水稻絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因OsSHMT5克隆與功能分析

收稿日期：2024-09-09

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（BK20210389）;國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（32202592）

作者簡(jiǎn)介：陳 杰（1992-），男，江蘇丹陽人，博士，助理研究員，主要從事植物礦質(zhì)元素吸收與積累機(jī)制研究。（E-mail）jiechen@jaas.ac.cn

通訊作者：黃新元，（E-mail）xinyuan.huang@njau.edu.cn

摘要： 水稻中已克隆到OsSHMT4（OsCADT1），該基因編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT），可調(diào)控硫酸鹽/硒酸鹽吸收和同化，其高度同源基因OsSHMT5的功能尚不清楚。本研究基于反向遺傳學(xué)研究方法，對(duì)水稻OsSHMT5基因進(jìn)行分子克隆，發(fā)現(xiàn)OsSHMT5與OsSHMT4（OsCADT1）的同源性高達(dá)84%。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，OsSHMT5蛋白定位于細(xì)胞核。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OsSHMT5基因敲除突變體，發(fā)現(xiàn)OsSHMT5基因敲除突變體的地上部或地下部中總硫/總硒及各形態(tài)硒含量與野生型相比無顯著差異。基于轉(zhuǎn)錄組水平分析發(fā)現(xiàn)，OsSHMT5對(duì)水稻硫酸鹽/硒酸鹽吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)無顯著調(diào)控作用。在水稻地下部，OsSHMT5可能具有四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、電子轉(zhuǎn)移活性和鐵離子結(jié)合等分子功能;在地上部，OsSHMT5可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性、肽酶抑制劑活性、銅離子結(jié)合等分子功能。本研究結(jié)果為水稻中OsSHMT家族功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 水稻;絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶;OsSHMT5基因;硫元素;硒元素

中圖分類號(hào)： S511nbsp;" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-4440（2025）02-0209-12

Cloning and functional analysis of serine hydroxymethyltransferase gene OsSHMT5 in rice

CHEN Jie^1，2， YANG Tianyu²， HUANG Xinyuan²

（1.Institute of Vegetable Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China;2.State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement amp; Utilization/College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： In rice， OsSHMT4 （OsCADT1）has been cloned. This gene encodes serine hydroxymethyltransferase （SHMT）， which can regulate the absorption and assimilation of sulfate/selenate. However， the function of its highly homologous gene， OsSHMT5， remains unclear. Based on the reverse genetics research method， the OsSHMT5 gene was cloned in this study. It was found that the homology between OsSHMT5 and OsSHMT4 （OsCADT1） was as high as 84%. The results of subcellular localization indicated that OsSHMT5 was localized in the nucleus. The OsSHMT5 gene knockout mutants were constructed using the CRISPR/Cas9 technology. It was found that there were no significant differences in the total sulfur/total selenium and various forms of selenium content in the root or shoot of the OsSHMT5 gene knockout mutants compared with the wild-type. Based on transcriptome-level analysis， it was found that OsSHMT5 had no significant regulatory effect on the expression of genes related to sulfate/selenate absorption and assimilation in rice. In the root， OsSHMT5 may have molecular functions such as tetrapyrrole binding， heme binding， oxidoreductase activity， electron transfer activity， and iron ion binding. In the shoot， OsSHMT5 may have molecular functions such as transcription regulator activity， molecular function regulator， endopeptidase regulatory activity， peptidase inhibitor activity， and copper ion binding. The results of this study lay a foundation for the research on the functions of the OsSHMT family in rice.

