一株引起宜昌華重樓莖腐病的病原鑒定

摘要：為有效控制湖北省宜昌市華重樓［Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.） Hara］莖腐病的發(fā)生，對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行了分離鑒定。采用常規(guī)組織分離法，獲得1株導(dǎo)致華重樓莖部腐爛的白色絲狀真菌菌株，并將其命名為CLY-2。通過顯微形態(tài)觀察，CLY-2的大型分生孢子呈柱狀，具隔膜，大小為（22.0～33.0） μm × （3.1～4.4） μm；小型分生孢子腎形或卵形，單胞，單生或串生，大小為（2.5～8.2） μm × （1.2～3.5） μm。結(jié)合rDNA-ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化分析，最終將CLY-2確定為鐮刀菌屬真菌Fusarium foetens。

關(guān)鍵詞： 華重樓［Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.） Hara］； 莖腐??； 鐮刀菌屬； 病原鑒定； 湖北省宜昌市

中圖分類號(hào)：S435.672" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " 文章編號(hào)：0439-8114（2025）02-0094-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.015 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to effectively control the rot on the stem of Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara in Yichang City， Hubei Province， the pathogen of the disease was isolated and identified. Using conventional tissue isolation methods， a white filamentous fungal strain causing stem rot on Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara was isolated and named CLY-2. Through microscopic observation， the large conidia of CLY-2 strain were columnar with septa， and the size was （22.0～33.0） μm × （3.1～4.4） μm. The small conidia were kidney shaped or oval-shaped， single-celled， solitary or tandem， with a size of （2.5～8.2） μm × （1.2～3.5） μm. Based on the rDNA-ITS sequence phylogenetic analysis， CLY-2 strain was ultimately identified as Fusarium foetens， a fungus belonging to the genus Fusarium.

華重樓［Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara］又名七葉一枝花，為百合科重樓屬植物。該物種主要分布于長江流域以南地區(qū)山坡谷地的林下或溝邊，其根狀莖具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效［1］，是土家族、苗族治療毒蟲咬傷必備的配方藥。近年來，隨著國內(nèi)外醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)華重樓需求量的日益增加，不少地區(qū)開始嘗試人工馴化栽培，其栽培面積呈逐年擴(kuò)大趨勢(shì)。

宜昌市位于中國湖北省西南地區(qū)，地理上處于中國地形地貌的第二階梯和第三階梯的交匯地帶。此處山巒起伏，海拔相差懸殊，氣候復(fù)雜多樣，素有“華中藥庫”的美譽(yù)［2］，是華重樓天然分布區(qū)。自然條件下，華重樓的病害一般發(fā)生較輕。隨著人工栽培面積的擴(kuò)大、生長環(huán)境的改變，導(dǎo)致華重樓病害逐年加重。已報(bào)道華重樓的病害主要包括莖腐?。?，4］、根腐?。?］、灰霉?。?］、軟腐?。?，8］、葉枯病、褐斑病、黑斑?。?］、斑枯?。?0］等。其中，莖腐爛病為華重樓的一種毀滅性病害，該病害多從莖基部開始，產(chǎn)生黃褐色病斑，而后隨著病斑擴(kuò)大，莖葉逐漸失水下垂，導(dǎo)致植株濕腐倒苗，最終整株快速死亡。由于早春種植時(shí)苗床溫度較低，種植密度較高，透光透氣較差，相對(duì)濕度過高，有利于該病原菌的侵染，導(dǎo)致病害大面積發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)10%～30%［11］。

病原菌的準(zhǔn)確鑒定是有效防控病害的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，引起宜昌市華重樓莖腐病的病原還不清楚。為此，于2021—2022年連續(xù)2年對(duì)宜昌市人工栽培的華重樓莖腐病的病株進(jìn)行調(diào)查和收集，通過病原菌的分離、回接驗(yàn)證確定病原菌，并根據(jù)病原菌顯微形態(tài)特征，同時(shí)結(jié)合ITS基因測(cè)序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該病原菌的種屬特征，為該病害的高效精準(zhǔn)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與分離

2022年5月上旬從宜昌市五峰縣長樂坪鎮(zhèn)中藥材種植示范區(qū)基地采集華重樓病害標(biāo)本，拍照后分別裝入無菌采樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室，采用常規(guī)組織分離法對(duì)葉片發(fā)病部位進(jìn)行病原菌分離，將分離到的病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上進(jìn)行純化培養(yǎng)，最后采用分生孢子稀釋法進(jìn)行單孢純化，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測(cè)定

