超低溫保存技術在熱帶作物種質資源保存中的應用與展望

摘 要：熱帶地區(qū)植物資源種類豐富，有極大的種質資源安全保存需求。超低溫（液氮）凍存是植物種質資源長期保存的重要手段，雖需針對特定物種進行技術優(yōu)化，但在實際應用后最為節(jié)省空間，且只需定期補充液氮，極大降低了種質資源長期保存過程中的人力物力投入。經過半個多世紀的發(fā)展，植物超低溫保存技術現已在種子、莖尖、花粉等多種類型材料上實現冷凍后成活與再生。為系統(tǒng)總結并全面介紹超低溫保存技術在熱帶作物種質資源安全保存和農業(yè)科技發(fā)展中的應用，本綜述以休眠莖段和試管苗莖尖的超低溫保存為主線，回顧了植物超低溫保存的研究歷史與技術發(fā)展，側重介紹了超低溫保存技術在熱帶作物莖尖、種子（胚）、花粉、細胞懸浮系和愈傷組織中的研究進展；同時也對熱帶作物超低溫保存后遺傳穩(wěn)定性評價研究進行介紹，展望了超低溫保存在熱帶作物莖尖、頑拗性種子和胚性愈傷組織和細胞等材料長期保存中的重要作用。

關鍵詞：熱帶作物；超低溫保存；種質資源；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號：S432.1 文獻標志碼：A

植物種質資源保存是種質創(chuàng)制和作物育種工作的基礎，目前主要有棲息地原位保存、種質圃和種子庫保存、離體試管保存和離體超低溫保存等方式[1-3]。我國十分重視作物種質資源的安全保存工作，現已建立一系列的國家級自然保護區(qū)、植物園和種質資源圃（庫）以安全保存作物及其野生資源[3]。熱帶地區(qū)植物遺傳多樣性豐富，其多樣的種質資源經過人類數千年的馴化和傳播，形成眾多全球性的重要作物。2022 年全球產量最高的十大作物中有6 種（甘蔗、玉米、水稻、油棕、木薯和番茄）起源于熱帶地區(qū)[4]。這些作物的產業(yè)發(fā)展在保障全球糧食安全和助力消除貧困上具有極大的發(fā)展前景[5-6]。然而傳統(tǒng)的熱帶作物資源田間保存受到極端天氣和病蟲害的威脅；其野生資源也受到耕地開墾和土地開發(fā)等人為因素的影響，亟需加強重要熱帶作物資源的離體保存工作[1]。

種子凍存是最為簡單的作物離體資源保存方式[7]。然而多數熱帶作物種子不耐低溫和脫水干燥，無法干燥后直接凍存；甘蔗、香蕉和甘薯等重要熱帶作物資源主要依賴無性繁殖，難以獲得種子進行凍存[8]，因此，試管苗保存和超低溫保存是熱帶作物資源離體保存的2 種主要方式[8-9]。

超低溫保存技術可將種質資源凍存在液氮（?196 ℃）或液氮蒸汽（?196～?150 ℃）中，該溫度下細胞分裂和代謝等生命活動停滯，由此降低離體組織培養(yǎng)長期繼代導致的遺傳變異風險，是長期保存種質資源的理想方式[7-8， 10]。植物離體材料超低溫保存工作開展前需要建立和優(yōu)化超低溫冷凍再生體系，經過60 余年的發(fā)展，目前已在植物上實現種子（胚）、冬季休眠莖段、莖尖、花粉、懸浮細胞和胚性愈傷組織等材料的冷凍后再生[11]。超低溫保存體系主要依賴于植物組織培養(yǎng)，雖體系優(yōu)化耗費一定時間和人力物力，但體系建立后只需定期補充液氮，可大大降低后續(xù)人力物力投入，是國際公認最為經濟的種質資源長期保存方式[8]。

面對種質資源安全保存技術的實際需求，本研究將對植物超低溫保存技術的發(fā)展與應用進行綜述，并介紹該技術在重要熱帶作物種質資源安全保存的研究和實際應用，有利于促進超低溫保存技術更好地服務于熱帶作物種質資源安全保存和科研育種工作。

1 植物超低溫保存技術的歷史與發(fā)展

20 世紀中葉，溫帶木本作物冬季休眠枝條的液氮超低溫保存首次獲得成功[12]。隨后超低溫保存技術在試管苗莖尖上的發(fā)展極大地促進了植物無性繁殖材料的超低溫保存，也影響了其他類型植物材料的超低溫保存方式。