Key words： rice;serine hydroxymethyltransferase;OsSHMT5 gene;sulphur;selenium

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）催化絲氨酸與四氫葉酸的反應(yīng)，生成甘氨酸和5，10-亞甲基四氫葉酸，為生物體內(nèi)的甲基合成、核苷酸合成和氨基酸代謝等提供一碳單位^[1-4]。在擬南芥中，定位于線粒體的AtSHMT1和AtSHMT2均參與光呼吸過程^[5]，但AtSHMT1和AtSHMT2的功能可能存在冗余^[6]。定位于質(zhì)體的AtSHMT3也具有酶活性^[6]。在水稻中，定位于線粒體的OsSHMT1參與光呼吸過程，其功能缺陷導(dǎo)致幼苗新葉失綠變黃且苗期致死^[7-8]。水稻中，泛素化修飾的OsSHMT1可以激活植物免疫信號(hào)，增強(qiáng)水稻對(duì)多種病害（水稻條紋葉枯病、稻瘟病及水稻白葉枯病^[9]）的抗性。水稻OsSHMT3定位于葉綠體^[10]，在大腸桿菌或擬南芥中異源表達(dá)OsSHMT3可提高其鹽耐性^[11]。在擬南芥中，定位于細(xì)胞核的擬南芥AtSHMT7（MSA1）雖然未被鑒定出SHMT酶活性，但其突變可在表觀遺傳層面調(diào)控體內(nèi)硫素穩(wěn)態(tài)，增加葉片中總硫（S）和總硒（Se）的積累量^[12]。在水稻中，OsSHMT4（OsCADT1）也定位于細(xì)胞核，作為負(fù)調(diào)控因子影響硫酸鹽/硒酸鹽吸收和同化途徑^[13]。雖然OsSHMT4（OsCADT1）突變影響籽粒中富含半胱氨酸的貯藏蛋白的合成、影響胚乳發(fā)育和堊白度^[14-15]，但可顯著提高水稻對(duì)鎘的耐性，同時(shí)促進(jìn)籽粒硒的生物富集^[13]。

硒是一種類金屬元素，在自然界中主要以無機(jī)硒和有機(jī)硒的形式存在^[16-17]。硒為人體必需而植物非必需的微量元素之一，對(duì)保障人體健康具有重要作用，人體主要通過植源性食物攝入硒^[18-19]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織報(bào)道，成年人每日硒攝入量為26～34 μg，每日硒攝入最高安全劑量為400 μg^[20]。全球范圍內(nèi)約有15%的人硒攝入不足^[21]，而中國是世界上缺硒最嚴(yán)重的國家之一，72%的國土面積中為缺硒區(qū)域，并且超1.05×108人處于硒攝入不足狀態(tài)^[22]。稻米作為中國60%以上人的主食，是硒膳食攝入的主要來源，其硒含量與人體健康密切相關(guān)^[23]。然而，相比于美國和印度等國家，中國市售普通大米的硒含量普遍較低（0.01～0.10 mg/kg），難以滿足日常硒攝入需求，因此亟需通過農(nóng)藝措施或生物強(qiáng)化技術(shù)提高水稻籽粒中的硒含量^[23-25]。

擬南芥AtSHMT7（MSA1）和水稻OsSHMT4（OsCADT1）同屬于絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶中定位于細(xì)胞核的家族亞類，其功能缺陷均可提高植物地上部硫元素和硒元素的積累量^[12-13]，OsSHMT5為OsSHMT4（OsCADT1）的同源基因。本研究擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建osshmt5純合突變體，對(duì)比OsSHMT5敲除突變體和野生型中各種營(yíng)養(yǎng)元素含量的差異，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析OsSHMT5的調(diào)控機(jī)制，為水稻中OsSHMT家族功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粳稻品種中花11（ZH11）。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢索OsSHMT4（OsCADT1）氨基酸序列。利用Mega11軟件對(duì)OsSHMT1（Os03g0738400）、OsSHMT2（Os11g0455800）、OsSHMT￣3￣（￣O￣s￣1￣2￣g￣0￣4￣0￣9￣0￣0￣0）￣、￣O￣s￣S￣HMT4（OsCADT￣1￣，￣O￣s￣0￣1g0874900）、OsSHMT5￣（￣O￣s￣0￣5￣g￣0￣4￣2￣9￣0￣0￣0￣）、AtSHMT1￣（￣A￣t￣4￣g37930）、AtSHMT2￣（￣A￣t￣5￣g￣2￣6￣7￣80）、AtSHMT3（At4g32520）、AtSHMT4￣（￣A￣t￣4￣g￣1￣3￣9￣3￣0）、AtSHMT5（At4g13890）、AtSHMT6￣（￣A￣t￣1￣g￣2￣2￣0￣2￣0￣）和AtSHMT7（MSA1，At1g36370）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 亞細(xì)胞定位

以中花11的cDNA為模板，正向引物F：5′-￣T￣C￣G￣A￣G￣C￣TCAAGCTTCGAATTCA￣T￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣T￣C￣G￣C￣G￣C￣G￣A￣C￣G￣-3′，反向引物R：5′-GGATCCCGGGCCCGCGGTACCTACATCAAATCCCGGCATGG-3′，擴(kuò)增出OsSHMT5基因的編碼區(qū)片段，通過同源重組將該片段插入至載體pSAT6A-eGFP-N1的Eco RⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)之間。利用PI-PspⅠ內(nèi)切酶酶切得到2xCaMV 35S：：OsSHMT5：eGFP片段，再將該片段利用T4連接酶連接至線性化載體pRCS2-ocs-nptⅡ的PI-PspⅠ酶切位點(diǎn)處。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，在葉片中表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）與OsSHMT5的融合蛋白^[26]，熒光信號(hào)由激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)（型號(hào)TCS-SP8，Leica公司產(chǎn)品）。

