進行特異性試驗。由圖12可知，除大腸桿菌外，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜與不同細菌共培養(yǎng)后，其熒光強度比值均有所下降。與糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)后，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強度比值均超過0.70。與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強度明顯降低。除銅綠假單胞菌外，其他微生物對功能化納米纖維膜上的GNP@FITC作用不明顯，因此該法能夠?qū)崿F(xiàn)對銅綠假單胞菌的特異性檢測。

2.7 銅綠假單胞菌的檢出限

GB 19298—2014《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》規(guī)定包裝飲用水中不得檢出銅綠假單胞菌，對應(yīng)的檢驗方法為GB 8538—2022《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》，當銅綠假單胞菌濃度小于0.004 CFU/mL時，即無法讀取，視為未檢出。將5.00 mg糖基功能化磁性納米顆粒材料加入250 mL不同銅綠假單胞菌濃度的飲用水中，并進行共培養(yǎng)和檢測。由圖13可知，當菌液濃度為10.000 CFU/mL時，熒光強度比值下降至0.37。菌液濃度較低時，分泌的明膠酶較少，負載GNP@FITC功能化納米纖維膜熒光強度較高。當菌液濃度為0.004 CFU/mL時，熒光強度比值為0.63，小于0.70，說明當包裝飲用水中銅綠假單胞菌濃度為0.004 CFU/mL時，也能被檢出，得到陽性結(jié)果。

3 小結(jié)

本研究基于具有特異性識別銅綠假單胞菌功能的磁性納米顆粒材料和銅綠假單胞菌所分泌明膠酶的雙靶向選擇，誘導(dǎo)負載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC的釋放，通過功能化納米纖維膜熒光強度前后的變化來判定包裝飲用水中是否含有銅綠假單胞菌，建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測方法。該法采用糖基功能化磁性納米顆粒材料富集銅綠假單胞菌，250 mL飲用水中糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量為5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時間為6 h，負載GNP@FITC的功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌最佳共培養(yǎng)時間為30 min，方法整體檢驗時間小于8 h，方法檢出限為0.004 CFU/mL，特異性強。相較于GB 8538—2022《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》的檢測方法，該方法縮短了檢測時間，且檢出限能夠滿足監(jiān)管需要，可作為傳統(tǒng)檢測方法的有益補充。

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收稿日期：2023-10-13

作者簡介：黃 徽（1989-），男，湖北鐘祥人，工程師，碩士，主要從事食品安全檢測研究，（電話）15871439229（電子信箱）781312833@qq.com；

通信作者，王福燕（1975-），女，湖北江陵人，講師，博士，主要從事公共衛(wèi)生與安全研究，（電話）18971283408（電子信箱）1447004395@qq.com。