根據(jù)科赫氏法則，采用離體莖葉接種法，分別選取健康的華重樓葉片，用75%乙醇溶液表面消毒2 min后，用無菌水清洗數(shù)次，用消毒濾紙吸去表面水分，置于鋪有消毒濾紙的塑料盤內(nèi)，并用無菌針頭刺傷表面；取PDA平板邊緣生長旺盛的菌絲，用滅菌的移液槍槍頭制成直徑為7 mm的菌餅，將其接種到健康的華重樓葉片上，覆蓋保鮮膜后置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其間保持塑料盤內(nèi)濕潤，逐日觀察接種后變化情況并詳細(xì)記錄，直至出現(xiàn)典型癥狀。對(duì)典型癥狀葉片進(jìn)行分離，若分離物與接種的病原真菌形態(tài)一致即可確定該病原菌為華重樓病原菌。以接種無菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.3 病原形態(tài)學(xué)鑒定

致病性測(cè)定后，采用濾紙菌絲培養(yǎng)法誘導(dǎo)產(chǎn)孢［12］，在顯微鏡下觀察菌體特征。將分離純化后的菌餅涂抹在濾紙上，保濕培養(yǎng)3 d后，在顯微鏡（SMZ-161型，麥克奧迪）下觀察其產(chǎn)孢表現(xiàn)及菌絲形態(tài)特征。參照Leslie等［13］的分類系統(tǒng)進(jìn)行病原菌菌株形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 rDNA-ITS序列分析

在鋪有滅菌生物玻璃紙的PDA平板上對(duì)純化后的菌株培養(yǎng)3 d，待菌絲生長后收集菌絲，按試劑盒說明提取基因組。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］。

PCR擴(kuò)增體系：總體積為20.0 μL，反應(yīng)液為2.0 μL Polymerase Buffer，2.0 μL DNA模板，2.0 μL dNTP（2×10-4 mol/L），0.5 μL引物ITS1，0.5 μL引物ITS4，1.0 μL Taq酶，12.0 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，擴(kuò)增30次循環(huán)（94 ℃變性" 30 s，55 ℃退火30 s和72 ℃延伸60 s），72 ℃充分延伸5 min，25 ℃冷卻至室溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后將PCR產(chǎn)物委托華大基因科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序，將測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫ITS區(qū)的相似序列進(jìn)行同源性比對(duì)。利用Mega 7.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系，確定菌株種屬特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

病害主要在人工栽培的華重樓田間發(fā)生，每年4月開始發(fā)病，主要為害莖、葉和果實(shí)等部位。感病初期植物葉片呈輕微卷曲或萎蔫，后出現(xiàn)灰色粉狀物，遇露水或下雨病斑呈水浸狀，有氣生菌絲長出，若發(fā)病部位在莖桿或果柄，在重力作用下彎曲或不彎曲，逐漸失水干枯（圖1）。該病主要為害地上部分，不浸染地下根莖。

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

對(duì)采集到的病葉標(biāo)樣進(jìn)行組織分離和單孢培養(yǎng)，獲得純化單孢菌株1株，并命名為CLY-2。菌落在PDA培養(yǎng)基上生長較快，經(jīng)過5 d培養(yǎng)，菌落直徑可達(dá)6.2～7.5 cm。菌落前期白色，隨著生長中部逐漸呈淡紫紅色。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基觀察，邊緣菌絲白色毛氈狀，中間菌絲黃褐色（圖2）。

顯微鏡觀察結(jié)果（圖3）表明，CLY-2菌的大型分生孢子柱狀，具隔膜，大小為（22.0～33.0） μm×（3.1～4.4） μm；小型分生孢子腎形或卵形，單胞，單生或串生，大小為（2.5～8.2） μm×（1.2～3.5） μm。鏡檢結(jié)果表明，分離到的病原菌為鐮刀菌屬（Fusarium）真菌。

2.3 病原菌的致病性測(cè)定

將培養(yǎng)3 d的CLY-2菌塊接種至健康華重樓葉片，接種部位組織逐漸軟化、變色、有液體產(chǎn)生并逐漸擴(kuò)大，腐爛較為迅速，葉片組織生成棕褐色或黑色片狀斑塊，同時(shí)伴有白色霉層，有特殊的氣味產(chǎn)生，而對(duì)照不發(fā)病（圖4）?？蓪LY-2確定為引起華重樓莖腐的致病菌。

2.4 CLY-2的分子鑒定

提取CLY-2菌絲的DNA，對(duì)其rDNA-ITS序列基因序列區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后獲得序列片段長度為551 bp，經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，結(jié)果如下：

CLYCTTCCGT AGGTGAACCT GCGGAGGGAT CATTCCTTTC GCGACACACT CCCAACCCCT

GTGAACATAC CACTTGTTGC CTCGGCGGAT CAGCCCGCTC CCGGTAAAAC GGGACGGCCC

GCCAGAGGAC CCCTAAACTC TGTTTCTATA TGTAACTTCT GAGTAAAACC ATAAATAAAT

CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCAAAATGCG

ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC

CGCCAGTATT CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTT CAACCCTCAA GCACAGCTTG