1.1 休眠莖段的超低溫保存

20 世紀50 年代末，超低溫保存首先在溫帶桑樹冬季休眠枝條上開展優(yōu)化[12]。該研究切取直徑0.8 cm、長度為2～15 cm 的休眠莖段，在程序降溫儀中以0.5 ℃/min 的速率降溫至?30 ℃后迅速投入液氮中進行保存。莖段超低溫保存結束后移入?30 ℃保持4 h，隨后轉入0 ℃環(huán)境進一步恢復[12]。該體系應用扦插技術對莖段恢復培養(yǎng)，并成功獲得柳樹（Salix sp.）和楊樹（Populus sp.）的超低溫保存再生植株[12]。該技術后續(xù)應用芽接等技術對超低溫保存后的休眠莖段進行恢復再生，并在蘋果、梨、樹莓等木本作物的超低溫保存中獲得成功[13]。美國農業(yè)部的作物種質資源保存中心應用超低溫保存技術保存超過2100 份的蘋果資源（Malus spp.），超過90%的基因型材料能夠達到40%的再生率[14]。然而該技術僅適用于溫帶耐寒作物的超低溫保存，且需要在休眠期取材，無法應用于熱帶作物的安全保存。

1.2 早期試管苗莖尖一步與兩步冷凍法

基于植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，20 世紀70年代后期有學者開始研究植物離體資源的超低溫保存，并在馬鈴薯（Solanum goniocalyx）試管苗莖尖上獲得植株再生[15]。該方法切取馬鈴薯帶2～4 片葉原基的試管苗莖尖，在含有1.0 mg/LBenzyladenien（BA）的培養(yǎng)基上穩(wěn)定培養(yǎng)3 d 后置于10%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液進行1 h 冷凍保護，隨后投入液氮進行冷凍保存。解凍時將莖尖快速轉入35 ℃的液體培養(yǎng)基中浸沒1 min，隨后轉入再生培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)，得到11%的莖尖再生率。早期的試管苗莖尖超低溫保存體系多用DMSO 進行冷凍保護，且多參照休眠莖段超低溫保存方法應用兩步法進行冷凍，在馬鈴薯[16]、草莓（Fragaria×ananassaDuch. cv. Redcoat）[17]和木薯（Manihot esculentaCrantz）[18]等作物上獲得冷凍后再生。然而兩步冷凍法需將莖尖緩慢降溫至-30～-20 ℃，會給非休眠狀態(tài)的莖尖組織帶來極大的低溫傷害，因此，在熱帶作物超低溫保存中的實際應用極其有限。

1.3 包埋干燥法

受20 世紀80 年代應用海藻酸鈣包埋植物組織制作人工種子的啟示[19]，FABRE 等[20]在馬鈴薯莖尖超低溫保存中先將浸有莖尖的3%海藻酸鈉溶液滴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液，生成包裹著莖尖的海藻酸鈣小球。隨后應用0.5 mol/L 蔗糖對包埋后的莖尖進行預培養(yǎng)，接著在無菌空氣流中干燥4 h 后將包埋有莖尖的小球轉入冷凍管中投入液氮進行凍存，由此建立包埋干燥法。在隨后的十多年間，此方法在蘋果、柑橘（Citrus spp.）、葡萄（Vitis spp.）和菊花（Chrysanthemum morifolium）等作物的莖尖、愈傷組織、體胚等材料上獲得成功[21]。該方法應用物理干燥的方式對材料進行冷凍保護，不適合對脫水干燥敏感的物種。包埋干燥法在熱帶作物如木薯[22]和咖啡（Coffeaspp.）[23]莖尖的超低溫保存中也有報道，但獲得較低再生率并表現很強的基因型差異性。

1.4 玻璃化法與包埋玻璃化法

1990 年，一種名為植物玻璃化溶液（plantvitrification solution， PVS）的冷凍保護劑首次應用于柑橘懸浮細胞的超低溫保存[24]。該溶液包含有甘油（30%，W/V）、乙二醇（15%，W/V）、二甲基亞砜（15%，W/V）和0.4 mol/L 的蔗糖，且冷凍和解凍過程中在?115 ℃附近表現明顯的玻璃態(tài)轉變[24]。應用該溶液作為冷凍保護劑可極大地減少冷凍和解凍中植物細胞內外的自由水結晶，降低冷凍傷害[24]。在莖尖超低溫保存中，PVS2溶液于1991 年首次應用于康乃馨（Diathus caryophyllusL.）的莖尖，該方法將莖尖使用海藻酸鈣包埋后進行PVS2 冷凍保護，被稱為包埋玻璃化法（encapsulation-vitrification）[25]。一年后，PVS2溶液成功應用于甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]非包埋莖尖的超低溫保存中并獲得64%的再生率，該方法被稱為玻璃化法（vitrification）[26]。

CHAROENSUB 等[27]在木薯上建立了較為成熟的玻璃化法莖尖超低溫保存體系。該體系在冷凍保護前首先將莖尖預培養(yǎng)在含有0.3 mol/L 蔗糖的固體培養(yǎng)基上16 h，隨后使用含2 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的加載液處理莖尖20 min。冷凍保護應用PVS2 溶液在常溫下進行45 min 的處理，該方法在木薯莖尖超低溫保存后獲得75%的再生率。CHAROENSUB 等[28]還建立了包埋玻璃化法木薯莖尖超低溫保存體系。包埋后的莖尖較直接處理相比，往往需要更長的預培養(yǎng)和冷凍保護時間，對于PVS2 耐受性差的莖尖，延緩PVS2的滲透速率有助于減輕冷凍保護時所受的滲透脅迫。

