白花蛇舌草內(nèi)生真菌拮抗柑橘炭疽病病原菌的菌株篩選及其生物學(xué)特性

摘要：采用組織塊分離法對白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）內(nèi)生真菌進行分離，用平板對峙法篩選出對柑橘炭疽病病原菌有拮抗活性的菌株，最后對篩選出的拮抗菌株進行鑒定及分子生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，從白花蛇舌草分離出的內(nèi)生真菌中根部最多，葉部次之，莖部最少。從白花蛇舌草中分離出的19株內(nèi)生真菌中有5株對柑橘炭疽病病原菌有較明顯的抑制作用，BG10菌株對柑橘炭疽病病原菌拮抗效果最好，利用分子生物技術(shù)（ITS），BG10被鑒定為Curvularia（彎孢屬），推測為Curvularia lunata（新月彎孢菌）。其最佳培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為牛肉膏。

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）； 內(nèi)生真菌； 柑橘炭疽病病原菌； 篩選； 生物學(xué)特性

中圖分類號：S567.21+9；S436.661.1+4" " " " "文獻標識碼：A" " " "文章編號：0439-8114（2025）02-0121-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.019 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： The endophytic fungi of Hedyotis diffusa were isolated by the tissue block isolation method， and the strains with antagonistic activity against the citrus anthracnose pathogen were screened by the plate stand-off method. Finally， the screened antagonistic strains were identified and their molecular biological characteristics were studied. The results showed that the roots had the highest number of endophytic fungi isolated from Hedyotis diffusa， followed by the leaves and the stems had the least. Five of the 19 strains of endophytic fungi isolated from Hedyotis diffusa had a more pronounced inhibitory effect on pathogenic fungi. The BG10 strain was the most effective in antagonising the pathogen. Using molecular biotechnology （ITS），BG10 was identified as Curvularia， presumably Curvularia lunata. Its optimal medium was Gao’s medium， the best carbon source was glucose and the best nitrogen source was beef paste.

植物內(nèi)生菌是指生活史的全部或部分階段存在于植物組織內(nèi)部，且不引起植物組織發(fā)生明顯病害癥狀的微生物［1］。因其長時間與宿主植物共同生存，因此植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相似或相同的化學(xué)成分［2］。其中，內(nèi)生真菌可能由于與宿主長時間共同進化，對宿主產(chǎn)生重要作用。植物與叢枝菌根真菌之間存在某種遺傳上的聯(lián)系［3］，而奧陶紀真菌菌絲和孢子的化石與現(xiàn)代叢枝菌根真菌極為相似，表明植物與其內(nèi)生真菌的共生關(guān)系極大可能幫助了第一批植物在陸地上定居［4］。除此之外，植物內(nèi)生真菌還具有抑制病原菌生長的作用，主要通過與病原菌競爭生存空間、破壞細胞膜完整性以及降解細胞壁這3種方式影響病原菌菌絲的生長，達到抑菌效果［5］。因此，植物內(nèi)生真菌能夠作為預(yù)防藥物治療資源和外在源體基因的載體，可用于農(nóng)業(yè)藥物生物防治生產(chǎn)領(lǐng)域［6］。

柑橘炭疽病是柑橘的常發(fā)病害，由潛伏侵染期較長的弱寄生性真菌引起，侵染柑橘后造成急性枝梢干枯，引起落葉、落花和落果，嚴重影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，極大降低了經(jīng)濟效益［7，8］。目前防控柑橘炭疽病的主體為化學(xué)農(nóng)藥。然而化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用容易增加病原菌的抗藥性，并且殘留在環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥會威脅人類和生態(tài)系統(tǒng)的健康［9］。隨著人們對環(huán)境和健康重視程度的加深，從藥用植物組織中分離具有一定生物防治作用的內(nèi)生菌株并通過微生物發(fā)酵和化學(xué)分離技術(shù)獲得具有生物活性的化學(xué)成分已成為開發(fā)綠色農(nóng)藥的一種研發(fā)途徑［10］。