1.4 突變體的構(gòu)建

針對(duì)OsSHMT5的編碼區(qū)設(shè)計(jì)2個(gè)敲除靶點(diǎn)（U6A：5′-CTCCTCCTGCCTCTCGCCCG-3′和U6B：5′-G￣T￣C￣G￣C￣G￣CTGGGGCGTCAACG-3′）。首先構(gòu)建靶標(biāo)sgRNA表達(dá)盒，再利用BsaⅠ酶切和T4連接酶將其組裝至pYLCRISPR/Cas9載體中^[27]。構(gòu)建好的載體送至伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和陽性苗篩選。以T0代單株的DNA為模板，使用引物F：5′-ATGCTCGATCGCGCGACG-3′和引物R：5′-ATGTACCCGGTGTGCGGGTT-3′擴(kuò)增目的片段，并通過Sanger測(cè)序鑒定OsSHMT5基因突變類型。最終得到OsSHMT5基因敲除突變體osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3。

1.5 營(yíng)養(yǎng)元素含量的測(cè)定

木村B營(yíng)養(yǎng)液（Kimura B）的濃度稀釋到標(biāo)準(zhǔn)濃度的一半，將水稻野生型（ZH11）和OsSHMT5敲除突變體（osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3）在1/2 Kimura B營(yíng)養(yǎng)液中水培21 d，然后外源添加終濃度2 μmol/L硒酸鈉，處理2 d。處理結(jié)束后，分別采集地下部和地上部，清洗干凈后65 ℃烘干至恒重，采用HNO3法在石墨爐（型號(hào)ED45，Lab Tech公司產(chǎn)品）對(duì)水稻樣品進(jìn)行消解^[28]，并使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（型號(hào)NexION 300X，PerkinElmer公司產(chǎn)品）測(cè)定水稻樣品中S、Se及其他營(yíng)養(yǎng)元素的含量。

1.6 各形態(tài)硒含量測(cè)定

分別取水稻地上部和地上部，保存于-80 ℃。液氮研磨后，取約0.1 g樣品加1 mL超純水（電阻率＞18 MΩ）混勻。室溫下以40 Hz超聲振蕩30 min，隨后15 000 g離心20 min，取上清液過0.45 μm尼龍濾膜。采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào)NexION 300X，PerkinElmer公司產(chǎn)品）測(cè)定各形態(tài)硒含量，其中陰離子交換柱為Hamilton PRP 100、流動(dòng)相為4.5 mmol/L檸檬酸（pH值4.5）。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

將水稻野生型（ZH11）、osshmt5-1突變體和osshmt5-3突變體水培21 d后，分別采集地下部和地上部，水稻總RNA提取、文庫構(gòu)建和基于Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)的高通量測(cè)序分析由上海凌恩生物科技有限公司完成。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|差異倍數(shù)（FC）|≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.05。差異表達(dá)基因GO富集分析篩選標(biāo)準(zhǔn)為P值≤0.05。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics v.25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SHMT家族進(jìn)化樹分析

基于氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，水稻中有5個(gè)OsSHMT，擬南芥中有7個(gè)AtSHMT。利用MEGA10軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，其可分成3個(gè)亞家族，水稻中OsSHMT4（OsCADT1）與OsSHMT5的同源性最高，約84%，擬南芥中AtSHMT7（MSA1）與AtSHMT6的同源性最高，約78%，這4個(gè)酶屬于同一SHMT亞家族分支，表明他們?cè)诠δ芎投ㄎ簧洗嬖谝欢ǖ南嗨菩?。水稻OsSHMT1與擬南芥AtSHMT1-3屬于同一SHMT亞家族，且這些酶均定位于質(zhì)體^[5-7]。水稻OsSHMT2-3和擬南芥AtSHMT4-5屬于同一SHMT亞家族，但其生物學(xué)功能尚不明確。