玻璃化法克服了許多物種不耐物理干燥的缺點，至今仍是種子、愈傷組織和胚性細胞懸浮系等材料超低溫保存的主要方法之一[10]。

1.5 小滴玻璃化法

由于玻璃化溶液在莖尖超低溫保存獲得巨大成功，加之應用鋁箔條為載體實現快速“冷凍—解凍”能夠獲得更高的莖尖冷凍后再生率，PANIS等[29]以鋁箔條為載體與PVS2 冷凍保護相結合，在香蕉（Musa spp.）上優(yōu)化建立了廣譜性更高的香蕉超低溫保存體系，并將其命名為小滴玻璃化法（droplet vitrification）。該方法應用1.0 mm 的香蕉試管苗莖尖為材料，經過30 min 含有2 mol/L甘油和0.4 mol/L 蔗糖的加載液預處理后，在冰上應用PVS2 進行30 min 冷凍保護，隨后將莖尖轉至鋁箔條上預先準備好的PVS2 小液滴中并快速投入液氮進行冷凍[29]。冷凍保存結束后將莖尖同鋁箔條一起快速裝入充分預冷的冷凍管后在液氮中進行長期保存[29]。解凍時在液氮表面擰開冷凍管后將帶有莖尖的鋁箔條快速轉入預先備好的1.2 mol/L 蔗糖卸載液中快速解凍，并短暫浸泡20 min 以稀釋莖尖中的PVS2 冷凍保護劑，之后將莖尖轉至恢復培養(yǎng)基上再生培養(yǎng)[29]。小滴玻璃化法可基于已有的玻璃化和包埋玻璃化體系進行快速優(yōu)化，操作簡便，現已廣泛應用于馬鈴薯、大蒜（Allium sativum）、蘋果等試管苗莖尖的超低溫保存[30]，在熱帶作物木薯、甘蔗（Saccharumspp.）、菠蘿（Ananas comosus）等作物也有研究和應用[31-32]。

1.6 鋁盤玻璃化法/干燥法

為提高莖尖冷凍保護過程的簡便性，降低冷凍保護操作中對莖尖造成的機械損傷，HIRAI[33]將莖尖應用海藻酸鈣包埋的技術粘附在鋁箔條上，隨后進行冷凍保護的各項操作，該方法被命名為gelled droplet-vitrification。該研究團隊隨后定制有凹槽的鋁片，以方便莖尖更好地粘附在鋁盤上。莖尖粘附后可參照小滴玻璃化和包埋玻璃化法的體系進行冷凍保護，并由此建立鋁盤玻璃化法（vitrification Cryo-plate，V Cryo-plate）[34]；也可冷凍保護時采用空氣流干燥的方式，由此建立了鋁盤干燥法（dehydration Cryo-plate，D Cryoplate）[35]。2 種方法都能實現快速冷凍和解凍操作，并在馬鈴薯上獲得80%～100%的超低溫保存再生率[36]。熱帶作物莖尖超低溫保存主要應用VCryo-plate 的方式進行。VIANNA 等[37]應用鋁盤玻璃化法建立了細柱西番蓮（Passiflora suberosa）的莖尖超低溫保存體系：該方法從萌發(fā)40 d 腋芽上切取莖尖，經過0.3 mol/L 蔗糖預培養(yǎng)對莖尖進行粘附。莖尖先轉入添加有3%海藻酸鈉溶液的凹槽中，隨后在凹槽中滴入0.1 mol/L 的氯化鈣溶液與海藻酸鈉發(fā)生反應，由此完成粘附并進行后續(xù)的冷凍保護操作[37]。經過優(yōu)化，該研究在PVS3溶液常溫下冷凍保護45～90 min 后獲得最高再生率（50%～60%）[37]。

鋁盤玻璃化法可基于小滴玻璃化法進行建立，且能獲得更加一致的再生率[38]。包埋干燥和應用玻璃化溶液進行冷凍保護和莖尖超低溫保存的主要流程見圖1。

2 重要熱帶作物莖尖超低溫保存研究進展

植物莖尖是植物生長與發(fā)育的重要器官，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，保存有特定的植物性狀，是植物開展超低溫保存的重要材料來源，尤其適用于以無性繁殖為主作物的超低溫保存。莖尖超低溫保存依賴成熟的莖尖離體培養(yǎng)和再生體系，目前已在香蕉、木薯、菠蘿、甘蔗等重要熱帶作物上獲得成功應用。

2.1 香蕉

香蕉是目前開展超低溫保存最為成功的熱帶作物。早期香蕉莖尖的冷凍保護主要在高濃度蔗糖預培養(yǎng)后通過空氣流干燥進行[39]。隨后有研究者將此方法與PVS2 冷凍保護做對比，結果表明結合PVS2 冷凍保護與快速冷凍/解凍的操作步驟獲得最高的再生率[40]。該方法隨后經過優(yōu)化并命名為小滴玻璃化法[29]，并在香蕉種質資源的實際保存中獲得極大成功[41]。國際香蕉交換中心（International Musa Transit Center）應用小滴玻璃化法開展香蕉莖尖超低溫保存工作近20 年，截至2020 年已成功保存1100 份香蕉資源[8]。

