咖啡葉中多酚的提取及抗氧化活性

摘要：為促進(jìn)咖啡副產(chǎn)物的綜合應(yīng)用，提升咖啡產(chǎn)業(yè)的附加值，文章以咖啡葉為研究對(duì)象，優(yōu)化了咖啡葉多酚的提取工藝，并評(píng)估了其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，咖啡葉中多酚超聲提取最佳工藝條件為超聲時(shí)間59.9 min、超聲溫度66.7 ℃、液料比（乙醇∶咖啡葉）24.9∶1和乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，該條件下咖啡葉多酚得率為39.26 mg/g。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡葉多酚在低濃度（1～3 μg/mL）時(shí)，ABTS自由基清除能力高于抗壞血酸；當(dāng)濃度為3 μg/mL時(shí)，ABTS自由基清除能力達(dá)到89.57%。當(dāng)咖啡葉多酚濃度為0.5 mg/mL時(shí)，F(xiàn)RAP鐵還原能力相當(dāng)于2.48 μmol Fe²⁺，與抗壞血酸接近。當(dāng)咖啡葉多酚濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為77.79%，略低于抗壞血酸?？Х热~多酚具有良好的抗氧化活性，可作為良好抗氧化劑的來(lái)源。咖啡葉作為咖啡副產(chǎn)物之一，其富含的天然活性成分多酚具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：咖啡葉；多酚；提?。豁憫?yīng)面；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-9973（2025）03-0054-06

Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Coffee Leaves

SHEN Xiao-jing¹， LEI Qiu-lin¹， YUAN Biao¹， GUO Yi¹， LI Ying¹，

ZENG Yi-sheng¹， PENG Bin-tao¹， JIANG Wei-wei^1，2*

（1.College of Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2.Yunnan Characteristic Plant Extraction Laboratory， Kunming 650106， China）

Abstract： To promote the comprehensive application of coffee by-products and improve the added value of the coffee industry， in this paper， with coffee leaves as the research object， the extraction process of coffee leaf polyphenols is optimized and in vitro antioxidant activity is evaluated. The results show that the optimum" ultrasonic extraction process conditions of polyphenols from coffee leaves are ultrasonic time of 59.9 min， ultrasonic temperature of 66.7 ℃， the liquid-solid ratio （ethanol∶coffee leaves） of 24.9∶1 and ethanol volume fraction of 60%. Under these conditions， the yield of polyphenols is 39.26 mg/g. The result of in vitro antioxidant experiment shows that when the concentration of coffee leaf polyphenols is 1～3 μg/mL， the ABTS radical scavenging ability is higher than that of ascorbic acid. When the concentration is 3 μg/mL， the ABTS radical scavenging ability reaches 89.57%. When the concentration" of coffee leaf polyphenols reaches 0.5 mg/mL， the iron reducing powder of FRAP is equivalent to 2.48 μmol Fe²⁺， which is close to that of ascorbic acid. When the concentration of coffee leaf polyphenols is 0.5 mg/mL， the DPPH free radical scavenging rate is 77.79%， which is slightly lower than that of ascorbic acid. Polyphenols of coffee leaves have good antioxidant activity and can be used as the origin of good antioxidants. As one of the by-products of coffee， coffee leaves are rich in natural active components such as polyphenols， which have further research and development value.

Key words： coffee leaves; polyphenols; extraction; response surface; antioxidant activity

收稿日期：2024-09-18

基金項(xiàng)目：云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)面上項(xiàng)目（202101BD070001-046）；云南特色植物提取實(shí)驗(yàn)室自主研究項(xiàng)目（2022YKZY001）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目科技人才與平臺(tái)計(jì)劃項(xiàng)目（202405AC350064）

作者簡(jiǎn)介：沈曉靜（1988—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向：食品化學(xué)。