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草［11］，為民間常用藥。其性寒，味微苦、甘，歸胃經(jīng)、大腸經(jīng)、小腸經(jīng)［12］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，白花蛇舌草具有抗癌、抗炎、抗氧化、抑菌等藥理作用［13，14］。目前，有關(guān)白花蛇舌草抗菌活性的研究主要集中在對醫(yī)學(xué)病原菌的抑制方面，而對植物病原菌的抑制研究較為鮮見。

本研究對白花蛇舌草內(nèi)生真菌進行分離純化，以柑橘炭疽病病原菌作為研究對象，采用平板對峙法進行拮抗柑橘炭疽病病原菌活性菌株的篩選，從中篩選獲得活性最大的菌株BG10，利用分子生物技術(shù)（ITS）鑒定其科屬種，并設(shè)置了不同培養(yǎng)基、碳源、氮源來研究其生物特性，為白花蛇舌草開發(fā)新藥用資源提供理論依據(jù)，同時也為柑橘炭疽病殺菌劑的開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

白花蛇舌草新鮮菌株采摘于廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)校園中，白花蛇舌草經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草。

1.1.2 病原菌株

柑橘炭疽病病原菌菌株由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃榮韶教授贈送。

1.1.3 主要儀器

主要儀器名稱、型號及生產(chǎn)廠家見表1。

1.1.4 主要試劑

主要試劑名稱及廠家見表2。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1）天然培養(yǎng)基。采用PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制備方法：將馬鈴薯去皮，置電子天平稱取250 g，切成小塊，加無菌水1 000 mL，煮至沸騰，轉(zhuǎn)小火保持微沸30 min，用紗布濾過，補足濾液，加入25 g葡萄糖，25 g瓊脂，倒入150 mL錐形瓶中，置于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，取出于75 ℃干燥箱烘干，備用。

2）半合成培養(yǎng)基。采用高氏培養(yǎng)基，制備方法：稱取硝酸鉀0.1 g、磷酸氫二鉀0.05 g、氯化鈉0.05 g、硫酸鎂0.05 g、硫酸亞鐵0.001 g、可溶性淀粉2 g置于燒杯中，加入100 mL無菌水，攪勻后加入其他稱好的備用藥品，攪拌溶解，煮沸，趁熱加入2 g瓊脂，攪拌溶解，用無菌水補足至100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

3）合成培養(yǎng)基。采用察氏培養(yǎng)基，制備方法：加入KH2PO4 0.2 g、KCl 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaNO3 0.6 g、蔗糖0.6 g置于燒杯中，加入200 mL無菌水，攪拌溶解，煮沸，趁熱加入4 g瓊脂，攪拌溶解，用無菌水補足至200 mL，121 ℃滅菌30 min。滅菌結(jié)束后干燥，備用。

1.2.2 白花蛇舌草表面消毒

選取長勢相同且無病蟲害的白花蛇舌草作為試驗材料，將其沖洗干凈并晾干，置于超凈工作臺中切下適量根、莖、葉組織，利用75%乙醇溶液漂洗2 min，次氯酸鈉漂洗2 min，再用無菌水清洗5次，每次1 min，吸取末次沖洗試驗材料的無菌水100 μL，涂抹在PDA培養(yǎng)基中作為無菌對照，檢驗表面消毒是否完全。

1.2.3 內(nèi)生菌的分離純化

采用組織分離法，在無菌條件下，將處理過的白花蛇舌草各組織置于超凈工作臺上，用無菌手術(shù)刀切割成約0.5 cm×1.0 cm的小段，用已滅菌的鑷子將其根、莖、葉組織接入倒有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，密封，標記，置于恒溫恒濕箱中，（28±2） ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每天觀察是否長出新菌絲，并挑取部分菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板中單獨培養(yǎng)，重復(fù)挑取培養(yǎng)直至純化到單個內(nèi)生真菌為止。