2.2 木薯

木薯是開展莖尖超低溫保存研究最早的作物之一，早期先后試驗了DMSO 兩步冷凍法[18]和包埋干燥法[22]，在部分木薯基因型上獲得冷凍后再生。隨著玻璃化溶液在香蕉莖尖超低溫保存上的成功應用，DUMET 等[42]參照香蕉小滴玻璃化體系，應用PVS2 冰上處理30 min 對木薯試管苗莖尖進行“快速冷凍—超低溫保存—快速解凍”試驗，獲得38%～48%再生率，高于包埋干燥法7%～14%的再生率。國際熱帶農業(yè)研究中心CIAT隨后應用小滴玻璃化法對100 份經包埋干燥法冷凍再生率低于30%的基因型進行超低溫保存，超過70 個木薯基因型材料獲得高于30%的再生率[43]。上述研究表明小滴玻璃化法在木薯莖尖超低溫保存上有極大的應用潛力。然而上述方法借鑒香蕉莖尖超低溫保存技術，并未針對木薯進行優(yōu)化，在木薯上還有極大的提升潛力。

2.3 菠蘿

莖尖超低溫保存對菠蘿的特異種質保存具有重要的意義。GONZáLEZ-ARNAO 等[44]于20 世紀90 年代末對比了包埋干燥法與PVS2 玻璃化法對菠蘿莖尖的保存效果，結果表明只有玻璃化法能夠獲得穩(wěn)定的莖尖再生。隨后冷凍保護液PVS3也成功應用于菠蘿莖尖的超低溫保存[45]，且應用PVS3 建立的包埋玻璃化法在菠蘿上獲得更高的超低溫保存再生率[46]。應用最新的小滴玻璃化超低溫保存方法，SOUZA 等[31]應用0.5～1 mm 的菠蘿莖尖為外植體，在共計16 個菠蘿栽培和野生種中得到90%的平均再生率，表明小滴玻璃化法在菠蘿莖尖超低溫保存中具有廣譜性，可以應用于菠蘿種質資源的實際保存[31]。

2.4 甘蔗

20 世紀90 年代初，在法國、意大利和古巴等國家科研人員的合作下，應用包埋干燥法的甘蔗莖尖在超低溫保存中獲得成功再生[47-48]。該體系應用3%的海藻酸鈉包埋莖尖，在5 個基因型上獲得38%～91%的再生率[47-48]。參照香蕉小滴玻璃化法的流程，BARRACO 等[49]在2 份甘蔗資源上對PVS2 和PVS3 的冷凍保護時間進行優(yōu)化后獲得20%～37%的再生率，低于包埋干燥法的53%～60%。為了提高小滴玻璃化法甘蔗莖尖超低溫保存后的再生率，VOLK 等[50]在冷凍保護中添加谷胱甘肽、抗壞血酸等物質，但沒有進一步提升再生率。KAYA 等[51]在甘蔗莖尖超低溫保存上對比了包埋玻璃化法與小滴玻璃化法，結果表明小滴玻璃化法能夠獲得更高的再生率。VOLK 等[50]還應用包埋干燥法[49]和鋁盤玻璃化法對甘蔗莖尖進行超低溫保存試驗，獲得0～50%的再生率。上述研究表明現有的甘蔗莖尖超低溫保存體系存在明顯的基因型差異性，除繼續(xù)對冷凍保護步驟進行優(yōu)化外，還需加強在蔗糖預培養(yǎng)、加載等步驟的優(yōu)化工作。

2.5 其他熱帶作物

甘薯主要依賴無性繁殖，也是開展莖尖超低溫保存研究最早的作物之一。最新的甘薯莖尖超低溫保存主要應用小滴玻璃化法[52]：國際馬鈴薯中心的研究團隊在2014 年首次報道了甘薯小滴玻璃化法超低溫保存體系的構建與優(yōu)化，該體系應用30～45 min PVS2 冰上冷凍保護，在24 份甘薯資源中獲得1.7%～66%的再生率[53]。WILMS 等[54]應用甘薯誘導的腋芽進行體系優(yōu)化，莖尖在短暫加載液（2 mol/L 甘油+0.4 mol/L蔗糖）處理后，進行PVS2 冷凍保護，在10 個甘薯基因型上獲得10%～84%的再生率，其中7 份資源的冷凍后再生率達到40%以上[54]。小滴玻璃化法由于其操作更為簡便，是熱帶作物莖尖超低溫保存應用最多的技術手段，已在山藥、芋頭等根莖類作物[52]，牛大力（Millettia speciosa Champ.）[55]、巴戟天（Morinda officinalis How.）[56]等熱帶藥用和瀕危物種， 蘭花（ Orchidaceae ） [57] 、巢蕨（Neottopteris nidus）[58]和紅掌（Anthurium andraeanumLind.）[59-60]等熱帶花卉資源，油梨等熱帶木本作物[61]上獲得成功。小滴玻璃化法和鋁盤玻璃化法在重要熱帶作物莖尖超低溫保存中的主要步驟詳見表1。

