基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法

收稿日期：2024-07-18

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFD1400100、2021YFD1400103）

作者簡介：侯雨萌（2000-），女，天津人，碩士研究生，主要從事玉米矮花葉病毒的研究；（E-mail）2192494895@qq.com。趙振興為共同第一作者。

通訊作者：張永江，（E-mail）zhangyjpvi@yeah.net；周 濤，（E-mail）taozhousig@163.com

摘要： 玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）是一種重要的檢疫性病毒，嚴重影響玉米的生產。為了有效防治玉米矮花葉病，本研究基于反轉錄重組酶介導等溫核酸擴增（RT-RAA）技術和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)構建了一種MDMV快速檢測方法，將所有試劑集中在一個試管中進行反應，并通過側向流動試紙條（LFD）檢測反應結果。本研究篩選得到的最佳反應條件為，引物添加量2.8 μL、FB報告分子濃度100 nmol/L、RT-RAA系統(tǒng)反應時間20 min、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)反應時間20 min。本研究構建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法特異性強、靈敏度高，且所用試驗材料方便攜帶和運輸，適用于現(xiàn)場檢測。

關鍵詞： 玉米矮花葉病毒；反轉錄重組酶介導等溫核酸擴增（RT-RAA）技術；CRISPR/Cas12a；側向流動試紙條

中圖分類號： S513"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2025）02-0268-08

A one-tube rapid detection method for maize dwarf mosaic virus based on RT-RAA and CRISPR/Cas12a

HOU Yumeng^1，2， ZHAO Zhenxing¹， WANG Siyuan¹， DONG Zheng¹， HU Zhongze³， ZHOU Tao²， ZHANG Yongjiang¹

（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China；2.College of Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China；3.Taizhou Institute of Agricultural Sciences， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Taizhou 225300， China）

Abstract： Maize dwarf mosaic virus （MDMV） is an important quarantine virus that seriously affects maize production. To effectively prevent and control maize dwarf mosaic disease， this study constructed a rapid detection method for MDMV based on reverse transcription-recombinase aided amplification （RT-RAA） technology and the CRISPR/Cas12a system. All reagents were reacted in a single test tube， and the reaction results were detected by lateral flow dipstick （LFD）. The optimal reaction conditions screened in this study were as follows： primer addition amount of 2.8 μL， FB reporter molecule concentration of 100 mol/L， RT-RAA system reaction time of 20 minutes， and CRISPR/Cas12a system reaction time of 20 minutes. The one-tube rapid detection method for maize dwarf mosaic virus based on RT-RAA and CRISPR/Cas12a constructed in this study has strong specificity， high sensitivity， and the experimental materials used are convenient for carrying and transportation， making it suitable for on-site detection.

Key words： maize dwarf mosaic virus； reverse transcription-recombinase aided amplification （RT-RAA） technology；CRISPR/Cas12a；lateral flow dipstick

玉米是全球重要糧食作物，種植面積廣泛，被用于食品、醫(yī)療、化工等多個領域。美國是全球最大的玉米生產國，中國位居第2^[1]。近年來，玉米產業(yè)在產量、質量和種植面積等方面均有顯著提升。玉米常年遭受病毒的侵染，嚴重威脅其安全生產。玉米矮花葉病是玉米常見的病害之一，會導致玉米產量和質量下降，引起該病的主要病毒包括甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）、玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV），這兩種病毒引起的癥狀相似，難以區(qū)分^[2]。目前有關檢測MDMV的研究相對較少，因此，建立一種簡捷、高效、快速的MDMV檢測技術尤為重要。

玉米矮花葉病毒屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），是一種重要的檢疫性病毒。MDMV是一種正義單鏈RNA病毒^[3]，僅寄生于禾本科植物，可侵染玉米、甘蔗等十余種農作物及草本植物，其中約翰遜草受害最嚴重^[4-5]，石茅是MDMV田間的長期毒源^[6]。MDMV傳播方式多樣，包括汁液傳播和種子傳播等。MDMV主要通過蚜蟲在田間進行非持久性傳播^[7]。MDMV傳播速度快，侵染玉米后在植株內迅速移動，導致植株在短時間內出現(xiàn)矮化、葉片褪綠和生長受阻等癥狀，最終造成玉米減產20%以上，甚至絕產^[8-10]。MDMV主要分布在在美國、加拿大、匈牙利、西班牙、約旦、捷克和波蘭等國家^[11-15]，中國南方海關曾多次在阿根廷運輸?shù)街袊挠衩字袡z測到MDMV。該病毒最早于美國俄亥俄州被發(fā)現(xiàn)，2021年4月9日被新增列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中^[16]。研究結果表明，MDMV最初被分為A、B兩個主要株系。在中國，玉米矮花葉病的主要致病病毒是MDMV的B株系，通過分子生物學分析發(fā)現(xiàn)，其特性與甘蔗花葉病毒（SCMV）的一個株系相似，因此將其歸為SCMV，并命名為SCMV-MDB^[17]。