*通信作者：姜薇薇（1982—），女，副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

咖啡是世界三大飲品之一，富含咖啡因、葫蘆巴堿、綠原酸、5-O-咖啡?？鼘幩帷⒖Х榷勾?、16-O-甲基咖啡醇等天然活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖等重要的健康功能^[1-4]。在咖啡種植、加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物中含有豐富的天然活性成分，可作為天然活性成分的來(lái)源在食品、保健品領(lǐng)域被利用，如咖啡花多糖具有抗氧化作用^[5]，可制成咖啡花茶^[6]；咖啡果皮中的果膠不僅具有抗氧化、抗糖基化作用^[7]，而且具有持水性、持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性^[8-10]，可用于制作面包、蛋糕、果醬、果汁^[6]；咖啡果殼中含有矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-云香糖苷，具有抗氧化、誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞的作用^[11-12]，可用于制作果皮茶、果皮酒；咖啡葉具有抗乙酰膽堿酶活性^[13]。此外，咖啡渣可作為生物炭原料，用于吸附和降解污染物^[14-15]?？Х雀碑a(chǎn)物具備進(jìn)一步充分利用的潛在價(jià)值。

咖啡葉作為咖啡的主要副產(chǎn)物之一，具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、改善脂質(zhì)代謝等作用^[16-19]?？Х热~可藥用 ^[16]，用于治療腹瀉和腸痛、緩解偏頭痛、咳嗽、退燒等^[16]。另外，通過(guò)加工與調(diào)配可制備出感官品質(zhì)良好的咖啡葉茶^[20]。我國(guó)對(duì)咖啡葉的研究主要有咖啡葉蛋白質(zhì)^[21]、芒果苷^[22]的提取、咖啡葉茶的制備^[23]及材料的制備^[24]。

本研究以采集自云南普洱的小?？Х热~為研究對(duì)象，優(yōu)化咖啡葉中多酚提取工藝，并評(píng)估其體外抗氧化活性，旨在為咖啡副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)，以提高咖啡產(chǎn)業(yè)的附加值，并為咖啡葉中多酚類化合物的利用提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

咖啡葉：采集于云南省普洱市。

1.2試劑

無(wú)水乙醇：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；DPPH、ABTS、TPTZ（均為分析純）：上海瑞永生物科技有限公司；福林酚試劑（1 mol/L）：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；沒(méi)食子酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3主要儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì)上海箐華科技有限公司；KQ-250DB型超聲清洗儀鞏義市予華儀器有限公司。

1.4方法

1.4.1咖啡葉多酚的提取

咖啡葉2.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇30 mL，在60 ℃下超聲提取30 min，冷卻至室溫后測(cè)定多酚得率。

1.4.2多酚得率計(jì)算

參考文獻(xiàn)[25]中的方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=8.296 4C+0.014 8（R²=0.997 1，A為吸光度，C為沒(méi)食子酸溶液濃度），多酚含量按式（1）計(jì)算：

Y=n×c×vm。（1）

式中：Y為咖啡葉多酚得率，mg/g；m為咖啡葉質(zhì)量，g；c為測(cè)定液多酚濃度，mg/mL；v為咖啡葉提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.4.3咖啡葉多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)置超聲溫度（40，50，60，70，80 ℃）、超聲時(shí)間（30，45，60，75，90 min）、液料比（乙醇∶咖啡葉，10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）5個(gè)因素進(jìn)行超聲提取咖啡葉多酚單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，考察其中一個(gè)因素時(shí)，其余因素設(shè)置為超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min、液料比（乙醇∶咖啡葉）15∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

1.4.4咖啡葉多酚提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

以咖啡葉多酚得率為指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken按表1設(shè)計(jì)液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行咖啡葉多酚提取工藝優(yōu)化。

1.4.5咖啡葉多酚體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.4.5.1DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[26]中的方法進(jìn)行咖啡葉多酚DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算：