3 熱帶作物種子超低溫保存研究進展

3.1 種子

種子是植物種質資源保存主要的材料來源之一[64]，根據種子的貯藏行為可分為3 類：（1）正常型種子，可干燥至含水量低于7%，并能在?10 ℃下長期保存[65]；（2）頑拗型種子，不耐干燥且對低溫非常敏感，無法直接干燥后冷凍保存[66]；（3）中間型種子，可以干燥至含水量為6%～12%，但與正常型種子相比，其活力喪失相對較快[67]。據估計，全世界8%的開花植物的種子為頑拗型種子，但在熱帶地區(qū)，這一比例高達50%[65， 68]。液氮超低溫保存可以延長傳統(tǒng)型種子的凍存期限，也是目前頑拗性種子長期保存唯一可行的技術手段[69]。種子冷凍保存后的存活率與含水量密切相關，因而需在冷凍保存前確定種子的最佳含水量[70]。

咖啡是種子超低溫保存研究較多的熱帶作物，BECWAR 等[71]研究表明咖啡（Coffea arabica）種子能夠耐受8%的水分含量，但直接液氮凍存后無法萌發(fā)[71]。該研究還表明緩慢冷卻能夠提高咖啡種子超低溫保存后的萌發(fā)率。DUSSERT 等[70]隨后在9 份咖啡資源上開展種子保存試驗，同樣發(fā)現咖啡C. arabica 緩慢冷卻比快速冷卻獲得更高的再生率，而C. racemosa 等3 個咖啡種應用2種冷凍方式均能獲得較高再生率（67%～81%）。該研究還發(fā)現咖啡種子中的結合水含量與脂質含量呈負相關，脂質含量較高的種子更容易在冷凍中受到傷害。針對咖啡C. arabica 保存需緩慢冷卻帶來的操作不便，COELHO 等[72]優(yōu)化了該種咖啡種子快速冷凍保存體系，使該種子緩慢干燥至20%含水量后可直接投入液氮保存。

為對空氣鳳梨資源（Tillandsia spp.）開展長期保存，OLIVEIRA 等[73]將20 種空氣鳳梨種子放入冷凍管中，并于活性硅膠上干燥至7%的種子含水量后快速浸入液氮進行450 d 的冷凍保存，13種空氣鳳梨的種子獲得80%的再生率。多數蘭科植物的種子能夠忍受一定程度的脫水干燥[74]，PRITCHARD[75]將蘭花7 個屬的成熟種子干燥至5%～11%后直接投入液氮冷凍處理，解凍后種子萌發(fā)率沒有下降，其中Anacamptis morio（藍紫倒距蘭）的種子超低溫保存后獲得更高的萌發(fā)率[74-78]。此外包埋干燥與玻璃化等莖尖超低溫保存技術也應用于蘭科種子的超低溫保存，為無法直接干燥的蘭科種子提供了新的冷凍保護方法[79-80]。HU等[81]將臺灣本地蘭（Bletilla formosana）的種子應用玻璃化法于PVS2 中脫水處理30 min，經超低溫保存后獲得91%的萌發(fā)率，且保存1 a 的種子萌發(fā)率維持不變。

3.2 種胚

種胚承載種子的遺傳信息，體積小，與其他材料相比耐脫水和耐低溫能力強，是影響種子成功保存的關鍵[82-84]。一些熱帶作物的種子體積過大或者種皮過厚，無法對種子內的種胚進行有效干燥，因而需在凍存前將種胚取出，對其干燥后冷凍保存。

椰子種子體積過大，為了長期保存其種質資源，SISUNANDAR 等[85]將其種胚取出，直接干燥后進行液氮凍存。該研究表明種胚8 h 快速干燥后經快速冷凍—解凍處理獲得最高的萌發(fā)率，此外新鮮種胚的冷凍后萌發(fā)率（40%）也高于與經過12 d 運輸的離體種胚（20%）?；诖烁稍锓椒?，SISUNANDAR 等[86]對不同成熟度的椰子種胚進行超低溫保存試驗，結果表明11 月齡的種胚冷凍后再生率最高（60%），但椰子采摘后需在3周內分離種胚。在咖啡和菠蘿蜜的冷凍保存中，與未成熟或完全成熟的種胚相比，成熟中期收獲的種胚更適合超低溫保存[87-88]。棕櫚科植物的種胚對直接干燥耐受性較強，相似的種胚超低溫保存技術也實現了油棕（Elaeis guineensis）和布迪椰屬（Butia capitata）種胚的長期保存[89-90]。