目前有關MDMV的檢測方法包括反轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription-poly-merase chain reaction，RT-PCR）、實時熒光定量核酸擴增技術（Quantitative real-time PCR，qPCR）等，這些方法雖能準確檢測到MDMV，但耗時長、操作復雜，需要專業(yè)的技術人員和精密儀器，具有較多局限性。反轉錄重組酶介導等溫核酸擴增技術（Reverse transcription-recombinase aided amplification，RT-RAA）是一種不需要熱穩(wěn)定酶和精密儀器的檢測技術，在36～44 ℃條件下反應20～40 min即可完成目的基因的指數(shù)擴增，具有反應速度快，操作簡單、溫度要求低，靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。這種檢測技術可以滿足現(xiàn)場快速檢測的需求^[18]，已被廣泛應用于多個領域^[19-20]。在植物病毒的檢測領域，RT-RAA已被應用于櫻桃病毒A、菜豆莢斑駁病毒、番茄黃化曲葉病毒等30余種植物病毒的檢測^[21-23]。CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein）是一種基于CRISPR RNA（crRNA）引導的靶向基因識別與切割技術。CRISPR/Cas12a屬于第2類Ⅴ型系統(tǒng)，可在短時間內檢測到低濃度的目的基因，目前已被廣泛應用 ^[24] 。本研究擬基于RT-RAA恒溫擴增技術和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，將MDMV檢測試劑集中在同一個試管中進行反應，并利用側向免疫層析技術快速檢測反應產物，以期為現(xiàn)場簡便、高效、直觀快速檢測玉米矮花葉病毒提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MDMV陽性質粒^[6]、SCMV陽性質粒、水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、玉米褪綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV）、小麥線條花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）由本實驗室保存；感染MDMV的玉米病株由廣州海關和福州海關提供。

1.2 方法

1.2.1 RAA引物、crRNA及報告分子FQ、FB設計 參考RAA引物設計的相關文獻，登錄NCBI網(wǎng)站，獲取已報道的MDMV外殼蛋白（Coat protein， CP）基因序列。

利用多重序列比對工具對這些序列進行比對，分析保守區(qū)域。在保守區(qū)域內，設計2對RAA引物。使用設計工具CRISPR，根據(jù)MDMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)域設計特異性crRNA序列。MDMV-crRNA：5′-UAAUUUCUACUAA￣G￣U￣G￣U￣A￣G￣A￣U￣A￣U￣A￣G￣G￣U￣G￣G￣U￣A￣U￣GAAGCAGUACAG-3′；FQ報告分子：6-羧基熒光素-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-熒光猝滅劑；FB報告分子：6-羧基熒光素-CCG￣G￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣A￣C￣C￣G￣G-生物素。引物具體信息如表1所示。crRNA及FQ、FB報告分子序列由擎科有限公司（北京，中國）合成，引物由諾賽有限公司（北京，中國）合成。

1.2.2 RT-RAA恒溫擴增 按照RT-RAA恒溫擴增試劑盒（型號WLRB8207KIT，安普未來生物科技有限公司產品）的說明書進行RT-RAA等溫擴增，具體操作步驟如下：向每個凍干酶粉管中加入29.4 μL A buffer、2.0 μL正向引物（10 μmol/L）和2.0 μL反向引物（10 μmol/L），12.1 μL ddH2O，上下吸打混勻，使凍干酶粉充分溶解，隨后加入2.0 μL模板（MDMV陽性質粒）、2.5 μL B buffer，總體系共50.0 μL。充分混勻后，將反應管放入恒溫反應器中，42 ℃條件下恒溫反應30 min。擴增完成后，向擴增產物中加入50.0 μL DNA提取液，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行后續(xù)凝膠電泳檢測。