2.2 OsSHMT5蛋白亞細(xì)胞定位

為進(jìn)一步探究OsSHMT4（OsCADT1）與OsSHMT5的同源性，需要明確OsSHMT5蛋白的亞細(xì)胞定位。通過35S強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)C端融合增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（eGFP）的OsSHMT5在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，如圖2所示，葉肉細(xì)胞的細(xì)胞核中呈現(xiàn)明顯綠色熒光信號(hào)；空載對(duì)照35S：：eGFP在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，綠色熒光信號(hào)分散于整個(gè)細(xì)胞中。結(jié)果表明，水稻OsSHMT5蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.3 敲除OsSHMT5基因?qū)λ玖蛟睾臀胤e累的影響

利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除OsSHMT5基因第1個(gè)外顯子區(qū)域，通過測(cè)序鑒定到3個(gè)OsSHMT5缺失純合突變體（osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3）。如圖3所示，osshmt5-1突變體OsSHMT5基因第1個(gè)外顯子被插入2個(gè)單堿基A，osshmt5-2突變體OsSHMT5基因第1個(gè)外顯子被插入堿基A和T，均導(dǎo)致移碼突變。突變體osshmt5-3 OsSHMT5基因編碼區(qū)上游缺失39個(gè)堿基，下游缺失2個(gè)堿基。

如圖4所示，水培條件下21 d苗齡的水稻野生型（ZH11）和突變體osshmt5-1、osshmt5-2、osshmt5-3的表型沒有明顯差異。野生型、突變體osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3的地上部和地下部硫含量以及硒含量均無顯著差異（P＜0.05）。該試驗(yàn)結(jié)果表明，OsSHMT5突變對(duì)水稻硫含量和硒含量無顯著影響。如表1所示，野生型、突變體osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3的地上部和地下部錳、鋅、鎂、磷、鉀、鈣、鐵、銅和鈷含量均無顯著差異（P＜0.05）。

2.4 敲除OsSHMT5基因?qū)λ局懈餍螒B(tài)硒含量的影響

硒酸鹽為植物中無機(jī)硒的主要存在形態(tài)，亞硒酸鹽為硒酸鹽被還原的產(chǎn)物，硒代胱氨酸（SeCys2）和硒代甲硫氨酸（SeMet）是植物中有機(jī)硒的主要形態(tài)。如圖5所示，野生型、osshmt5-1、osshmt5-2和osshmt5-3的地下部和地上部的硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代胱氨酸、硒代甲硫氨酸含量均無顯著差異（Pgt;0.05），表明OsSHMT5基因突變對(duì)水稻中不同形態(tài)硒的含量均無影響。

2.5 敲除OsSHMT5基因?qū)λ玖蛩猁}/硒酸鹽吸收與同化途徑的影響

為探究敲除OsSHMT5基因突變?cè)谵D(zhuǎn)錄水平對(duì)水稻硫酸鹽/硒酸鹽吸收和同化的影響，利用RNA-Seq技術(shù)分析差異基因及其富集通路。選取突變類型差異大的突變體osshmt5-1和osshmt5-3作為研究對(duì)象。如圖6所示，與水稻野生型相比，突變體osshmt5-1地下部有1 227個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量上升，有208個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量下降，其地上部有322個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量上升，有1 183個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量下降;突變體osshmt5-3地下部有147個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量上升，有90個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量下降，其地上部有190個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量上升，有498個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量下降。對(duì)于地下部，2個(gè)突變體和野生型比較組中共同存在150個(gè)差異表達(dá)基因;對(duì)于地上部，2個(gè)突變體和野生型比較組中共同存在228個(gè)差異表達(dá)基因。

同一部位相同小寫字母表示不同基因型間差異無顯著（Pgt;0.05），以鮮重計(jì)。

如圖7所示，水稻突變體osshmt5的地下部和地上部硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsSULTR1、OsSULTR2、OsSULTR3和OsSULTR4亞家族基因的相對(duì)表達(dá)量和野生型相比均無顯著差異，參與硫酸鹽/硒酸鹽同化的OsATP、APK、OsAPRL、SiR、OsSERAT和OAS-TL基因相對(duì)表達(dá)量和野生型相比也無顯著差異?；赗NA-Seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，OsSHMT5主要在水稻地下部表達(dá)，而其同源基因OsSHMT4（OsCADT1）主要在地上部表達(dá)，OsSHMT1主要在地上部表達(dá)，OsSHMT2和OsSHMT3主要在地下部表達(dá)。但是，水稻突變體osshmt5的地下部和地上部5個(gè)OsSHMT基因的相對(duì)表達(dá)量與野生型相比均無顯著差異。