芭蕉屬植物種皮較為堅硬，為更有效地干燥脫水，ESQUIVEL 等[91]將2 種不同基因型的野蕉種胚在超凈工作臺中干燥后浸入液氮進行保存，解凍后得到最低80%的萌發(fā)率。SINGH 等[92]研究了野蕉（Musa balbisiana）種子的冷凍保存特性，結果表明種胚可以在超低溫保存前干燥脫水至5%～10%的相對含水量，該研究還發(fā)現種胚離體培養(yǎng)是野蕉種子冷凍后萌發(fā)的必須手段。

對于種胚無法直接干燥的頑拗型種子，參照莖尖冷凍保護方式對種胚進行脫水干燥能夠提高種胚超低溫保存后的成活與萌發(fā)率。在咖啡種胚超低溫保存研究中，VALDéS 等[93]應用PVS3 玻璃化冷凍保護液對咖啡（Coffea arabica）種胚脫水干燥后進行冷凍，獲得了100%的種胚萌發(fā)率。為對鱗花木屬（Lepisanthes fruticosa）植物種子實現長期保存，BUSTAM 等[94]應用PVS2 冷凍保護液優(yōu)化建立了玻璃化法種胚超低溫保存體系，獲得67%的萌發(fā)率。超低溫保存技術在重要熱帶作物種子（胚）保存中的研究成果見表2。

4 熱帶作物花粉、懸浮細胞與愈傷組織超低溫保存研究進展

4.1 花粉

花粉是單細胞雄配子體，包含了物種單倍體基因組的所有信息，使其成為種質資源保存和交換的重要材料[101]。花粉保存不僅有效地克服了親本在不同時間和不同地理位置雜交的障礙，也是保護植物遺傳多樣性的有效手段。在各種花粉冷凍保存方法中，含水量高低是影響保存成功的關鍵要素，且超低溫保存能夠極長地延長花粉保存時間[102]。

在熱帶作物花粉保存中，KARUN 等[103]將椰子2 個品種的花粉干燥至含水量7.5%后，用鋁箔進行包裹直接浸入液氮中，解凍后獲得26%～32%花粉萌發(fā)率；長期保存試驗表明花粉活力連續(xù)3 a保持25%以上，由此驗證了椰子花粉超低溫長期保存的可行性。在重要熱帶油料作物油棕上，TANDON等[104]將新鮮開放的雄花序花粉干燥1 h至含水量23.3%后投入液氮進行超低溫保存，保存8 a 后解凍獲得54%的花粉萌發(fā)率，與對照相比沒有顯著變化?；ǚ鄢蜏乇４娴某晒κ艿交ㄆ诤突ǚ鄣某墒於鹊挠绊?。ANILKUMAR 等[105]發(fā)現在火龍果花朵完全開放時采集的新鮮花粉超低溫保存后萌發(fā)率最高，達到71.26%，而在開花前2 h 和開花后10 h 采集的花粉冷凍后無法萌發(fā)。CHAUDHURY 等[106]于晴天上午8：00—10：00間的花藥開裂時收集芒果與荔枝花粉并用環(huán)己烷對花粉在運輸過程中進行短暫保存，超低溫保存前將保存液濾除后進行干燥，隨后投入液氮超低溫保存。該方法現已應用于180 份芒果資源花粉與19 份荔枝資源花粉的長期保存，且超低溫保存4 a 后的花粉未發(fā)現活力下降[106]。VEENA 等[107]發(fā)現芒果花粉存活力短、對干燥敏感性高的特點，可考慮到基因型、季節(jié)和區(qū)域的差異，適當延長干燥時間。超低溫保存技術在重要熱帶作物花粉保存中的研究成果詳見表3。

4.2 懸浮細胞

植物懸浮細胞是一種能夠持續(xù)增殖、保持均一分散的細胞團，由多個未分化的單細胞組成，是遺傳轉化的良好受體[113-114]。細胞懸浮系的建立花費大量時間，且需不斷地繼代以保持細胞活力，對胚性懸浮細胞開展超低溫保存，能夠降低其在長期繼代培養(yǎng)過程中導致胚性特征喪失以及發(fā)生遺傳變異的風險[115-116]。懸浮細胞冷凍保存前主要應用冷凍保護液對細胞脫水干燥[117-118]。早期的冷凍保護液種類較多，在甘蔗細胞懸浮系的低溫保存中FINKLE 等[117]發(fā)現含有8%葡萄糖、10%DMSO 與10% PEG（均為w/V）的冷凍保護液能使懸浮細胞忍受冷凍保存。GNANAPRAGASAM等[118]在甘蔗懸浮細胞超低溫保存研究中發(fā)現細胞經0.33 mol/L 山梨醇預培養(yǎng)3 d 后，應用添加0.5 mol/L 甘油、0.5 mol/L 山梨醇和1.0 mol/L 蔗糖的冷凍保護劑能夠獲得最高的冷凍后成活率。在香蕉懸浮系的超低溫保存研究中，PANIS 等[119]采用甘油和DMSO 混合液進行低溫保護，結果顯示DMSO 占5%時效果最好。在此基礎上GEORGET等[120]對香蕉懸浮系超低溫保存的預培養(yǎng)步驟進行優(yōu)化，最終在冷凍保護前采用三步蔗糖預培養(yǎng)。上述香蕉懸浮系的超低溫保存均采用兩步冷凍法進行冷凍[119-120]。