1.2.4 抑制活性菌株的篩選

活性菌株的篩選采用平板對峙法測定抑菌活性，在無菌超凈工作臺上用打孔器取出1小塊病原菌菌餅（直徑約0.5 cm），置于PDA培養(yǎng)基平板距培養(yǎng)皿邊緣2 cm處，再用打孔器取1小塊內(nèi)生菌菌餅（直徑約0.5 cm），放在病原菌的正對面，以只接種病原菌培養(yǎng)基作為對照，平行做對峙處理和對照3次，用封口膠封口，后置于恒溫恒濕箱（28±2） ℃條件下培養(yǎng)7 d。每天觀察并記錄抑菌帶的有無及大小，并按下列公式計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%" " " " " " （1）

1.2.5 活性菌株分子鑒定

1）菌株的DNA提取。選取目標菌株內(nèi)生菌，接種于PDA培養(yǎng)基上，接種3～4皿，于26～28 ℃恒溫避光培養(yǎng)14 d，按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒方法提取菌絲中的DNA。

2）目的DNA片段擴增。選取最佳純度和濃度的活性菌株DNA，利用ITS法對活性菌株進行PCR擴增。PCR引物：ITS1.5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4.5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；反應(yīng)體系：Template（基因組 DNA 20～50 ng/μL）" " " "0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各" " " "2.5 mmol/L）1.0 μL，聚合酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，加無菌水至25 μL。反應(yīng)程序：將上述混合液稍加離心，立即置于PCR儀進行擴增；93 ℃預(yù)變性4 min，進入循環(huán)擴增階段：94 ℃變性45 s→55 ℃退火45 s→72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次，最后再72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.6 活性菌株生物學(xué)特性研究

1）最適培養(yǎng)基篩選。選取活性菌株，于無菌超凈工作臺分別接入天然培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、半合成培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）、合成培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）中，用封口膠封口，置于28 ℃恒溫恒濕箱培養(yǎng)7 d，每天用十字交叉法測量菌絲生長情況，連續(xù)測量并拍照7 d記錄數(shù)據(jù)。

2）最適碳源篩選。碳源種類及用量：蔗糖0.6 g、葡萄糖0.6 g、果糖0.6 g、麥芽糖0.6 g、淀粉0.6 g。選取活性菌株，于無菌超凈工作臺將菌株分別接入不同碳源培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)7 d，每天用十字交叉法測量菌絲生長情況，連續(xù)7 d拍照記錄數(shù)據(jù)。

3）最適氮源篩選。氮源種類及用量：NaNO3 0.6 g、NaNO2 0.6 g、甘氨酸0.6 g、蛋白胨0.6 g、牛肉膏0.6 g、硫酸銨0.6 g。選取活性菌株，于無菌超凈工作臺將菌株分別接入不同氮源培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)7 d，每天用十字交叉法測量菌絲生長情況，連續(xù)7 d拍照記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌分離純化的結(jié)果

利用組織塊分離法從白花蛇舌草根、莖、葉中分離純化得到19株植物內(nèi)生菌菌株，其中，根部分離純化出10株內(nèi)生菌菌株，分別是BG1、BG2、BG3、BG4、BG5、BG6、BG8、BG9、BG10、BG11；莖部分離純化出1株內(nèi)生菌菌株，為BJ2；葉部分離純化出8株內(nèi)生菌菌株，分別是BY1、BY2、BY3、BY4、BY5、BY6、BY7、BY8。白花蛇舌草不同部位分離純化得到的內(nèi)生菌菌株數(shù)量表現(xiàn)為根gt;葉gt;莖。部分分離純化結(jié)果如圖1所示。

2.2 活性菌株的篩選

采用平板對峙法，對白花蛇舌草內(nèi)生真菌對柑橘炭疽病病原菌的拮抗活性進行初步篩選，結(jié)果（表3、圖2）表明，在19株植物內(nèi)生菌株中有8株真菌均有一定的潛在抑菌活性，如圖2所示，白花蛇舌草內(nèi)生真菌產(chǎn)生明顯的抑菌帶，并且菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲生長緩慢，說明其對病原菌菌落生長有抑制作用。其中，BG10菌株對柑橘炭疽病病原菌的抑制作用最明顯，確定BG10菌株為本試驗的活性菌株。