1.2.3 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法 RT-RAA體系包括25.0 μL A buffer、2.4 μL正向引物（10 μmol/L）和2.4 μL反向引物（10 μmol/L）、4.0 μL FQ報告分子（10 μmol/L）、6.0 μL ddH2O，將混合溶液倒入凍干酶粉管中，充分溶解后加入2.5 μL B buffer，上下吸打混合均勻后，從中抽取9.0 μL RT-RAA體系溶液至PCR管底部。CRISPR/Cas12a體系包括7.5 μL 10×NEBuffer 3.1、2.5 μL RNase inhibitor（40 U/μL）、2.5 μL DTT（0.1 mmol/L）、2.5 μL LbCas12a（5 μmol/L）、5.0 μL MDMV-crRNA（10 μmol/L），充分振蕩混勻后，從中抽取4.0 μL CRISPR/Cas12a體系溶液于管蓋內。抽取1 μL待測病毒RNA至管底部，上下移液混合均勻，輕輕閉合PCR管蓋，PCR管置于42 ℃的恒溫反應儀中反應20 min。隨后振蕩并離心，使4 μL CRISPR/Cas12a體系溶液、9 μL RT-RAA體系溶液及1 μL病毒RNA混合均勻。PCR管內混合溶液總體積為14 μL，將PCR管放入實時熒光儀中，在37 ℃條件下反應30 min，并實時監(jiān)測熒光信號。

當使用FB報告分子結合側向流動試紙條檢測病毒RNA時，將4 μL FQ報告分子替換為4 μL FB報告分子，其他反應條件相同，反應結束后，加入86 μL去離子水，混合均勻后將試紙條插入PCR管中，靜置5 min，觀察條帶。

1.2.4 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的特異性分析 按照TIANGENRNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明書，提取玉米上常見病毒RBSDV、CMV、SCMV、MCMV、WSMV的RNA，驗證方法1.2.3的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的特異性。

1.2.5 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的靈敏度分析 使用ddH2O將MDMV陽性質粒梯度稀釋為每1 μL 1×10⁷拷貝、1×10⁶拷貝、1×10⁵拷貝、1×10⁴拷貝、1×10³拷貝、1×10²拷貝、1×101拷貝、1×100拷貝8個梯度，以健康玉米RNA為陰性對照，分別利用方法1.2.3的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法、RT-RAA結合凝膠電泳方法和RT-PCR結合凝膠電泳方法進行檢測，分析不同方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒檢測方法的優(yōu)化

2.1.1 RT-RAA體系引物篩選 以FQ作為熒光信號分子，分別使用2對RT-RAA引物，通過基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法檢測MDMV陽性質粒，同時以健康玉米RNA作為陰性對照。檢測結果顯示如圖1所示，2對RAA引物均能擴增出目的片段，其中引物組合MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R的熒光信號值更穩(wěn)定，因此引物選用MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R。

2.1.2 RT-RAA體系引物添加量篩選 將RT-RAA體系引物MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R（10 μmol/L）添加量分別設置2.0 μL、2.2 μL、2.4 μL、2.6 μL、2.8 μL、3.0 μL，進行篩選。以FQ作為熒光信號分子，通過基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法檢測MDMV陽性質粒，檢測結果如圖2所示，當引物添加量為2.0～3.0 μL，均可檢測到熒光信號。當引物添加量達到2.8 μL時，熒光信號最強，當引物添加量為3.0 μL時，熒光信號減弱，因此確定引物MDMV-RAA-1F/MDMV-RAA-1R（10 μmol/L）最佳添加量為2.8 μL。

2.1.3 報告分子FB濃度篩選 在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，報告分子的濃度對檢測結果的準確性至關重要。報告分子濃度過低可能導致假陽性結果的出現(xiàn)。為了避免假陽性現(xiàn)象，用試紙條分別檢測0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、500 nmol/L和1 000 nmol/L濃度的FB報告分子。如圖3所示，當FB濃度低于100 nmol/L時，檢測線均會出現(xiàn)微弱的假陽性信號。因此選擇100 nmol/L濃度的FB報告分子。

2.1.4 RT-RAA體系反應時間優(yōu)化 分別設置RT-RAA體系反應時間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，以FB作為信號分子，通過基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法檢測MDMV陽性質粒。檢測結果如圖4所示，RT-RAA反應5 min即可在檢測線（T線）上產生條帶，隨著RT-RAA體系反應時間的增加，檢測線上的條帶顏色逐漸加深。當反應時間超過20 min，檢測線上的條帶深度不再隨著時間增加而變化，因此選擇20 min作為RT-RAA體系最佳反應時間。