2.6 OsSHMT5基因敲除突變體和野生型差異表達(dá)基因KEGG/GO富集分析

分別對(duì)水稻野生型與突變體osshmt5-1、osshmt5-3地上部和地下部的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果如圖8所示，對(duì)于地上部，突變體osshmt5-1和野生型比較組中，差異表達(dá)基因顯著富集于谷胱甘肽代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;對(duì)于地下部，突變體osshmt5-1和野生型比較組中，差異表達(dá)基因顯著富集于光合生物中的碳固定途徑、乙醛酸和二羧酸代謝途徑、碳代謝途徑和不同環(huán)境中的微生物代謝途徑。對(duì)于地上部，突變體osshmt5-3和野生型比較組中不存在差異表達(dá)基因顯著富集的途徑;對(duì)于地下部，突變體osshmt5-3和野生型比較組中，差異表達(dá)基因顯著富集于脂肪酸延長(zhǎng)途徑、二萜類生物合成途徑、角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟生物合成途徑。

如圖9、表2所示，在GO富集分析和功能注釋中，對(duì)于地下部，突變體osshmt5-1和野生型比較組、突變體osshmt5-3和野生型比較組，差異表達(dá)基因主要具有四吡咯結(jié)合（GO：0046906）、血紅素結(jié)合（GO：0020037）、氧化還原酶活性（GO：0016705和GO：0016491）、電子轉(zhuǎn)移活性（GO：0009055）和鐵離子結(jié)合（GO：0005506）等分子功能;對(duì)于地上部，突變體osshmt5-1和野生型比較組、突變體osshmt5-3和野生型比較組，差異表達(dá)基因主要具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性（GO：0140110）、分子功能調(diào)節(jié)因子（GO：0098772）、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性（GO：0061135）、肽酶調(diào)節(jié)活性（GO：0061134）、序列特異性DNA結(jié)合（GO：0043565）、肽酶抑制劑活性（GO：0030414）、水解酶活性（GO：0016798）、轉(zhuǎn)移酶活性（GO：0016747）、脂質(zhì)結(jié)合（GO：0008289）、銅離子結(jié)合（GO：0005507）、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性（GO：0004867）、內(nèi)肽酶抑制劑活性（GO：0004866）、酶抑制劑活性（GO：0004857）、水解酶活性（GO：0004553）和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0003700）等分子功能。

3 討論

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶可參與植物體內(nèi)絲氨酸和甘氨酸的互相轉(zhuǎn)化，為甲基合成、核苷酸合成和氨基酸代謝等提供一碳單位^[6]。在本研究中，基于氨基酸序列比對(duì)挖掘到已報(bào)道的OsSHMT4（OsCADT1）的高度同源蛋白酶OsSHMT5。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，OsSHMT5蛋白定位于細(xì)胞核，該結(jié)果與其亞家族中水稻OsSHMT4（OsCADT1）和擬南芥AtSHMT7（MSA1）的定位結(jié)果一致^[12-13]。水稻OsSHMT1以及擬南芥AtSHMT1和AtSHMT2定位于線粒體，其基因體外表達(dá)產(chǎn)物已被驗(yàn)證具有絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）催化活性^{[5-6，29]}。將水稻的OsSHMT4（OsCADT1）、OsSHMT5和擬南芥的AtSHMT7（MSA1）基因在酵母甘氨酸缺陷型菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，無法使這些酵母菌株恢復(fù)正常的生長(zhǎng)表型^[13]。水稻OsSHMT2和OsSHMT3分別定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體^[10]。在體外表達(dá)試驗(yàn)中，未檢測(cè)到OsSHMT3、OsSHMT4（OsCADT1）和OsSHMT5具有SHMT活性，但酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明，OsSHMT4（OsCADT1）可與OsSHMT3或OsSHMT5互作^[14]。水稻中的5個(gè)OsSHMT都可形成同源二聚體，且OsSHMT3也可與OsSHMT2、OsSHMT4和OsSHMT5結(jié)合成異源二聚體^[10]。OsSHMT3敲除突變體中，SHMT活性下降35%，而OsSHMT4（OsCADT1）敲除突變體flo20-1中，SHMT活性下降64%，這表明OsSHMT4（OsCADT1）在調(diào)控SHMT活性方面可能比OsSHMT3發(fā)揮更重要的作用^[14]。