2.3 BG10菌株分子鑒定

將測得的BG10菌株基因序列（表4）導(dǎo)入Gen-Bank，經(jīng)比對，該內(nèi)生菌菌株與GenBank中已登錄的新月彎孢菌（Curvularia lunata）序列的同源性在99%以上。因此初步鑒定BG10菌株為Curvularia（彎孢屬），推測為新月彎孢菌。

2.4 活性菌株最適培養(yǎng)基的篩選

白花蛇舌草BG10菌株在不同培養(yǎng)基中的生長情況見表5、圖3。白花蛇舌草BG10菌株生長最適培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基，菌絲呈放射狀生長，顏色棕色，菌絲致密呈絮狀，菌絲長，菌體上方有水滴生成。

2.5 活性菌株最適碳源的篩選

白花蛇舌草BG10菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長情況如表6、圖4所示。白花蛇舌草BG10菌株最適生長碳源培養(yǎng)基為葡萄糖。白花蛇舌草BG10菌株在碳源不同的5種培養(yǎng)基中均可生長。其中，當以葡萄糖為碳源時，菌株生長較快，菌絲最為致密且均勻。因此得出葡萄糖為最適生長的碳源。

2.6 活性菌株最適氮源的篩選

白花蛇舌草BG10菌株在不同氮源培養(yǎng)基中的生長情況如表7、圖5所示。在不同氮源培養(yǎng)基中生長最快的是牛肉膏培養(yǎng)基，其菌絲生長較為致密均勻，其次是NaNO3和NaNO2及甘氨酸、蛋白胨培養(yǎng)基，而在硫酸銨培養(yǎng)基中生長最慢，因此，最適宜BG10菌株生長的氮源培養(yǎng)基為牛肉膏培養(yǎng)基。

3 小結(jié)與討論

本研究以傳統(tǒng)的中藥白花蛇舌草作為研究對象，采用組織塊法從白花蛇舌草的根、莖、葉中分離出植物內(nèi)生真菌，從中分離出19株植物內(nèi)生真菌，其中，根部分離出10株，莖部分離出1株，葉部分離出8株。以柑橘炭疽病病原菌作為研究對象，用平板對峙法篩選拮抗菌，有8株內(nèi)生真菌表現(xiàn)出了一定的抑制作用，具有潛在抑菌活性，其中BG10對柑橘炭疽病病原菌拮抗效果最好，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該菌株被鑒定為Curvularia（彎孢屬），推測為新月彎孢菌。不同培養(yǎng)基類型中，最適培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為牛肉膏。本研究表明，白花蛇舌草內(nèi)生真菌豐富，其中多集中在根部，葉部次之。內(nèi)生真菌中BG10菌株對柑橘炭疽病病原菌表現(xiàn)出較顯著的抑菌活性，除BG10菌株外，BY5、BY7、BY8、BG2、BG5、BG6、BG11菌株也表現(xiàn)出一定的抑制作用。本研究僅對白花蛇舌草植物內(nèi)生真菌進行了初步的研究，證實了白花蛇舌草含有豐富的內(nèi)生真菌，且表現(xiàn)出抑菌活性的菌株較多，并鑒定出白花蛇舌草內(nèi)生真菌中含有彎孢屬真菌。有研究表明塔希提柚內(nèi)生菌中的2株內(nèi)生真菌能夠有效地拮抗病原菌［15］，而從柑橘果實中分離出來的內(nèi)生細菌對柑橘炭疽病病原菌有一定的拮抗作用［16］。綜合以上的研究結(jié)果表明，利用植物內(nèi)生菌防治植物病害具有可行性，且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)中的發(fā)展前景廣闊。內(nèi)生菌為白花蛇舌草藥用價值的開發(fā)提供了新的思路，也可為白花蛇舌草生防菌資源開發(fā)以及病害防治提供理論依據(jù)。

參考文獻：

［1］ POTSHANGBAM M，DEVI S I，SAHOO D，et al. Functional characterization of endophytic fungal community associated with Oryza sativa L. and Zea mays L.［J］.Frontiers in microbiology，2017，8：325.