目前在植物上冷凍保護應用最廣的PVS2 玻璃化溶液同樣適用于熱帶作物懸浮系超低溫保存。李艷娜等[121]應用兩步梯度PVS2 冷凍保護對巴西蕉、北大矮蕉和粵優(yōu)抗1 號的香蕉懸浮細胞進行超低溫保存，獲得較高的再生率。謝玉明等[122]在荔枝上建立了玻璃化法胚性懸浮細胞超低溫保存體系，該體系采用山梨醇預培養(yǎng)結合兩步PVS2冷凍保護，獲得27.1%的超低溫保存成活率。為了對油棕細胞懸浮系進行超低溫保存，WEI 等[89]應用蔗糖預培養(yǎng)結合PVS2 冷凍保護的方式進行超低溫保存，獲得68.33%成活率。李運合等[123]應用30 min PVS3 玻璃化溶液冷凍保護對芒果胚性培養(yǎng)物細胞和愈傷組織細胞進行超低溫保存，存活率分別為94.7%和0，表明胚性培養(yǎng)物細胞較普通愈傷組織相比具有更強的耐脫水和冷凍能力。

4.3 愈傷組織

愈傷組織由薄壁細胞組成，一般被分為非胚性愈傷和胚性愈傷[124]。胚性愈傷組織可能會因長期繼代而造成體細胞變異，或致使體胚潛力下降甚至徹底喪失[125]。超低溫保存可以有效遏制愈傷組織變異的發(fā)生，降低長期保存帶來再生能力喪失的風險。早在1979 年，ULRICH 等[126]已對甘蔗愈傷組織超低溫保存開展研究，發(fā)現復合冷凍保護劑（8%葡萄糖+10% DMSO+10% PEG）能夠獲得較好的冷凍保護作用。簡令成等[127]將上述冷凍保護劑與0.5 mol/L 山梨糖醇+10% DMSO 溶液在甘蔗愈傷組織超低溫保存中進行對比，發(fā)現后者冷凍保護效果更好，這可能與試驗材料基因型的不同有關。MARTíNEZ-MONTERO 等[128]還應用0.3～0.75 mol/L 蔗糖+10% DMSO為冷凍保護劑成功保存了3 個甘蔗雜交種的胚性愈傷組織。MARTíNEZ-MONTERO 等[129]隨后對甘蔗胚性愈傷組織誘導的體胚團進行超低溫保存試驗，并應用小滴玻璃化法獲得了55%的成活率。除甘蔗之外，應用PVS2 玻璃化溶液還建立了橡膠[130]、龍眼[131-132]、荔枝[133]等熱帶作物愈傷組織的超低溫保存體系（表4）。

5 遺傳穩(wěn)定性檢測與農藝性狀對比

莖尖與體胚等無性繁殖材料攜帶原始母株的遺傳信息，超低溫保存可降低上述材料長期繼代培養(yǎng)帶來的遺傳變異風險，但保存操作中的脫水干燥和冷凍解凍分別給細胞帶來滲透脅迫和冷凍傷害，給DNA 帶來損傷，對再生植株的遺傳穩(wěn)定性造成不利影響[134]。因而對超低溫保存后的再生植株開展遺傳穩(wěn)定性檢測十分必要。

由于莖尖的遺傳穩(wěn)定性強，目前絕大多數經過優(yōu)化的莖尖超低溫保存體系能夠維持凍存資源的遺傳穩(wěn)定性[30， 135]。AGRAWAL 等[136]對超低溫保存后的香蕉Sommarani Monthan（AAB 基因型）開展農藝性狀評價和遺傳穩(wěn)定性檢測，研究表明除1 棵再生植株果皮顏色更綠外，其余植株與對照相比表現相同的生長和產量特性；同時應用SSR 分子標記進行遺傳穩(wěn)定性檢測并未發(fā)現多態(tài)性位點。AGRAWAL 等[137]隨后還對香蕉田間吸芽、試管苗單芽和叢芽超低溫保存后的再生植株應用SSR 分子標記進行遺傳穩(wěn)定性檢測，并未發(fā)現超低溫保存過程帶來的變異率增加。在菠蘿和三角葉薯蕷（Dioscorea deltoidea）上應用分子標記技術進行遺傳穩(wěn)定性檢測同樣表明玻璃化法超低溫保存體系能夠保持資源的遺傳穩(wěn)定性[63， 138]。然而在甘蔗中的研究表明莖尖超低溫保存獲得的再生植株遺傳穩(wěn)定性存在基因型差異，其中基因型NG 57-024 超低溫冷凍后表現98.5%的基因一致性，且變異差異發(fā)生在PVS2 冷凍保護之后，而其余兩份甘蔗基因型Halaii 與H83-6179 中未檢測到DNA 多態(tài)性[51]。