基于前期研究發(fā)現(xiàn)OsSHMT4（OsCADT1）突變可增強(qiáng)水稻籽粒中硫和硒的含量，本研究將OsSHMT4（OsCADT1）的同源基因OsSHMT5作為目的基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除中花11的OsSHMT5基因，得到3種不同突變類型的純合突變體 osshmt5-1、osshmt5-2、osshmt5-3。水培條件下，這3種突變體與野生型的生長(zhǎng)表型無顯著差異。外源添加低濃度硒酸鈉，突變體osshmt5地下部和地上部中硫含量和硒含量與野生型相比無顯著差異（P＜0.05），且硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代胱氨酸和硒代甲硫氨酸與野生型相比也無顯著差異（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)錄水平，突變體osshmt5水稻硫酸鹽/硒酸鹽的吸收和同化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量和野生型相比無顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果說明，同源基因OsSHMT5與OsSHMT4（OsCADT1）在調(diào)控水稻硫和硒積累方面存在差異，這可能是由于OsSHMT5不參與調(diào)控水稻硫和硒的積累，或者是由于OsSHMT4（OsCADT1）功能遠(yuǎn)強(qiáng)于OsSHMT5，導(dǎo)致在OsSHMT4（OsCADT1）功能正常的情況下，OsSHMT5突變不影響水稻硫和硒的積累。本研究還嘗試分別在水稻突變體cadt1（中嘉早17背景）中單敲除OsSHMT5基因及中花11背景下同時(shí)敲除OsSHMT4（OsCADT1）和OsSHMT5基因，但均未能獲得純合雙基因突變植株，表明這兩個(gè)基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。已有研究結(jié)果表明，OsSHMT4（OsCADT1）或AtSHMT7（MAS1）的功能缺陷會(huì)影響S-腺苷甲硫氨酸含量，S-腺苷甲硫氨酸是甲基化反應(yīng)的關(guān)鍵供體，其通過影響DNA或/和組蛋白的甲基化過程，從表觀遺傳學(xué)角度調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)^[12-14]。OsSHMT4（OsCADT1）功能缺陷會(huì)導(dǎo)致水稻OsSULTR1;1的表達(dá)量上升；AtSHMT7（MSA1）功能缺陷會(huì)導(dǎo)致擬南芥AtSULTR1;2的表達(dá)量上升，從而促進(jìn)根部對(duì)硫酸鹽/硒酸鹽的吸收。此外，OsSHMT4（OsCADT1）還可以與S-腺苷甲硫氨酸合成酶（OsSAMS2）互作，進(jìn)一步調(diào)控S-腺苷甲硫氨酸的合成和代謝^[14]。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，OsSHMT2、OsSHMT3和OsSHMT5基因主要在地下部表達(dá)，OsSHMT1基因主要在地上部表達(dá)，而OsSHMT4基因在地下部和地上部的相對(duì)表達(dá)量相近。轉(zhuǎn)錄因子B3、BBR-BPC、MYB、MYB-related和TCP可能與OsSHMT5啟動(dòng)子區(qū)域互作，從而調(diào)控OsSHMT5基因的表達(dá)。同時(shí)細(xì)胞分裂素抑制OsSHMT5的表達(dá)，而生長(zhǎng)素和茉莉酸促進(jìn)OsSHMT5的表達(dá)，表明OsSHMT5可能參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控^[10]。對(duì)于地下部，突變體和野生型比較組中的差異表達(dá)基因主要具有氧化還原酶活性、電子轉(zhuǎn)移活性、鐵離子結(jié)合和四吡咯結(jié)合等分子功能，對(duì)于地上部，突變體和野生型比較組中的差異表達(dá)基因主要具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性、肽酶抑制劑活性、銅離子結(jié)合等分子功能。

4 結(jié)論

本研究對(duì)水稻絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因OsSHMT5進(jìn)行了分子克隆和功能解析，結(jié)果表明，（1）OsSHMT5與OsSHMT4（OsCADT1）同源性較高，且它們分別編輯的2種蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞核中，但OsSHMT5突變對(duì)水稻硫酸鹽/硒酸鹽吸收和同化途徑無顯著調(diào)控作用，其功能突變不影響水稻中硫和硒的積累。（2）基于轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)，在水稻地下部，OsSHMT5可能具有四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、電子轉(zhuǎn)移活性和鐵離子結(jié)合等分子功能;在地上部，OsSHMT5可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)活性、肽酶抑制劑活性、銅離子結(jié)合等分子功能。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）