I=A1-A2A1×100%。（2）

式中：I為咖啡葉多酚的DPPH自由基清除率，%；A1為不含咖啡葉多酚溶液的吸光度；A2為含咖啡葉多酚溶液的吸光度。

1.4.5.2ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[27]中的方法進(jìn)行咖啡葉多酚ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)，ABTS自由基清除率按式（3）計(jì)算：

I=A3-A4A3×100%。（3）

式中：I為咖啡葉多酚的ABTS自由基清除率，%；A3為不含咖啡葉多酚溶液的吸光度；A4為含咖啡葉多酚溶液的吸光度。

1.4.5.3FRAP法

咖啡葉多酚FRAP法實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[27]中的方法進(jìn)行。

1.5數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析；采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與討論

2.1咖啡葉多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)

咖啡葉多酚超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。多酚屬多羥基類化合物，一方面，易與蛋白質(zhì)、多糖等結(jié)合，形成以氫鍵和疏水鍵結(jié)合的復(fù)合物；另一方面，多酚不穩(wěn)定，易被氧化。因此，在超聲提取過(guò)程中，超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素都會(huì)對(duì)多酚的提取產(chǎn)生重要的影響^[28]。

由圖1可知，當(dāng)超聲溫度小于70 ℃時(shí)，咖啡葉多酚得率隨著超聲溫度的升高不斷增大，這是因?yàn)樘崛囟容^低時(shí)，多酚的溶解度較低，且與蛋白質(zhì)、多糖等大分子成分結(jié)合，因此多酚得率較低；隨著超聲溫度的升高，溶劑分子和咖啡葉中有效成分的分子動(dòng)能增大，有利于溶劑與多酚類物質(zhì)的接觸與傳質(zhì)，增大溶解度，最終使多酚得率增加。但是由于多酚在高溫時(shí)不穩(wěn)定，溫度過(guò)高會(huì)破壞多酚中的酚羥基結(jié)構(gòu)，從而降低多酚得率^[28-29]。因此，咖啡葉多酚得率在超聲溫度70 ℃時(shí)達(dá)到最大，隨后開始降低。

超聲時(shí)間從30 min逐漸增加到90 min的過(guò)程中，咖啡葉多酚得率隨著超聲時(shí)間的增加而增大，在60 min時(shí)，咖啡葉多酚得率達(dá)到最大，隨后開始降低。超聲時(shí)間較短時(shí)，多酚不易與蛋白質(zhì)、多糖等成分分離；但過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間又會(huì)導(dǎo)致多酚的氧化^[28-29]。

在液料比增加的過(guò)程中，咖啡葉多酚得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。隨著溶劑用量的增加，多酚不斷浸出，得率升高；當(dāng)液料比達(dá)25∶1時(shí)，咖啡葉多酚得率達(dá)到最大。隨著多酚提取接近飽和狀態(tài)，溶劑的增加會(huì)促進(jìn)其他醇溶性雜質(zhì)被提取出來(lái)，多酚得率降低^[28-29]。

咖啡葉多酚得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大，隨后基本保持不變。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，不足以破壞復(fù)合物之間的氫鍵和疏水鍵，多酚提取較難；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，其他脂溶性物質(zhì)更易溶解浸出，也會(huì)影響多酚得率^[28-29]。

2.2咖啡葉多酚提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

以咖啡葉多酚得率為響應(yīng)指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

咖啡葉多酚提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.000 1），說(shuō)明3個(gè)因素間差異顯著，模型是有意義的；失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型誤差小，擬合度良好，模型的選擇是合適的^[30-32]。根據(jù)各因素的P值大小確定3個(gè)優(yōu)化因素對(duì)咖啡葉多酚得率的影響順序?yàn)槌暅囟龋–）＞液料比（A）＞超聲時(shí)間（B）。對(duì)咖啡葉多酚得率進(jìn)行二次回歸分析，得到回歸模型：Y=39.03+0.065A+0.065B－1.38C－0.60AB+0.55AC+0.31BC－2.44A²－2.18B²－2.12C²。