胚性愈傷組織的誘導經歷脫分化過程，該過程可能給組織帶來更高的遺傳變異風險[139]，因而更需關注其超低溫保存后的遺傳穩(wěn)定性。GANTAIT等[140]對油棕胚性懸浮系誘導獲得的多胚體超低溫保存后，應用RAPD 和ISSR 分子標記進行遺傳穩(wěn)定性測定，未發(fā)現多態(tài)性條帶。WELEWANNI等[141]對椰子花序誘導所得的胚性愈傷組織在超低溫保存前后進行遺傳穩(wěn)定性評估，該研究對11個SSR 分子標記的位點進行檢測，同樣未發(fā)現變異位點。SISUNANDAR 等[142]還對4 個椰子品種的合子胚進行超低溫保存，并對保存后得到的再生植株與保存前后的材料進行對比，未發(fā)現在形態(tài)學和染色體數上的變異；應用SSR 分子標記和基因組甲基化水平檢測同樣未發(fā)現保存前后的明顯差異。

然而超低溫保存過程中脅迫處理會給組織帶來表觀遺傳水平的變化，且變化具有一定的可逆性[135]，可能會對再生植株性狀產生影響[143]，但在熱帶作物的研究上十分缺乏。ADU-GYAMFI 等[144]在可可（Theobroma cacao L.）上的研究發(fā)現其體胚經超低溫保存后得到的再生植株形態(tài)發(fā)生變化，且該變化與表觀遺傳水平的變化有關，但其變化部分可逆。綜上所述，雖然超低溫保存不會明顯提高保存材料的遺傳變異水平，但其帶來的表觀遺傳變化值得深入研究。

6 展望

隨著國家對植物種質資源安全保存的重視和種業(yè)振興工作的開展，植物野生資源、作物育種中間材料和優(yōu)良商業(yè)品種的安全保存變得尤為重要。許多發(fā)達國家的農業(yè)科研單位和重要國際農業(yè)組織已經開展植物資源的超低溫保存工作，以減少種質資源長期保存的人力物力投入。熱帶作物與溫帶作物相比耐冷性和干燥耐受性較差，超低溫保存體系建立的難度更大。

莖尖由于遺傳穩(wěn)定性高，取材較為方便，是香蕉、甘蔗、木薯等以無性繁殖為主的熱帶作物開展超低溫保存的重要材料來源。目前最有效的莖尖超低溫保存技術應用PVS2 等冷凍保護液進行脫水干燥，并結合小滴玻璃化、鋁盤玻璃化法等快速冷凍—解凍手段冷凍保存。莖尖超低溫保存體系依賴成熟的莖尖和莖段組織培養(yǎng)再生技術（圖2），雖然在香蕉和菠蘿等作物上獲得成功，但在甘蔗、木薯等重要熱帶作物上還需優(yōu)化。此外咖啡、可可和芒果等熱帶木本作物超低溫保存工作的開展還需克服組織離體再生困難帶來的挑戰(zhàn)。

超低溫保存是熱帶植物頑拗型種子實現長期保存的唯一手段，為更有效地對種子進行冷凍保護，往往需將種胚取出進行干燥后和超低溫保存。許多熱帶作物的種胚能夠耐受直接空氣干燥后超低溫保存。當種胚無法直接干燥時，可參照莖尖應用玻璃化溶液進行冷凍保護。目前種胚超低溫保存技術已在咖啡、野蕉和棕櫚科等植物上建立，在橡膠、可可等重要熱帶木本作物長期安全保存和育種上還有更廣闊的研究應用前景。種胚超低溫保存同樣依賴種胚離體培養(yǎng)技術，以促進種胚解凍后的萌發(fā)生長。

超低溫保存還可應用于熱帶作物花粉、胚性懸浮系、愈傷組織等高價值組織細胞的長期保存。熱帶作物花粉可直接干燥后超低溫保存，操作較為簡單；而胚性愈傷組織、懸浮系和普通愈傷的超低溫保存依賴冷凍保護溶液進行脫水干燥（圖2）。胚性愈傷組織和懸浮系的超低溫保存技術已在香蕉、甘蔗、荔枝等熱帶作物上成功建立，可降低上述材料長期繼代導致的變異和活力下降問題，在其他重要熱帶作物上也有極高的研究價值。

綜上所述，超低溫保存技術雖然需要根據不同材料類型選用不同的方案進行優(yōu)化，但體系建立后是最有效的種質資源長期保存手段。熱帶地區(qū)作為全球生物多樣性水平最高的區(qū)域，有更多植物種質安全保存的實際需求。超低溫保存體系在熱帶作物上的研究和應用能更好地支持熱帶作物品種、野生瀕危資源和高價值組織細胞長期安全保存，支撐熱帶農業(yè)產業(yè)和科技的可持續(xù)發(fā)展。

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