2.1.5 CRISPR/Cas12a體系反應時間優(yōu)化 分別設置CRISPR/Cas12a體系反應時間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，以FB作為信號分子，通過基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法檢測MDMV陽性質粒。結果如圖5所示，反應10 min，試紙條檢測線上產生條帶，隨著反應時間的增加，檢測線上的條帶顏色逐漸加深。當反應時間超過20 min，檢測線上的條帶深度不再隨著時間增加而變化，因此選擇20 min作為CRISPR/Cas12a體系最佳反應時間。

2.2 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的特異性

為評估基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的特異性，使用試紙條對多種病毒進行了檢測，包括玉米矮花葉病毒（MDMV）、水稻黑條矮縮病毒（RBSDV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、甘蔗花葉病毒（SCMV）、玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）和小麥條紋花葉病毒（WSMV），并以健康玉米RNA作為陰性對照。如圖6所示，只有檢測MDMV的試紙條檢測線（T線）上出現(xiàn)紅色條帶，檢測其他病毒和陰性對照的試紙條只在質量控制線（C線）上出現(xiàn)條帶，未出現(xiàn)非特異性擴增條帶。本研究的RT-RAA/Cas12a一管法在檢測MDMV時表現(xiàn)出高特異性，未與其他常見病毒發(fā)生交叉反應。

2.3 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的靈敏度

為評估不同檢測方法的靈敏度，分別用基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法、RT-PCR結合凝膠電泳方法、RT-RAA結合凝膠電泳方法檢測MDMV陽性質粒。如圖7所示，RT-PCR結合凝膠電泳方法能檢測到的病毒最低含量為每1 μL 1×10⁵拷貝（圖7a），RT-RAA結合凝膠電泳方法能檢測到的病毒最低含量為每1 μL 1×10⁴拷貝，基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法能檢測到的病毒最低含量為每1 μL 1×10²拷貝（圖7c）?？梢?，基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法靈敏度是RT-RAA結合凝膠電泳方法的100倍，是RT-PCR結合凝膠電泳方法的1 000倍。

2.4 基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法實際場景應用

為驗證基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性，對廣州海關和福州海關提供的4份感染玉米矮花葉病毒的玉米植株進行檢測，同時以健康玉米RNA作為陰性對照。如圖8所示，檢測供試4份感染玉米矮花葉病毒玉米植株的試紙條檢測線上均出現(xiàn)明顯條帶，表明本研究的方法穩(wěn)定可靠。

3 討論

玉米是中國重要的作物之一，長期受到作物學研究者的關注^[25]。被MDMV侵染的玉米常出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，MDMV在全球范圍內造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此，加強對進口玉米、高粱等作物的病毒檢疫尤為重要，需要建立快速有效的MDMV檢測方法，以降低病毒傳入和流行的風險。

RT-RAA方法通過DNA聚合酶、重組酶的多種酶的協(xié)同作用完成鏈置換，實現(xiàn)目的基因的快速擴增^[26]。與傳統(tǒng)PCR和熒光定量PCR相比，該方法無需電泳儀和熒光定量PCR儀，僅需恒溫金屬浴即可完成檢測，大幅縮短操作時間，真正實現(xiàn)了現(xiàn)場化檢測^[27]。此外，等溫擴增技術具有反應條件簡便、特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢，能夠在恒溫下完成擴增反應。該技術還可結合實時熒光檢測、藍光可視化及側向層析試紙條等方法，使檢測結果更加直觀。

玉米矮花葉病是玉米上最嚴重的病害之一。據(jù)報道，已有6種病毒可引起玉米矮花葉病，它們均可導致玉米花葉、矮縮等癥狀，相似的發(fā)病癥狀給病原的準確識別帶來挑戰(zhàn)^[28]。MDMV是玉米矮花葉病的主要病原之一。本研究基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a構建一種檢測MDMV的方法，將所有檢測試劑集中于一個試管中進行反應，并對反應條件進行優(yōu)化。試驗結果表明，引物MDMA-RAA-1F/MDMA-RAA-1R穩(wěn)定性強;最佳試驗條件為，引物添加量2.8 μL、FB報告分子濃度100 nmol/L、RT-RAA系統(tǒng)反應時間20 min、CRISPR/Cas12a系統(tǒng)反應時間20 min。本研究構建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花葉病毒快速檢測方法特異性強，靈敏度是RT-RAA結合凝膠電泳方法的100倍，是RT-PCR結合凝膠電泳方法的1 000倍。該方法所用試劑可進行凍干處理，便于儲存和運輸，同時結合側向層析試紙條，使該檢測方法更加適用于田間檢測^[29]和植物病毒病的現(xiàn)場診斷^[30]，具有廣泛應用前景。

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（責任編輯：成紓寒）