GTGTTGGGAC TCGCGTTAAT TCGCGTTCCT CAAATTGATT GGCGGTCACG TCGAGCTTCC

ATAGCGTAGT AGTAAAACCC TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCCACGCCG TTAAACCCCA

ACTTCTGAAT GTTGACCTCG GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA

AGCGGAGGAA A

將rDNA-ITS序列提交至NCBI的GenBank，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。通過與GenBank中的同源序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，分離菌株CLY-2的rDNA-ITS序列與GenBank中Fusarium foetens（GeenBank登錄號(hào)NR159865.1）rDNA-ITS序列的同源性最高，相似度達(dá)99.8%?；贑LY-2及其他鐮刀菌屬真菌的rDNA-ITS序列，利用MEGA 7軟件，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示CLY-2與Fusarium foetens聚為一支（圖5）。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析結(jié)果，確定導(dǎo)致華重樓莖腐的CLY-2病原菌為鐮刀菌屬真菌Fusarium foetens。

3 討論

有關(guān)重樓莖腐病研究的報(bào)道主要集中在其病原的鑒定方面。楊麗英等［15］發(fā)現(xiàn)滇重樓的莖腐病病原為疫霉菌（Phytophthora），而裴衛(wèi)華等［16］的研究表明腐霉菌（Pythium sylvaticum）也是引發(fā)重樓莖腐病的病原菌之一。Zhou等［3］通過rDNA-ITS序列證明福建省北部地區(qū)的重樓莖腐病病原為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。此外，Xiao等［4］從福建省的重樓莖腐病病株中分離出另外一種致病菌株，通過α-延伸因子（α-TEF）基因?qū)⒃摬≡b定為輪紋鐮孢菌（Fusarium concentricum）。本研究從湖北省宜昌市五峰縣中藥材種植示范區(qū)華重樓病株標(biāo)本中分離出1株病原真菌CLY-2，通過形態(tài)特征觀察和rDNA-ITS分析，將其確定為鐮刀屬真菌Fusarium foetens。這是國內(nèi)外關(guān)于鐮刀菌屬真菌Fusarium foetens侵染華重樓并引起病害的首次報(bào)道，再次證明鐮刀菌致病范圍廣，致病能力強(qiáng)。關(guān)于重樓莖腐病的病原，不同地區(qū)還存在一定的爭(zhēng)議，新致病菌的發(fā)現(xiàn)可能是由于檢測(cè)技術(shù)的不同而造成，或者是與其他植物莖腐病病原存在交叉感染所致。

鐮刀菌是一種世界廣泛分布的土壤習(xí)居菌。它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可以從土壤為媒介傳播和侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等［17］。鐮刀菌侵入后，破壞植物的維管束系統(tǒng)使其輸導(dǎo)組織癱瘓，并代謝產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的毒素，造成整個(gè)植株萎蔫和死亡。Fusarium foetens是鐮刀菌屬的一種致病菌，華重樓感染該病原菌后，其病株在田間可散發(fā)出一股腥味，并逐漸呈現(xiàn)莖葉萎蔫而相繼死亡。近年來，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人工培育華重樓面積不斷增加，種植密度大、通風(fēng)條件差、陰雨天氣增多使得華重樓的莖腐病害問題日益凸顯。

關(guān)于重樓莖腐病的防治，前人已開展一些探索。陳蔚林等［18］通過室內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙環(huán)唑和多福對(duì)尖孢鐮刀菌致病菌的抑制效果最佳，其EC50分別為4.98 mg/L和10.68 mg/L。蘇海蘭等［5］的研究表明，采用50%多菌靈1 000倍稀釋液浸泡種苗后進(jìn)行移栽，對(duì)華重樓莖腐病可產(chǎn)生100%的防治效果。在生物防治方面，施蕊等［19］從滇重樓塊莖中分離出8株具有一定抑制活性的內(nèi)生真菌，其中PPC-43和PPC-78的發(fā)酵液粗提物對(duì)重樓尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為62.55%和83.11%。此外，廖承樹等［20］從華重樓根系土壤中分離出2株具有較強(qiáng)抑菌能力的生防菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）T2-1和哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）HG，兩者的復(fù)配菌液對(duì)灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌的抑制率分別為78.8%、78.2%，對(duì)華重樓莖腐病的田間相對(duì)防效可達(dá)45%以上。

盡管重樓病原菌種類多樣，傳播途徑復(fù)雜，建議可采取以下措施對(duì)華重樓莖腐病進(jìn)行預(yù)防：①加強(qiáng)栽培管理，減少帶毒源；②及時(shí)清除田間雜草，防止染菌擴(kuò)散；③輪作換茬，避免重茬；④藥劑防治；⑤選用拮抗菌劑進(jìn)行生物防治。

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收稿日期：2024-05-09

基金項(xiàng)目：宜昌市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（A21-4-016）

作者簡介：徐蘭婷（2000-），女，湖北宜昌人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閳@林園藝的植物保護(hù)，（電話）15972721759（電子信箱）1847869781@qq.com；通信作者，王鵬程（1968-），男，湖北谷城人，副教授，碩士，主要從事園林園藝的教學(xué)與研究工作，（電子信箱）wpc06227@126.com。