［2］ QI C X，GAO W X，WANG J P，et al. Terrusnolides A-D， new butenolides with anti-inflammatory activities from an endophytic Aspergillus from Tripterygium wilfordii［J］.Fitoterapia，2018，130：134-139.

［3］ GHERBI H，MARKMANN K，SVISTOONOFF S，et al. SymRK defines a common genetic basis for plant root endosymbioses with arbuscular mycorrhiza fungi， rhizobia， and Frankia bacteria［J］.Proceedings of the national academy of sciences，2008，105（12）：4928-4932.

［4］ REDECKER D，KODNER R，GRAHAM L E. Glomalean fungi from the Ordovician［J］.Science，2000，289（5486）：1920-1921.

［5］ 白娜娜，姜海燕，狄佳麟.植物內(nèi)生真菌生防作用研究進展［J］.林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2024，49（1）：163-166.

［6］ 方珍娟，張曉霞，馬立安.植物內(nèi)生菌研究進展［J］.長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，15（10）：41-45.

［7］ 陳利鋒，徐敬友.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］.第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.270.

［8］ 王賢達，林雄杰，胡菡青，等.4種殺菌劑對3種果樹炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定［J］.東南園藝，2020，8（4）：28-31.

［9］ JEONG S W，KIM H G，PARK S，et al. Variation in flavonoid levels in Citrus benikoji Hort.ex.Tan. infected by Colletotrichum gloeosporioides［J］.Food chemistry，2014，148：284-288.

［10］ 田宇曦，閔 勇，陳 凌，等.柑橘炭疽病分類鑒定和防治研究進展［J］.中南農(nóng)業(yè)科技，2023，44（12）：230-232，237.

［11］ 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準 第一卷 2008年版［M］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008.82-83.

［12］ 項金明.1200種中草藥彩色圖鑒 白金珍藏版［M］.福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2020.135.

［13］ 黃 嵐，陳碧蓮，羅 鐳.白花蛇舌草的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展［J］.中國藥事，2023，37（12）：1451-1460.

［14］ 王桂玲，費洪榮，趙雪梅，等.半枝蓮和白花蛇舌草藥對總黃酮的富集及其抗氧化和抑菌作用［J］.華西藥學(xué)雜志，2021，36（3）：268-275.

［15］ MUNOZ-GUERRERO J，GUERRA-SIERRAB E，ALVAREZ J C. Fungal endophytes of Tahiti lime（Citrus citrus×latifolia） and their potential for control of Colletotrichum acutatum J.H. Simmons causing anthracnoce［J］.Frontiers in bioengineering and biotechnology，2021，9：650351.

［16］ 袁紅旭，陳勇明，何財能，等.拮抗炭疽病的柑橘內(nèi)生細菌的分離與篩選［J］.果樹學(xué)報，2005（5）：510-513.

收稿日期：2024-06-14

基金項目：廣西自然科學(xué)基金項目（2024GXNSFBA010092）；廣西科協(xié)“提質(zhì)增效”項目；廣西科技重大專項（桂科AA23023035）；廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB21196016）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD21238031）；廣西中醫(yī)藥重點學(xué)科壯藥學(xué)項目（GZXK-Z-20-64）；廣西一流學(xué)科中藥學(xué)（民族藥學(xué)）項目（桂教科研［2018］12號）

作者簡介：朱 華（1957-），男，廣西南寧人，教授，博士，主要從事中藥及民族藥的研究與開發(fā)工作，（電話）18977165885（電子信箱）zhuhuagx@163.com；通信作者，陳 龍（1988-），男，陜西銅川人，助理研究員，碩士，主要從事藥用植物資源開發(fā)與品質(zhì)評價研究，（電話）18169648526（電子信箱）390508271@qq.com。