咖啡葉多酚提取工藝中各因素的交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖2。液料比24.88∶1、超聲時(shí)間59.92 min、超聲溫度66.71 ℃為響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果。根據(jù)實(shí)際操作，設(shè)置提取條件為液料比24.9∶1、超聲時(shí)間59.9 min、超聲溫度66.7 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)，咖啡葉多酚平均得率為39.26 mg/g，相對(duì)誤差為0.29%，說(shuō)明該優(yōu)化條件可靠，可作為咖啡葉多酚提取的最佳工藝條件。

2.3咖啡葉多酚抗氧化活性

咖啡葉多酚體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著咖啡葉多酚濃度的增加，其體外抗氧化能力不斷增強(qiáng)。在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，咖啡葉多酚的DPPH自由基清除能力略低于抗壞血酸，當(dāng)咖啡葉多酚濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為77.79%。在低濃度時(shí)，咖啡葉多酚ABTS自由基清除能力高于抗壞血酸，當(dāng)咖啡葉多酚濃度為1～3 μg/mL時(shí)均高于相同濃度的抗壞血酸；當(dāng)咖啡葉多酚濃度達(dá)到3 μg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率達(dá)到最大（89.57%），隨后隨著咖啡葉多酚濃度的增加，ABTS自由基清除率基本不變?？Х热~多酚的FRAP鐵還原能力低于抗壞血酸，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)接近抗壞血酸，達(dá)2.48 μmol Fe²⁺。

多酚是一類廣泛存在于植物中的天然活性成分，具有抗氧化、抗炎、預(yù)防心血管疾病等保健功能^[33]。氧化損傷與自由基和活性氧分子有關(guān)，其與炎癥、衰老、代謝性、毒性損傷、缺血再灌注損傷、致癌、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)^[34]。因此，抗氧化或抗氧化劑對(duì)健康具有重要的保護(hù)作用。多酚因具有較強(qiáng)的抗氧化能力已成為一種天然抗氧化劑，逐漸在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。天然多酚抗氧化活性及其提取技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)^[33]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中有大量的副產(chǎn)物被丟棄，例如果核、樹枝、樹葉、果皮等，而這些副產(chǎn)物中含有豐富的天然活性多酚成分，是天然活性成分資源，如山黃皮樹枝多酚對(duì)·OH的清除能力比抗壞血酸強(qiáng)^[35]，水蜜桃果核多酚能有效清除自由基^[36]，銀葉金合歡枝多酚在濃度為0.30 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除能力與維生素Ｃ相當(dāng)^[37]。因此，農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物是天然活性成分的來(lái)源之一?？Х雀碑a(chǎn)物咖啡葉中的酚酸類化合物在食品和藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用值得深入的研究和關(guān)注，特別是其生物活性潛力?？Х雀碑a(chǎn)物的充分利用不僅可以減少咖啡種植和生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境的影響，提高咖啡的價(jià)值，而且能為更多天然活性成分在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供更廣泛的選擇^[38]。因此，通過(guò)研究開發(fā)這些副產(chǎn)物能有效地促進(jìn)其附加值的提升，也是進(jìn)一步獲取天然活性成分促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑和方法。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以咖啡葉為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化了咖啡葉多酚的超聲提取條件。在超聲時(shí)間59.9 min、超聲溫度66.7 ℃、液料比（乙醇∶咖啡葉）24.9∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，咖啡葉多酚得率為39.26 mg/g?？Х热~多酚具有良好的抗氧化活性，能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基且具有較好的FRAP鐵還原能力，具有進(jìn)一步開發(fā)和利用的潛力。咖啡葉作為咖啡種植過(guò)程中被丟棄的副產(chǎn)物之一，含有豐富的天然活性成分，值得被進(jìn)一步關(guān)注和充分利用。

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